BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM
VÀ HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH
TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG
DUNG DỊCH KHOÁNG Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
GS.TS Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư - 3102695
Lớp: Cử nhân Sinh học K36 C
ần Th
ơ, 12/2013

Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận
được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp, người thầy kính mến đã hết lòng dạy bảo, định
hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận văn tốt nghiệp.
Ths. Văn Thị Phương Như là người luôn góp ý và sửa chữa những sai sót
giúp tôi hoàn thiện bản thân.
Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - Cán bộ phòng thí nghiệm và toàn thể các anh
chị và các bạn phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Viện nghiên cứu và phát triển
Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên
cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô công tác tại khoa Khoa học tự nhiên đã hết
lòng dạy dỗ và xây dựng nền tảng kiến thức vững chắc trong suốt gần 4 năm
tôi học tập tại trường Đại học Cần Thơ.
Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập Quách Quang Huy, Phạm Khánh Nguyên
Huân và tập thể lớp cử nhân Sinh học Khóa 36 - những người bạn đường trên
hành trình đi tìm tri thức - đã gắn bó, động viên và giúp đỡ tôi suốt 4 năm đại
học cũng như trong quá trình tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Con xin chân thành cảm ơn gia đình đã nuôi dưỡng, bên cạnh động viên
và giúp đỡ trong những lúc con gặp khó khăn.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho
tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT i
LỜI CẢM ƠN ii
TÓM LƯỢC iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vii
TỪ VIẾT TẮT viii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Tổng quan về cây lúa 2
2.1.1. Vị trí phân loại 2
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý 3
2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng 6
2.1.5. Sơ lược về giống lúa ML213 7
2.2. Tầm quan trọng của nguyên tố N, P 8
2.2.1. Đạm (N) 8
2.2.2. Lân (P) 9
2.2.3. Thực trạng sử dụng phân hóa học ở nước ta hiện nay 10
2.3. Vi khuẩn nội sinh 11
2.3.1. Nguồn gốc 11
2.3.2. Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật 11
2.3.3. Khái quát về sự cố định nitơ sinh học bởi vi sinh vật 12
2.3.4. Khái quát về sự hòa tan lân khó tan bởi vi sinh vật 14
2.3.5. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa 16
2.3.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh hiện nay 20
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 23
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

Bảng 1. Nhu cầu phân bón hóa học sản xuất cho nền nông nghiệp Việt Nam từ
năm 2000-2010 10
Bảng 2. Tên khoa học của 10 dòng vi khuẩn 23
Bảng 3. Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof và ctv, 1997) 27
Bảng 4. Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976) 28
Bảng 5. Các nghiệm thức đạm 30
Bảng 6. Các nghiệm thức lân 31
Bảng 7. Chiều cao cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7 ngày, 14
ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm) 33
Bảng 8. Chiều dài rễ của cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7
ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm) 36
Bảng 9. Trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô toàn cây của cây lúa trồng
trong dung dịch khoáng giai đoạn 28 ngày (g) 39 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36

vii
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Oryza sativa L 2
Hình 2. Hình thái và cấu tạo một hoa lúa 4
Hình 3. Cấu tạo của một hạt lúa 6
Hình 4. Cấu trúc bậc 4 của enzyme nitrogenase 13
Hình 5. Quá trình tạo NH
3
từ N
2
thông qua H
2
N=NH

1
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế
giới với hơn một nửa dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực
chính, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Tuy nhiên, diện tích
canh tác lúa ngày càng bị thu hẹp. Năm 2008, sản lượng lúa gạo thế giới đạt 685
triệu tấn so với 822 triệu tấn ngô và 695 triệu tấn sắn (khoai mì) nhưng vẫn còn
hơn 1 tỷ người trên thế giới trên thế giới bị đói (FAO, 2010). Theo tính toán của
Peng (năm 1999), đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới phải đạt 800 triệu tấn
mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người.
Để đạt năng suất cao, bên cạnh việc cải tiến và tạo ra các giống lúa có phẩm
chất tốt, khả năng chống chịu cao, phân bón được xem là nhân tố quan trọng để
quyết định năng suất cũng như chất lượng nông sản. Tuy nhiên, việc lạm dụng
phân bón hóa học cũng gây ra nhiều tác động xấu đến môi trường, đặc biệt có thể
gây ngộ độc cho người và động vật khác. Vì vậy, ứng dụng phân bón vi sinh vào
sản xuất nông nghiệp là giải pháp tối ưu nhằm giảm chi phí đầu tư, tăng năng
suất, khắc phục được những hạn chế của phân bón hóa học, đồng thời góp phần
phát triển nông nghiệp sinh thái theo hướng bền vững.
Hiện nay, việc nghiên cứu khả năng cố định đạm và hòa tan lân của vi
khuẩn nội sinh vẫn còn hạn chế. Vì vậy, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ
ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG
LÚA ML213 TRỒNG TRONG DUNG DỊCH KHOÁNG” được thực hiện.


Hình 1. Oryza sativa L
(Nguyễn Ngọc Đệ. 1998. Giáo trình cây lúa. NXB Đại Học Cần Thơ)
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
3
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài lúa canh tác. Hiện nay, loài lúa
được canh tác và sản xuất đại trà để cung cấp lương thực trên thế giới là Oryza
sativa L. và Oryza glaberrima Steud. . Loài lúa Oryza sativa L. phân bố chủ yếu
ở châu Á và có năng suất cao. Loài lúa Oryza glaberrima Steud. được canh tác ít
hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn.
Cây lúa được canh tác từ vĩ tuyến 40
0
phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 53
0

của bắc bán cầu, và được trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nước biển cho đến độ
cao hơn 2000 m trên mặt biển.
2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý
 Rễ lúa: thuộc hệ thống rễ chùm, rễ non màu trắng sữa, rễ trưởng thành có
màu vàng nâu hoặc nâu đậm, rễ khi già có màu đen gồm hai loại:
 Rễ mầm (radicle) mọc ra lúc hạt nẩy mầm, thường mỗi hạt lúa chỉ có
một rễ mầm, dài khoảng 10-15 cm không ăn sâu, ít phân nhánh. Rễ mầm sẽ
chết sau 10-15 ngày và các rễ thứ cấp được mọc ra.

(ligule) là phần kéo dài của bẹ lá, ôm lấy thân, ở cuối chẻ đôi.
 Hoa lúa (spikelet) là hạt lúa khi chưa thụ phấn, thụ tinh. Hoa lúa thuộc
loại dĩnh hoa, gồm trấu lớn (dưới), trấu nhỏ (trên) tương ứng với dĩnh dưới và
dĩnh trên, thuộc hoa lưỡng tính, tự thụ.
Hình 2. Hình thái và cấu tạo một hoa lúa
(Department of health and ageing office of the gene technology regulator, 2005.
The biology and ecology of rice (Oryza sativa) in Australia.)
Ghi chú: a: bao phấn; f: chỉ nhị đực; st: nuốm nhụy cái; sty: vòi nhụy; o: bầu noãn; lo:
vảy cá (mày hoa; r: đế hoa; p: trấu trên (nhỏ); l: trấu dưới (lớn); g: tiểu dĩnh; g’:
cuống hoa.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
5
 Bộ nhụy cái gồm một bầu noãn và vòi nhụy chẻ đôi với hai nuốm ở tận
cùng để hứng phấn.
 Bộ nhụy đực gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn, bên trong chứa nhiều
hạt phấn.
 Bông lúa: tùy vào từng giống lúa mà có thời gian trổ bông khác nhau, sau
khi ra đủ số lá cây lúa trổ bông. Bông lúa là loại phát hoa chùm gồm một trục Hình 3. Cấu tạo của một hạt lúa
2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng
Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa là:
 Giai đọan tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng): Giai đoạn tăng trưởng
bắt đầu từ khi hạt nẩy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa đòng. Giai đoạn
này, cây phát triển về thân lá, chiều cao tăng dần và ra nhiều chồi mới (nở bụi).
Trong điều kiện đầy đủ dinh dưỡng, ánh sáng và thời tiết thuận lợi, cây lúa có thể
bắt đầu nở bụi khi có lá thứ 5-6.
 Giai đoạn giai đoạn sinh sản (sinh dục): Giai đoạn sinh sản bắt đầu từ lúc
phân hóa đòng đến khi lúa trổ bông. Giai đoạn này kéo dài khoảng 27-35 ngày,
trung bình 30 ngày và giống lúa dài ngày hay ngắn ngày thường không khác nhau
nhiều. Đòng lúa hình thành và phát triển qua nhiều giai đoạn, cuối cùng thoát ra
khỏi bẹ của lá cờ: lúa trổ bông. Dầy
Ngang
Dài
1. Gạo lức
2. Trấu trên (nhỏ)
3. Trấu dưới (lớn)
4. Trục hoa
5. Mày (tiểu dĩnh)
6. Cu
ống hoa


biệt cao theo vùng và theo mùa, trung bình có thời gian sinh trưởng khoảng 75-
250 ngày. Yếu tố ảnh hưởng phổ biến đến thời gian sinh trưởng là phương pháp
canh tác và lượng phân đạm bón vào.
2.1.5. Sơ lược về giống lúa ML213
 Thời gian sinh trưởng từ 95 đến 100 ngày.
 Chiều cao cây từ 80 đến 85 cm, chiều dài bông 21-23cm.
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
8
 Số bông trên 1m
2
có tới 400 đến 420 bông, hạt chắc trên bông là 85-90,
thân gọn, cứng cây trung bình, năng suất rất cao có thể đạt trên 80 tạ/ ha/vụ, khả
năng thích nghi rộng.
( />HOA-KHAO-NGHIEM-MOT-SO-GIONG-LUA-MOI-235.htm ngày 9/8/2013)
2.2. Tầm quan trọng của nguyên tố N, P
2.2.1. Đạm (N)
Đạm là một trong những nhân tố dinh dưỡng cần thiết cho sự tổng hợp tế
bào của các enzyme, protein, chlorophyll, DNA và RNA. Đạm có vai trò là chất
tạo hình cây lúa, làm cho lá xanh tốt, gia tăng chiều cao cây, số chồi và kích
thước lá thân (Hayat, 2010). Do đó, dựa vào màu sắc và kích thước lá, chiều cao
và khả năng nở bụi của cây lúa, người ta có thể chuẩn đoán tình trạng dinh dưỡng
đạm trong cây.
Cây lúa có thể hấp thu và sử dụng cả hai dạng đạm nitrat (NO
3
9
năng suất rất lớn đồng thời giảm thời gian bảo quản sau thu hoạch. Đạm dư thừa
có khả năng tích lũy trong cây ở dạng NO
3
, NO
2
gây độc mãn tính cho người sử
dụng.
( />oi/2004/2004_00013/MItem.2004-07-16.0249/MArticle.2004-07-
16.0917/marticle_view)
2.2.2. Lân (P)
Lân đóng một vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa vật chất và năng
lượng, từ đó quy định chiều hướng, cường độ các quá trình sinh trưởng và phát
triển của thực vật và cuối cùng là năng suất cây (Nguyễn Hữu Hiệp, 2012). Lân
là thành phần của phosphotit, acid nucleic, protein, phospholipid, coenzyme
NAP, NATP và ATP, thành phần chủ yếu của amino acid. Ngoài ra, lân có vai
trò quan trọng trong việc phân chia tế bào, tạo thành chất béo và protein thúc đẩy
việc tạo thành rễ, đặc biệt là rễ bên và lông hút. Bên cạnh đó, lân có vai trò trong
việc hình thành mô phân sinh, hạt và sự phát triển của quả, kích thích sự ra hoa,
cải thiện chất lượng sản phẩm,đặc biệt là rau và cỏ làm thức ăn gia súc. Trong
cây, lân có thể vận chuyển từ các lá già về cơ quan non, cơ quan đang phát triển
để sử dụng vào việc tổng hợp chất hữu cơ mới. Vì thế, hiện tượng thiếu lân
thường biểu hiện ở lá già trước.
 Triệu chứng thiếu lân: Đối với những cây họ lúa, khi thiếu lân cây đẻ
nhánh ít, lùn lại, hạt lép nhiều. Lá lúa thiếu lân thường có màu xanh đậm nhưng

triệu tấn supe lân và 50-60% lượng kali tương đương với 344 nghìn tấn kali
clorua (KCl) được bón vào đất nhưng chưa được cây trồng sử dụng (Sở khoa học
Năm N (tấn) P
2
O
5
(tấn) K
2
O (tấn)
2000 1.332.000 501.000 450.000
2005 1.155.100 554.100 354.400
2007 1.357.500 551.200 516.500
2010 1.627.000 892.000 669.000
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
11
và công nghệ tỉnh Bến Tre). Theo ông Lê Thanh Tùng, Phó phòng phụ trách
vùng Nam Bộ (Cục Trồng trọt), mỗi năm, chỉ riêng phân ure Việt Nam thất thoát
khoảng 1 triệu tấn so với tổng nhu cầu sử dụng là 2 triệu tấn, tương đương mất
10.000 tỉ đồng.
( />=1302. 12:00 15/08/2013)
2.3. Vi khuẩn nội sinh
2.3.1. Nguồn gốc
Vi khuẩn nội sinh (Endophytic bacteria) là những vi khuẩn cộng sinh bên
trong mô thực vật và không gây ra triệu chứng bệnh cho cây.

ngang (lateral roots), vi lỗ (micropores) hay vết thương do tác động vật lý
(wounds).
Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3
cách là: bám ở bề mặt rễ và xâm nhập vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots),
thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh.
Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí
khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá.
d) Sự định cư (Settlement)
Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị
ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các
khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002).
2.3.3. Khái quát về sự cố định nitơ sinh học bởi vi sinh vật
a) Enzyme nitrogenase
Enzyme nitrogenase thuộc nhóm EC1 là Oxidoreductases, xúc tác cho phản
ứng oxy hóa khử, nhận điện tử (e
-
) và nhả H
2
(hoặc nhận điện tử và nhả O
2
).

Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
13

+ 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH
3
+ H
2
+16ADP + 16Pi
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
14
Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định đạm N
2
: enzyme nitrogenase có cấu
tạo bởi 2 protein: 1 protein Fe và 1 protein Mo-Fe. Phản ứng cố định xảy ra theo
trình tự protein Fe sẽ khử và cung cấp điện tử trước để cung cấp điện tử trong
ferredoxin. Kế đến, protein Mo-Fe khử và cung cấp điện tử đến N
2
để tạo thành
NH=NH. Trong 2 chu kỳ tiếp theo cũng đòi hỏi cung cấp điện tử để tạo ra
H
2
N=NH
2
từ NH=NH và cuối cùng tạo NH
3
từ H
2

 Hòa tan lân vô cơ: Theo Yahya và Azawi (1989) nhận thấy những vi
khuẩn hòa tan được lân là nhờ các enzyme và các acid hữu cơ (acid gluconic,
acid oxalic, acid citric, acid monolic và acid 2-ketogluconic) có khả năng hòa tan
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
15
các hợp chất khó tan. Tuy nhiên, các vi khuẩn này sử dụng các acid hữu cơ tiết ra
từ rễ cây vì thế có thể gián tiếp ức chế sự hòa tan lân và các nguyên tố bất định
khác như Fe và Mn (Mukerji et al., 2006).
Đa số các vi sinh vật phân giải phosphore đều sinh ra CO
2
trong quá trình
sống, CO
2
sẽ phản ứng với H
2
O có trong môi trường tạo thành H
2
CO
3
, H
2
CO
3
sẽ

3
-
. NO
3
-
sẽ phản ứng với H
+
tạo thành HNO
3
.
Sau đó HNO
3
sẽ phản ứng với muối phosphate khó tan tạo thành dạng dễ tan.
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4HNO
3
=> Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2Ca(NO
3
)

nghiệm thức Pseudomonas gracilis…trong nhóm nấm thì có Aspergillus niger có
khả năng phân giải mạnh nhất. Ngoài ra một số xạ khuẩn cũng có khả năng phân
giải lân vô cơ.
(Lê Quốc Tuấn. 2009. Giáo trình Vi sinh vật môi trường. NXB Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.)
 Hòa tan lân hữu cơ: cơ chế của sự hòa tan là nhờ vào các phosphatases
(hay phosphohydrolases) do vi khuẩn tiết ra. Các phosphohydrolases là nhóm
Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36
16
acid hoặc bazơ. Bởi vì hầu hết các loại đất có pH từ acid đến trung tính nên các
phosphohydrolases acid có vai trò quan trọng. Không giống với
phosphohydrolases bazơ, các phosphohydrolases acid thể hiện hoạt tính xúc tác
đặc trưng ở giá trị pH acid đến trung tính. Các enzyme này thủy giải các liên kết
phosphoester hoặc phosphoalhydride (Rodríguez, 1999 và Stefan, 2012) .
2.3.5. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa
a) Vi khuẩn Pantoea agglomerans
Pantoea agglomerans là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Pantoea
agglomerans là vi khuẩn nội sinh quan trọng trong cây lúa mì và cũng được phân
lập từ thân của khoai tây, hạt lúa, lá của các cây thuộc họ cam quýt. Nhiều nghiên
cứu đã chứng minh tiềm năng của Pantoea sp. có khả năng tạo nên sự kích
kháng và chống các vi sinh vật gây bệnh cho cây. Thêm vào đó, vi khuẩn
Pantoea sp. có thể kích thích sự sinh trưởng bằng cách cố định đạm, hòa tan lân
và tạo ra các kích thích tố tăng trưởng.
( ngày 01.12.2013).