BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
----------
NGUYỄN THỊ NHINH
TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
LÊN MEN KOMBUCHA
TỪ TRÀ PHÚ THỌ
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐinhThị Kim Nhung
HÀ NỘI, 2015
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS.
Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trƣờng Đại hoc
Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học
tập và nghiên cứu đề tài này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn
Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt
tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian em thực hiện đề
tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật
trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ
trà Phú Thọ .............................................................................................. 2
3.3. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn, nấm men
tuyển chọn; ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình
lên men kombucha từ trà Phú Thọ ........................................................... 2
3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ ....................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài .........................................2
4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3
5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................3
5.1. Phƣơng pháp vi sinh ................................................................................... 3
5.2. Phƣơng pháp hóa sinh ................................................................................ 3
5.3. Phƣơng pháp cảm quan .............................................................................. 3
5.4. Phƣơng pháp toán học ................................................................................ 3
6. Điểm mới của đề tài ....................................................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về kombucha ...........................................................................4
1.1.1. Nguồn gốc .............................................................................................. 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ..................................................................................... 5
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha ................................................................ 7
1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha ................................. 10
1.2. Tình hình nghiên cứu về kombucha trên thế giới và ở Việt Nam ............ 12
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 12
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ......................................................... 14
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 18
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................. 18
2.1.1. Mẫu thực vật ........................................................................................ 18
2.1.2. Mẫu vi sinh vật ...................................................................................... 18
3.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men
kombucha từ trà Phú Thọ ....................................................................... 40
3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ ................................... 42
3.4.1. Lên men kombucha ............................................................................... 42
3.4.2. Thuyết minh quy trình ........................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................ 46
1. Kết luận .................................................................................................... 46
2. Kiến nghị ..................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 47
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trà kombucha ........................................... 10
Bảng 2.1. Các loại môi trƣờng sử dụng .................................................... 19
Bảng 2.2. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan
của kombucha ........................................................................... 24
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ........................................... 24
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức độ chất lƣợng
sản phẩm................................................................................... 25
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men....................................... 28
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn
phân lập .................................................................................... 29
Bảng 3.3. Hàm lƣợng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men
của 4 chủng nấm men ............................................................... 32
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của 4 chủng nấm men ................................. 32
Bảng 3.5. Hàm lƣợng acid tổng số sinh ra và chất lƣợng cảm quan
sản phẩm từ 5 chủng vi khuẩn................................................... 36
Bảng 3.6. Đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter
phân lập đƣợc từ trà Phú thọ ..................................................... 37
Bảng 3.7. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn V2
1. TCN
: Trƣớc công nguyên
2. VK
: Vi khuẩn
3. NM
: Nấm men
4. TCVN
: Tiêu chuẩn Việt Nam
5. CFU
: Clony Forming Unit
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cùng với xu hƣớng tiêu dùng mới, khi vấn đề sức khỏe ngƣời tiêu dùng
đƣợc đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi thiên nhiên ngày càng
đƣợc ƣa chuộng. Thị trƣờng đồ uống không ngừng gia tăng sản lƣợng và đa
dạng hóa sản phẩm. Trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm ƣu thế.
Đối với ngƣời Việt Nam, trà (chè) đã trở nên khá quen thuộc và gần
gũi. Uống trà không những là thói quen trong đời sống mà đã trở thành một
nhã thú hƣởng thụ tinh thần. Uống trà không chỉ để giải khát mà còn có khả
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha tạo sản
phẩm kombucha thơm ngon, bổ dƣỡng từ trà Phú Thọ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú
Thọ
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú
Thọ
3.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển
chọn; ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ
trà Phú Thọ
3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men
kombucha tốt nhất từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng nguồn nguyên liệu là trà Phú Thọ lên men kombucha tạo sản
phẩm nƣớc giải khát đa dạng trên các nguồn nguyên liệu khác nhau.Tuyển
chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng kombucha từ đó rút ngắn thời
gian tạo màng, tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dƣỡng có tác dụng phòng ngừa
một số bệnh.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp vi sinh
5.2. Phương pháp hóa sinh
5.3. Phương pháp cảm quan
Nhật Bản và đƣợc gọi tên là trà nấm kombucha [14].
Khác với các sản phẩm lên men thông thƣờng, kombucha là sản phẩm
của nhiều quá trình lên men tùy vào hệ vi sinh vật có trong nấm, bao gồm:
quá trình lên men rƣợu nhờ nấm men, lên men acetic nhờ nhóm vi khuẩn sinh
acid acetic và lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic. Do đó, trong dịch lên
men chứa hàng trăm sản phẩm phụ từ ba quá trình lên men trên, chúng đóng
4
vai trò quan trọng trong việc hình thành nên hƣơng vị của sản phẩm, đáng chú
ý nhất là các acid butyric, acid uronic, acid folic…các vitamin nhóm B (B1,
B2, B3,B6, B12) vitamin C. Sản phẩm vừa có vị chua của acid, vị ngọt của
đƣờng sót, hậu vị chát và mùi thơm của trà, và vị cay nhẹ của cồn.
Ngoài vai trò là một thức uống giải khát thông thƣờng, kombucha còn
đem lại những lợi ích cho sức khỏe nhƣ: giảm cao huyết áp, chống lại bệnh
viêm khớp, xơ cứng động mạch, hen suyễn, viêm phế quản, ngăn ngừa bệnh
ung thƣ, chống lão hóa và tăng hệ miễn dịch cho cơ thể [22].
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo
Kombucha là môi trƣờng cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi
sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter
nhƣ:
Acetobacter
xylinum,
Acetobacter
ketogenum…và
parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên
sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng
gây ung thƣ, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dƣỡng và gây mùi
khó chịu.
Hình 1.2. Kombucha bị nhiễm nấm mốc
6
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha
1.1.3.1. Acetobacter
Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố
rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập đƣợc các vi khuẩn này từ không
khí, đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm, giấm, rƣợu, bia, hoa quả… Có khoảng
20 loài thuộc giống Acetobacter đã đƣợc phân lập và mô tả, trong đó có nhiều
loài có ý nghĩa kinh tế.
* Đặc điểm chung của chủng Acetobacter
Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ,
thành phần môi trƣờng nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra
các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thƣớc
thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm). Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc
chu mao) hoặc không di động (không có tiên mao). Hiếu khí bắt buộc, chịu
đƣợc độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn
thức ăn cacbon khác nhau nhƣng không sử dụng đƣợc tinh bột. Tế bào đứng
riêng lẻ hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo thành váng trên môi
trƣờng lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:
Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.
Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhƣng chắc.
Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.
Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.
* Phân loại nấm men
Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi
Imporfecti).
Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống
Endomyces; Giống Schizosaccharomyces
8
Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis);
Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã đƣợc xếp vào lớp nấm mốc);
Rhodotorula [8].
1.1.3.3. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và đƣờng đôi nhƣng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó
cần sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon.
Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,
Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Ngày nay ngƣời ta bổ sung vào
nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium..
Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà ngƣời ta chia vi khuẩn lactic thành
dạng hình cầu và hình que. Kích thƣớc của chúng thay đổi tùy từng loài.
Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đƣờng kính tế
bào 0.5-1µm. Sau khi phân chia theo một phƣơng chúng thƣờng xếp riêng
biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn.
Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đƣờng kính
từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm. Trong một số điều kiện chúng cũng
có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3 µm. Sau khi phân chia chúng hƣờng
Acetic acid
2.36
g/l
Glyconic acid
0.129
g/l
Formic acid
0.109
g/l
Oxalic acid
0.01
g/l
Caffeine
0.065
g/l
1.1.4.2. Công dụng của kombucha
Kombucha là thành phần có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp
chất hữu cơ, ngoài ra trà chứa một lƣợng nhỏ cafein vì đƣợc lên men từ các
loại trà ( trà xanh, trà ô long, trà đen…). Trà kombucha nếu dùng đúng liều
lƣợng và chỉ định sẽ có lợi ích rất tốt đối với sức khỏe: Tăng sức chịu đựng
dẻo dai, bền bỉ đƣợc xem nhƣ một loại thuốc bổ, giảm đau cơ và triệu chứng
mệt mỏi; tăng số lƣợng vi khuẩn bifida có lợi trong ruột nhờ sản sinh acid
lactic, vi khuẩn này tác động giống nhƣ vi khuẩn acidophilus thƣờng có trong
các loại sữa chua lên men; trà kombucha sản sinh hai loại acid lactic và acid
axetic giúp tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, giúp ngừa táo bón, nhiễm
trùng đƣờng ruột, kiết lỵ, rối loạn tiêu hóa chữa viêm loét, dạ dày; cải thiện
làn da, tăng tính đàn hồi của da, làm da tƣơi sáng hơn, chữa vảy nến, chàm,
mụn nƣớc, mụn cóc, viêm da, sừng da và giúp mọc tóc nhiều hơn; giải độc cơ
thể nhờ acid glycuronic kết hợp với các độc tố trong gan và làm chúng dễ tan
trong nƣớc, sau đó bài tiết qua đƣờng tiểu; chữa đau khớp, sản phẩm chuyển
hóa của acid glycuronic là glucosamin rất tốt cho hệ keo giúp bôi trơn các
khớp xƣơng và sụn nhất là ở những ngƣời lớn tuổi hay bị đau khớp; tác dụng
kháng sinh, trà còn sản sinh acid usnic, có thể chống lại các vi trùng gây bệnh
nhƣ treptococci, diplococci, flexner và shigella, giúp cân bằng hệ acid bazo
cho cơ thể khi chúng ta ăn uống không đúng cách; chống trầm cảm chữa
chứng thiếu ngủ; giúp tăng thị lực, chữa quáng gà, chảy nƣớc mắt và chứng
đục thủy tinh thể ở ngƣời cao tuổi. Trà còn giải cơn nghiền rƣợu cho ngƣời có
thói quen uống rƣợu [15].
Những lưu ý
Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thƣ do xạ trị hoặc
hóa trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc; do trà chứa quá nhiều
acid lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt
11
12
là chống táo bón. Đến năm 1927, Madaus đã có những nghiên cứu và đƣa ra
kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tác động tích
cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phƣơng thuốc tuyệt vời cho bệnh xơ
vữa động mạch. Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiên cứu của
mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chức năng hệ
miễn dịch. Reiss, J. (1994) đã tìm hiểu ảnh hƣởng của các loại đƣờng khác
nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà. Năm 2006, K.H. Steinkraus và
cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt động kháng sinh của trà nấm
kombucha. Năm 2007, Velicanski và cộng sự đã cho biết hoạt động kháng
khuẩn và chống oxy hóa của kombucha. Jayabalan R. và cộng sự (2010) đã
nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của nấm trà. Cavusoglu K., Gluer P. (2010)
đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra
bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con ngƣời trong ống
nghiệm. Yapar K và cộng sự (2010) đã có những nghiên cứu về tác dụng bảo
vệ của nấm trà kombucha đối với chuột bạch tạng bị nhiễm độc do phenol.
Các nghiên cứu về định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha và ứng
dụng của các chủng đƣợc phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ
năm 1928, Hermann đã định danh hai chủng Bacterium xylinum và B.
xylinoides và B. gluconicum. Các nhà nghiên cứu còn xác định đƣợc
kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum cùng các vi
khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo
thành một khối nhƣ tổ chim. Vào năm 1973, List và cộng sự đã phân lập đƣợc
Acetobacter ketogenum; Pichia fermentans; Saccharomyces apiculatus;
S.ludwigli; B.xylinoides; Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy
kombucha. Năm 2001, Kurtzman CP. và cộng sự đã phân lập đƣợc một chủng
nấm men mới từ kombucha và đặt tên là Zygosaccharomyces kobuchaensis.
Vào năm 2006, Dutta D. và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng
quá trình lên men nên nƣớc chè ban đầu có vị chát sẽ trở thành chua chua.
14
Đây là đồ uống đã có từ lâu. Có thể vì ngƣời dân muốn thể hiện là cái gì quý
nên gán cho có chữ sâm, thống kê có 54 cây có tên là sâm, nhƣng không phải
là loại sâm nào cũng tốt. Muốn khẳng định tác dụng một loại đồ ăn, thức uống
nào tốt hay không tốt cho sức khỏe cần phải thông qua nghiên cứu, đánh giá
khoa học. Nếu có kinh nghiệm chỉ là kinh nghiệm cá nhân. Chƣa có nghiên
cứu thì không thể đƣa ra chỉ định hay chống chỉ định. Không thể có một thức
uống hay đồ ăn tốt cho tất cả mọi ngƣời. Ở Việt Nam chƣa có đánh giá nào về
vấn đề này, nên ngƣời uống cũng phải cảnh giác, vì nó là nấm. Không nên
uống quá nhiều và thƣờng xuyên để có thời gian đào thải” [18]. Phan Đức
Bình, phó chủ tịch Hội Bảo vệ ngƣời tiêu dùng TP HCM cho biết, những
quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc,
ngừa ung thƣ, trị bá bệnh...” đều không có những bằng chứng xác thực. Thực
tế, trà dƣỡng sinh kombucha xuất phát từ một loại nƣớc uống chế tạo từ rong
biển tại Nhật Bản sau đó lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nƣớc Đông Âu…
ngƣời ta lấy trà để thay thế rong biển. Nghiên cứu cho thấy, nó hoàn toàn
không có khả năng trị bệnh, thậm chí có thể nguy hại nếu chế biến không
đảm bảo hoặc sử dụng nhiều. Dƣợc sĩ Bình khuyến cáo, không nên uống
nhiều kombucha bởi độ chua của kombucha cao, có thể làm ảnh hƣởng đến
đƣờng tiêu hóa, nhất là ngƣời viêm loét dạ dày, nhạy cảm với chất chua. Hơn
nữa, việc ăn, uống quá nhiều acid lactic cũng có hại cho sức khỏe, thậm chí
còn gây ung thƣ [19]. Vũ Quốc Trung - hội viên hội Đông Y Việt Nam:
“Thủy sâm thực chất chỉ là một loại nƣớc uống đơn giản, nó đƣợc lên men từ
trà và nƣớc đƣờng, tạo ra con giống gần nhƣ con giấm. Nó có vị chua nhƣ
giấm. Vì có vị chua nên ngƣời ta thƣờng sử dụng trong việc giảm cân là chủ
yếu”. Nguyễn Xuân Hƣớng, nguyên Chủ tịch Hội đông y Việt Nam cho biết:
niên, rối loạn tiêu hóa, huyết áp cao, thiểu năng tuần hoàn não, trầm cảm,
thiếu ngủ, cholesterol cao và ngay cả bệnh ung thƣ cũng thấy thuyên giảm rõ
rệt khi họ sử dụng trà kombucha". Đây là một dạng cộng sinh giữa nấm men
16
Copyright: Tài liệu đại học ©