TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
====== o0o ======

NGUYỄN THỊ HÀ

ẢNH HƢỞNG CỦA NGUỒN CACBON
TỚI QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BC CHO
CHỦNG GLUCONACETOBACTER
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS.
Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trường Đại
hoc Sư phạm Hà Nội 2, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời
gian học tập và nghiên cứu đề tài này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ
môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà
Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh
vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn
thành khóa luận này.

1.2.1. Cấu trúc của màng BC ....................................................................... 4
1.2.2. Một số tính chất của màng BC ........................................................... 5
1.2.3. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter ................. 6
1.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
Gluconacetobacter ......................................................................................... 6
1.4. Cơ chế tổng hợp màng BC ...................................................................... 8
1.5. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Gluoconacetobacter .................................. 10
1.5.1.Độ pH ............................................................................................... 10
1.5.2. Nhiệt độ ........................................................................................... 10
1.5.3.Độ thông khí ..................................................................................... 10
1.5.4. Thời gian nuôi cấy ........................................................................... 10
1.6. Ứng dụng của màng BC ......................................................................... 10
1.7. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới ............. 11
1.7.1. Trên thế giới .................................................................................... 11
1.7.2. Ở Việt Nam ..................................................................................... 12
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 14
2.1. Thiết bị và hóa chất ................................................................................ 14
2.1.1. Hóa chất ......................................................................................... 14
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................. 14
2.1.3. Môi trường nghiên cứu ................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 15


2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................ 15
2.2.2. phương pháp hóa sinh ...................................................................... 15
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng
tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter .................................................... 18
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC ..................... 18
2.2.5. Phương pháp toán học .................................................................... 19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................... 20

Hình 1.1. Sợi cellulose của cellulose thực vật và màng BC (SEM)............... 5
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose của chủng Gluconacetobacter .........9
Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng .................. 20
Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram của ............................................................. 20
Hình 3.3. Vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa .............................................. 21
Hình 3.4. Vi khuẩn trên môi trường lỏng ...................................................... 21
Hình 3.5. Hoạt tính catalase của chủng Gluconacetobacter .......................... 22
Hình 3.6. Vòng phân giải CaCO3 ................................................................. 22
Hình 3.7. Vi khuẩn trên môi trường hoạt hóa ............................................... 23
Hình 3.8. Màng BC sau 5 ngày lên men ....................................................... 24
Hình 3.9. Kết quả nhuộm màng BC .............................................................. 25
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng đường
glucose và khối lượng màng BC .............................................. 26
Hình 3.11. Khối lượng màng BC thu sau 4 ngày .......................................... 27
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng đường
saccarose và khối lượng màng BC ............................................ 29
Hình 3.13. Màng BC thu được sau 6 ngày trên môi trường nước dừa ........... 29
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng nước
dừa và khối lượng màng BC tươi .............................................. 31
Hình 3.15. Màng BC thu được sau 7 ngày ................................................... 31


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ĐƢỢC ĐỌC LÀ

TỪ VIẾT TẮT
BC

Bacterial Cellulose


Glucose - 1 - phosphate uridylyltransferase

CS

Cellulose synthase

g

gam

STT

Số thứ tự


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay các sản phẩm sinh học ngày càng chiếm ưu thế, dần thay thế
các sản phẩm hóa học. Màng BC được tạo thành nhờ nuôi cấy vi khuẩn là
một sản phẩm sinh học có nhiều ứng dụng thiết thực như trong bảo quản thực
phẩm thay thế cho túi ni lông thân thiện với môi trường, ứng dụng trong trị
bỏng, làm mặt nạ đắp da....Màng BC đã được nghiên cứu trên vi khuẩn
Acetobacter xylinum. Trong những năm gần đây, tại phòng thí nghiệm Vi
sinh-khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, đã phân lập được chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC.
Màng

BC

(Bacterial


1


2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men tạo màng
BC cho chủng Gluconacetobacter.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Khả năng lên men tạo màng BC chủng vi khuẩn Glunacetobacter.
3.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình tạo màng BC từ chủng
Gluconacetobacter.
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men tạo
màng BC từ chủng Gluconacetobacter.
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccarose tới quá trình lên men
tạo màng BC tử chủng Gluconacetobacter.
3.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới quá trình lên men tạo màng
BC từ chủng Gluconacetobacter.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu được nguồn cacbon ph hợp đối với quá trình lên men tạo
màng BC từ chủng vi khuẩn Glunacetobacter BHN2.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần rút ngăn được thời gian tạo màng BC từ chủng
vi khuẩn Glunacetobacter BHN2.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp vi sinh
5.2. Phương pháp hóa sinh
5.3. Phương pháp toán học
6. Điểm mới của đề tài
Đã tạo được màng BC từ chủng Gluconacetobacter sau thời gian 4

trong dịch, giấm, dịch hoa quả, đất….[17]
1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, chủng Gluconacetobacter hình thành khuẩn
lạc có kích thước nhỏ đường kính từ 1-2mm, nhẵn hoặc xù xì, rìa mép của
khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt. Chủng
Gluconacetobacter BHN2 khi nuôi cấy trên môi trường lỏng tĩnh, chúng sẽ
hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng BC. Khi nuôi cấy trong điều
kiện lắc, sợi cenlulose hình thành ở dạng hạt nhỏ với kích thước không đều và
phân tán trong môi trường dinh dưỡng có hình thái khác so với sợi cenlulose
trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng Gluconacetobacter
Đặc điểm sinh lý của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng,
phát triển ở điều kiện nhiệt độ 25oC – 35oC; pH 4-6. Các chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter sinh trưởng được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thể

3


bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn
lạ.[8]
Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao
gồm: Oxy hóa ethanol thành acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính;
Chuyển hóa glucose thành acid; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cenlulose,
không tăng trưởng trong môi trường Hoyer.[3]
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
STT
1
2
3
4

+
tổng hợp cellulose

1.2. Đặc điểm màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
Gluconacetobacter BHN2 hình thành nên lớp màng có bản chất là cenlulose,
được tập hợp bởi nhiều bó sợi cenlulose liên kết với nhau được gọi là màng
Bacterial cellulose hay màng BC.
1.2.1. Cấu trúc của màng BC
Màng BC có đường kính bằng 1/100 đường kính cellulose của thực vật
(PC – plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi một chuỗi polymer β-

4


1,4glucopynanose, có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật,
nhưng cấu trúc, đặc tính thì khác xa nhau[17]
Chuỗi polymer β-1,4glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ( subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
thành sợi lớn( microfibril) , những sợi nhỏ này kết hợp với nhau tạo thành bó
và cuối cùng tạo thành dải ribbon . Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 19nm. Những rải ribbon được keeos ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải
ribbon của tế bào khác bằng liên kết Hidro bằng hoặc lực Van Der Waals tạo
thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường
nuôi cấy[20].

Hình 1.1. Sợi cellulose của cellulose thực vật và màng BC (SEM)
1.2.2. Một số tính chất của màng BC
Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất
hemicelluloses. Hemicellulose là những polysaccharide không tan trong nước

cacbon có ý nghĩa quyết định trong đời sống vi sinh vật. Trong đó hàm lượng
đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn. Để tránh ở nhiệt độ cao và
trong môi trường kiềm bị chuyển hóa khi khử tr ng môi trường có chưá
đường, người ta chỉ hấp thanh tr ng môi trường ở điều kiện áp suất 0.5atm,
110oC.
Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia khác, nguồn nguyên liệu chủ
yếu để sản xuất màng BC là nước dừa. Tùy theo giống dừa mà hình dạng và
kích thước và trọng lượng trái dừa khác nhau, trong đó nước dừa chiếm 21-

6


25% trọng lượng trái dừa, trung bình trọng lượng trái dừa chiếm khoảng
300ml nước. Trong nước dừa già chứa nhiều carbohydrate, vitamin, axit
amin, các chất kích thích sinh trưởng… do đó nước dừa là môi trường thuận
lợi cho sư phát triển của vi khuẩn G.BHN2. thành phần hóa học của nước dừa
được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của nƣớc dừa già
Thành phần
Tổng hàm lượng chất rắn(%)
Đường khử(%)
Chất khoáng(%)
Protein(%)
Chất béo(%)
Ph
K(mg%)
Na(mg%)
Ca(mg%)
Mg(mg%)
P(mg%)

Biotic
Riboflavin
Axitfolic
Piridoxin(B6)
Thiamin(B1)
vitamin(mg/ml)

0.64
0.52
0.02
0.01
0.003
Vết
Vết
2.3-3.7
Nguồn: the wealth ò India(1950)

7


Bảng 1.4. Thành phần axitamin của nƣớc dừa
Hàm lượng (%)
2.41
10.75
3.60
0.97 – 1.17
9.76 – 14.5
1.95 – 2.05
1.95 – 4.18
1.95 – 4.57

trương nuôi cấy[22]. Theo tác giả Thiaman (1962) giải thích cách hình thành
cenlulose như sau: các tế bào vi khẩn Gluconacetobacter khi sống trong môi
trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ
đường glucose, kết hợp đường với axit để tạo tiền chất nằm ở màng tế bào.

8


Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm trên màng tế bào cùng
với enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
Theo đó, quá trình sinh tổng hợp màng BC là một tiến trình bao gồm
nhiều bước được điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ
thống chứa nhiều loại enzym phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.
Theo tác giả Alina Krystynowicz và cộng sự cho rằng có 4 enzym
tham gia xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter:
Glucokinase (GK), Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - phosphate
uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase
(CS). Trong đó UGP là enzym có vai trò quan trọng nhất.

Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose của chủng
Gluconacetobacter.

9


1.5. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Gluoconacetobacter
1.5.1.Độ pH
Vi khuẩn Gluconacetobacter phất triển thuận lợi trên môi trường có độ
pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ xung thêm axit acetic nhằm
axit hóa môi trường, đồng thời axit acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp

Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter và những ứng
dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown,
1999, d ng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước,
dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown,
Jonas và Farad, d ng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc
thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown đã d ng BC làm vải đặc biệt, Nogiet và
cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006) Sirlene
M.Costa, d ng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố
định protein hay cho sắc kí [21]. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các
phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan hoặc
cellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu điều trị các bệnh
tim mạch [18].
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong
phẫu thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ
dưỡng da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng
chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ
gia, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí, .…
Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh
hưởng của nguồn cacbon đến khả năng hình thành cellulose. Nghiên cứu chế
tạo màng từ vi khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng
dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn

11


Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
d ng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),
Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs,

Thị Kim Nhung đã chọn được 1 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum NH1,
khảo sát khả năng tạo tạo màng của chủng này. [5].
Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter
ngày càng được nhiều tác giả quan tâm.. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn
Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, Trường đại học Y Dược học
Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng
phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và
trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da
tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn
gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da.
Chính vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết
thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời
gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu[4].
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu
nhận màng BC từ vi khuẩn A.Xylinum, ứng dụng màng BC trong điều trị
bỏng. Công tác điều trị bỏng hiện đang sử dụng phương pháp cấy ghép, phẫu
thuật, hoặc dùng một số màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch,
màng chitossan, sử dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều
trị bỏng . Theo tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, màng trị bỏng sinh học BC với
các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên nhiên.
Vì thế, nó không chứa các yếu tố nguy cơ như không có độc tố trực tiếp,
không gây dị ứng, không có yếu tố lây lan mầm bệnh, không giải phóng chất
lạ vào vết thương. Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra các
nhiễm trùng vết thương hở da như vết bỏng... Chỉ cần áp sát màng vào vết
thương và không cần sử dụng bất cứ thứ gì khác, màng đã có khả năng cản
khuẩn, đồng thời, làm vết mau lành do thúc đẩy quá trình tạo mô hat[6].

13



2.1.4.1. Môi trường giữ giống (MT1)
Glucose: 20g/l

(NH4)2SO4: 3g/l

Pepton:5g/l

KH2PO4: 2g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

Nước máy: 1000 ml

Agar: 20g/l
2.1.4.2. Môi trường nhân giống(MT2)
Glucose: 20g/l

KH2PO4: 2g/l

Pepton: 5g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

(NH4)2SO4:3g/l

Nước Dừa: 1000 ml

Acid acetic 2%

Rượu etylic 2%

Gram âm với vi khuẩn Gram dương. Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt
màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm. Ngược lại nếu tế bào bắt màu tím thì
đó là vi khuẩn Gram dương. Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và
Gram dương khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gram
dương được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie có
khả năng tạo màu tím với gentian và lugol tạo ra một phức chất bền, khó bị
rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn Gram
dương bắt màu tím của gentian trong khi đó những vi khuẩn Gram âm không
có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ bị rửa
trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ fucshin lên tế bào vi khuẩn Gram âm bắt màu
hồng – màu của fucshin [3], [4], [5].
2.2.1.2. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là
Gluconacetobacter BHN2được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày
trong tủ ấm ở 300C. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên
cứu tiếp theo. Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 1 tháng một
lần [4], [5].
2.2.1.3. Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử
dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật
cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu
chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210 trong 20 phút. Sau đó
đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào
và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24giờ [4], [5].

16


2.2.1.4. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C

trắng sữa) , ngược lại là âm tính [1].
2.2.2.3. Phát hiệnkhả năng chuyển hoá glycerol thành dihydroaceton
Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyaceton từ glycerol. Chúng
tôi tiến hành trên môi trường bao gồm thành phần sau:
Glycerol: 4% (g/l)
Cao nấm men: 0,3 % (g/l)
Cao ngô: 3% (g/l)

CaCO3: 0,3% (g/l)
(NH4)2SO4 : 0,1% (g/l)
H2O: 1000ml

17

pH : 5,3

Trích đoạn Khảo sát khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn

---