BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TRẦN CAO PHƯƠNG VŨ

NGHIÊN CỨU TÁCH PHÂN ĐOẠN PROTEIN CĨ
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA TỪ DỊCH CHIẾT
HẢI MIÊN (SPONGIA SP.) THEO PHƯƠNG PHÁP
KẾT TỦA BẰNG AMMONIUM SULFATE

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Chế biến thủy sản

NHA TRANG – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TRẦN CAO PHƯƠNG VŨ

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CHIẾT VÀ KHẢO
SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA
DỊCH CHIẾT TỪ CÂY SẢ CHANH
(CYMBOPOGON CITRATUS STAPF)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Chế biến thủy sản


ii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................. i
MỤC LỤC.................................................................................................................. ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii
Lời mở đầu ..................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1. Giới thiệu về hải miên..................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm sinh học và tập tính sống của hải miên.............................3
1.1.2. Phân loại, môi trường sống ...............................................................9
1.1.3. Cấu tạo cơ thể..................................................................................11
1.1.4. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxy hóa có trong hải
miên.........................................................................................................................15
1.1.5. Tình hình nghiên cứu về hải miên trên thế giới và Việt Nam.........17
1.2. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và khả năng chống oxy hóa của protein21
1.2.1. Quá trình oxy hóa............................................................................21
1.2.1.1.Gốc tự do...............................................................................................21
1.2.1.2. Nguồn gốc hình thành các gốc tự do .......................................22
1.2.2. Chất chống oxy hóa.........................................................................22
1.2.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa .................................................22
1.2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa .............................................................22
1.2.3. Khả năng chống oxy hóa của protein..............................................23
1.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa và phân đoạn protein ....25
1.3.1. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa............................25
1.3.2. Các phương pháp tinh sạch protein.................................................27
1.3.2.1. Phương pháp kết tủa protein bằng muối..................................27

1. Kết luận .........................................................................................................59
2. Kiến nghị. ......................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................60
PHỤ LỤC..................................................................................................................62


iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine.
AS: Ammonium sulfate.
AA: Ammonium acetate.
UV – Vis (Ultraviolet – Visite): Tử ngoại – khả kiến.


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hải miên ......................................................................................................3
Hình 1.2. Hải miên nước ngọt Spongilla lacustris ......................................................4
Hình 1.3. Loại tế bào chính của Porifera [13]...........................................................11
Hình 1.4. Giải phẩu cấu tạo cơ thể hải miên .............................................................14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Purpurone ...............................................................19
Hình 1.6. Các dẫn xuất của Subergorgic axit............................................................19
Hình 1.7. Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối. .............................28
Hình 2.1. Loài hải miên Spongia sp. lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc ......................31
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát..............................................................32
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên ......33
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1. ............35
Hình 2.5. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn. ............................................38

Hình 3.10.Đồ thị thể hiện mối tương quan giữ khả năng khử gốc tụ do
DPPH với hàm lượng protein

................................................................................54

Hình 3.11. Đồ thị thể hiên mối tương quan giữa protein và tổng năng lực khử của
các phân đoạn protein lần 2.......................................................................................54
Hình 3.12. Đồ thị tổng năng lực khử của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số liệu trên
đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ............................................................55
Hình 3.13. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein.

Số

liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau
thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ..............................................56
Hình 3.14. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số
liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau
thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ...............................................57


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. So sánh giữa các lớp hải miên. .................................................................10
Bảng 1.2. Sự khác nhau giữa các lớp hải miên sống trong các phạm vi khác
nhau của môi trường sống .........................................................................................11
Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hòa ở 40C và 100C.........................................................34


Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa khai thác được nguồn tài nguyên biển vô cùng quý


2

giá này, mặt dù giá trị mà nó mang lại là rất lớn, đặc biệt là giá trị vệ mặt y tế, dược
phẩm. Vì vậy em xin chọn đề tài "Nghiên cứu tách phân đoạn protein có hoạt
tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) theo phương pháp kết
tủa bằng ammonium sulfate" từ đó làm cơ sở cho các nguyên cứu tách chiết, tinh
chế các chất chống oxy hóa từ Hải Miên sau này.
2. Mục tiêu của đề tài
Tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên
(Spongia sp.) theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate (AS).
3. Ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học của đề tài.
- Ý nghĩa khoa học:
Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống từ việc tìm chọn các thông số
cho việc kết tủa phân đoạn protein có hoạt tính sinh học từ hải miên, vì vậy là
nguồn bổ sung các tư liệu có tính khoa học về các protein có hoạt tính sinh, hóa của
hải miên. Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong
phú cho các nhà nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ hải miên nói riêng và
các loài động vật khác nói chung, đồng thời khuyến khích các công trình nguyên
cứu, tìm tòi các loại sinh vật chưa được biết đến dưới đại dương nhằm bổ sung 1
lượng kiến thức khoa học lớn cho nhân loại và nâng cao được giá trị của các loài
sinh vật đó, cũng như lợi ích mà đại dương đem lại cho chúng ta.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử
dụng các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ hải miên trong y, dược học và đời
sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của hải miên. Thành công của đề tài mở
ra một hướng mới trong việc sản xuất các loại sản phẩm chức năng và các loại thuốc dùng
trong y học nhằm nâng cao sức khỏe con người, thúc đẩy nền kinh tế nước nhà.

4

nhận các chât dinh dưỡng thông qua một lỗ gọi là osculum. Nhiều loài hải miên có
bộ xương bên trong và/hoặc có gai của canxi cacbonat hoặc silicon dioxide. Tất hải
miên là động vật không xương sống. Có một số sống ở nước ngọt, nhưng đại đa số
sống ở biển có nhiều loài khác nhau, từ các khu thủy triều đến độ sâu vượt quá
8.800 m.
Có khoảng 5.000 - 10.000 loài hải miên đã được biết đến, chúng ăn vi khuẩn và
thức ăn khác trong nước. Một vài loài hải miên sống trong môi trường nghèo chất
dinh dưỡng đã trở thành động vật ăn thịt mà chủ yếu là ăn các động vật nhỏ, động
vật giáp xác [4].
Cơ thể hải miên có hai lớp bên ngoài ngăn cách bởi một lớp gel (không có tế
bào) gọi là mesohyl (còn gọi là mesenchyme). Trong lớp gel hoặc là spicules (kim hỗ
trợ tạo từ canxi cacbonat) hoặc sợi spongin (một loại xương linh hoạt có cấu tạo từ
protein). Hải miên không có mô tạng, các loại hải miên khác nhau tạo thành hình
dạng khác nhau, bao gồm cả ống, quạt, ly, nón, đụn, thùng và lớp vỏ có kích thước từ
vài mm cho tới 2 mét.
Giống như các động vật ngành Thích ty bào như sứa và sứa phiến lược và
không giống như tất cả các động vật đa bào khác đã biết, cơ quan hải miên bao gồm
một phi sinh khối thạch giống như kẹp giữa hai lớp chính của các tế bào.
- Sinh sản:
+ Sinh sản vô tính:

Hình 1.2. Hải miên nước ngọt Spongilla lacustris


5

Hải miên có ba phương pháp sinh sản vô tính: phân mảnh; nảy chồi; và bằng
cách sản xuất gemmules. Những mảnh vỡ của hải miên có thể được tách ra bởi các


trùng vỡ ra khỏi nang và bị trục xuất qua các osculum. Tinh trùng được dòng nước
mang đi, khi gặp các hải miên cùng loài, thay vì bị tiêu hóa, chúng được ameboid
hình thức qua mesohyl với trứng.
Một vài loài đẻ trứng đã được thụ tinh vào trong nước, nhưng hầu hết giữ lại
những quả trứng cho đến khi chúng nở. Có bốn loại ấu trùng, nhưng tất cả là bóng
của các tế bào với một lớp bên ngoài của các tế bào có roi hoặc lông mao cho phép
ấu trùng di chuyển. Sau khi bơi trong một vài ngày ấu trùng thu thập dữ liệu cho
đến khi chúng tìm thấy một nơi thích hợp để sinh sống. Hầu hết các tế bào biến đổi
thành archeocytes và sau đó thành các loại phù hợp với vị trí đã chọn sau đó phát
triển đầy đủ như một miếng hải miên trưởng thành nhưng với kích thước thu nhỏ [9].
- Phòng thủ:
Hầu hết các loài hải hiên sống trong trạn nhiệt đới đã phát triển các phương
tiện để tạo ra một loạt các hợp chất hóa học để tự vệ hoặc để ngăn chặn các sinh vật
khác phát triển trên cơ thể của mình. Các Nudibranch màu sắc rực rỡ là một ví dụ rõ
ràng về một nhóm động vật mà không chỉ sản xuất các hợp chất phòng thủ độc hại
mà nó muốn cảnh báo bởi màu sắc rực rỡ. Trong khi nhiều hải miên không phô
trương độc tính của nó qua những màu sắc rực rỡ mà nó có thể sản xuất ra một số
các hợp chất phức tạp nhất được tìm thấy ở bất cứ đâu trên rạn san hô trên thế giới.
Từ nhiều năm nay, khoa học đã thu thập và phân tích một hợp chất trên nhiều miếng
hải miên để sử dụng trong các lĩnh vực y tế để chống lại căn bệnh ung thư của con
người và cho họ sử dụng như một chất kháng khuẩn. Nhiều người nghĩ rằng trong
số các hợp chất này có thể được hải miên sử dụng như một hình thức chiến tranh
hóa học (allelopathic) chống đóng cặn hoặc ngăn cản các sinh vật xâm lấn bao gồm
các hải miên khác. Hải miên không có hệ thống miễn dịch phức tạp như của hầu hết
các loài động vật khác. Tuy nhiên nó từ chối ghép từ các loài khác, nhưng chấp
nhận chúng từ các thành viên khác của cùng một loài. Trong một vài loài hải miên,
các tế bào màu xám giữ vai trò chủ đạo trong việc từ chối các loài khác. Khi chiếm
được, nó sản xuất ra một chất hóa học làm dừng chuyển động của các tế bào khác
trong khu vực bị ảnh hưởng, do đó ngăn ngừa sự xâm nhập từ việc sử dụng hệ

hết hải miên ăn thịt sống ở vùng nước sâu, lên đến 8840 m [7] và sự phát triển của
kỹ thuật thăm dò đại dương sâu dẫn đến việc phát hiện ra nhiều thông tin hơn. Tuy
nhiên một trong những loài đã được phát hiện trong một hang động ở độ sâu 17-23


8

m (56-75 ft) ở Địa Trung Hải, thì việc ăn các động vật giáp xác và động vật nhỏ
thường xuyên hơn viêc ăn bằng cách lọc. Các loại hải miên ăn thịt động vật giáp
xác ,trong các hang đông, bằng cách chụp lấy chúng sau đó quấn lấy và tiêu hóa
chúng bằng cách bao bọc chúng trong một vài ngày, và sau đó quay trở lại hình
dạng bình thường của nó; không có bằng chứng cho thấy chúng sử dụng nọc độc [18].
Các loài hải miên ăn thịt được biết hầu hết đã hoàn toàn mất hệ thống dòng
chảy và choanocytes. Tuy nhiên các chi Chondrocladia sử dụng một hệ thống dòng
chảy đã đươc tiến hóa để làm tăng khả năng săn bắt con mồi [15][8].
- Vòng đời:
Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống trong ít nhất một vài năm, nhưng một
số loài sống ở vùng nhiệt đới và cũng có thể ở những đại dương sâu có thể sống 200
năm hoặc hơn. Một số bị vôi hóa demosponges chỉ tăng 0,2 mm (0,0079 in) mỗi
năm và nếu tỷ lệ đó là hằng số thì vật mẫu có kích thước 1 m (3.3 ft) phải được
khoảng 5.000 năm tuổi. Một số loài hải miên bắt đầu sinh sản hữu tính khi chỉ một
vài tuần tuổi, trong khi những loài khác chờ đợi cho đến khi vài năm tuổi [18].
- Kẻ thù:
Hải miên có kẻ thù là Sponge ruồi, còn được gọi là spongilla-ruồi (bộ cánh
gân , Sisyridae), là loài chuyên săn các loại hải miên nước ngọt. Con cái đẻ trứng
của mình trên thảm thực vật nước nhô. Ấu trùng nở và duy chuyển vào nước, sau đó
tìm hải miên để ăn. Chúng sử dụng phần miệng thuôn dài của chúng để xuyên qua
miếng mải miên và hút chất lỏng bên trong. Ấu trùng của một số loài bám vào bề
mặt của miếng hải miên trong khi những loài khác thì nương náu trong hốc trong
của miếng hải miên. Các ấu trùng trưởng thành hoàn toàn thoát ra khỏi nước và


ta

chia

ra

thành

Demospongiae

và

Homoscleromorpha. Gần đây họ đã công nhận Homoscleromorpha là lớp thứ tư của
hải miên [18][9].
Hải miên được chia thành các lớp chủ yếu theo các thành phần của xương theo
bảng sau:


10

Bảng 1.1. So sánh giữa các lớp hải miên.
Loài

Loại tế bào

Gai

Spongin Bộ xương
sợi


Demospongiae

Nhân đơn,
màng đơn
bên ngoài

Silica

Ở một số
loài.
Ở nhiều
Xuất xứ của
loài
aragonit nếu
có.

Homoscleromorpha

Nhân đơn,
màng đơn
bên ngoài

Silica

Ở nhiều Không bao
loài
giờ

Leuconoid

Loại nước
Ở biển

Hải miên
Ở biển
thủy tinh
Biển, nước lợ
Demospon
hoặc
nước
ges
ngọt

Độ sâu
ít hơn 100 m (330 ft)
Sâu

Loại bề
mặt
Cứng
Mềm hoặc
trầm tích

Một Demosponge ăn thịt đã được
Bất kỳ
tìm thấy tại 8840 m

1.1.3. Cấu tạo cơ thể

Mesohyl

Các loại tế bào sống và di chuyển trong mesohyl [9][10]:
•

Lophocytes là amip tế bào mà di chuyển chậm qua mesohyl và tiết ra các

sợi collagen.
•

Collencytes là một loại tế bào collagen sản xuất.

•

Rhabdiferous tế bào tiết ra polysaccharides đó cũng là một phần của

mesohyl.
•

Tế bào trứng và tinh trùng là những tế bào sinh sản.

•

Sclerocytes tiết ra các khoáng gai (gai nhỏ) đã hình thành bộ xương của

nhiều hải miên và trong một số loài này cung cấp một số bảo vệ chống lại kẻ thù..
•

Thêm vào hoặc thay vì sclerocytes, demosponges có spongocytes tiết ra

một dạng collagen polymerizes vào spongin, một loại vật liệu dạng sợi dày cứng
mesohyl.

pinacocytes.
Flagellum - cấu trúc giống như cái roi của một choanocyte; di chuyển roi, đẩy
nước (trong đó có chứa chất dinh dưỡng) thông qua các miếng hải miên.
Osculum - một cửa trong một miếng hải miên qua đó nước có thể chảy ra. Hải
miên có thể có nhiều hơn một oscula.
Pinacocyte - là tế bào mỏng, phẳng của lớp biểu bì, lớp ngoài của miếng hải
miên của các tế bào.
Porocyte - tế bào với lỗ chân lông cho phép nước vào miếng hải miên; chúng
được đặt trên khắp cơ thể của miếng Hải Miên.
Spicule - spicules là gai nhọn (calcium carbonate) nằm trong mesohyl.


14

Spicules tạo thành bộ xương của hải miên.
Spongin - các, sợi xơ linh hoạt tạo thành bộ khung của hải miên sừng; spongin
nằm trong mesohyl.
Spongocoel - các trung tâm, khoang mở trong một miếng hải miên, mà qua đó
nước chảy vào miếng hải miên. Nước chảy vào một miếng hải miên thông qua các tế
bào với các lỗ chân lông (các tế bào được gọi là porocytes) nằm trên khắp cơ thể của
nó. Nước chảy ra từ một miếng Hải Miên qua các lỗ hở lớn gọi oscula (số nhiều). Mỗi
một lỗ lớn được gọi là một osculum.

Hình 1.4. Giải phẩu cấu tạo cơ thể hải miên
Hầu hết các miếng xốp làm việc giống như ống khói: chúng lấy nước ở
phía dưới và đẩy nó từ osculum (miệng nhỏ) ở đầu. Kể từ môi trường xung quanh là
dòng nhanh hơn ở phía trên, các hiệu ứng hút mà họ sử dụng bằng nguyên lý
Bernoulli. Bọt biển có thể kiểm soát lưu lượng nước bằng cách kết hợp khác nhau
của toàn bộ hoặc một phần đóng osculum và Ostia (các lỗ chân lông hấp thu) và
thay đổi nhịp đập của hai roi, và có thể đóng cửa nếu có nhiều cát hoặc bùn trong

Sterol là rượu đa vòng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran. Các sterol
là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nóng…, không tan trong nước.
Đặc tính của sterol là không phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong
dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, dầu hỏa, benzen,
cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol ra khỏi
nguyên liệu. Đối với các sterol glycoside có thể chiết bằng ethanol. Sản phẩm chiết


16

bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém
phân cực khác có trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten,
leucithin (đối với sterol thực vật). Phải thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách
các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Thực hiện sắc
ký (cột, lớp mỏng, giấy,...) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol.
c) Nhóm hợp chất flavonoid:
Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật,
có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao. Flavonoid có khung cơ bản
là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu
trúc có thể là vòng kín hoặc mở. Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai
dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside). Trong đó, dạng
aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như
không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong
các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform.
d) Nhóm hợp chất saponin:
Saponin là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose,
galactose, pentose, metyl pentose,...) và phần sapogenin (aglycol). Phân sapogenin
có thể là steroid hay triterpenoid. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào
nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính
chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với