ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
W  X PHẠM THỊ ANH

PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH,THU NHẬN VÀ LÀM
GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC TRONG MỠ CÁ
BASA PANGASIUS BOCOURTI SAUVAGE KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC ĐỘNG VẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG

Lời mở đầu ..................................................................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO.............................................................................................................2
1.1.1. Lipid - Chất béo..............................................................................................................................2
1.1.1.1. Định nghĩa .....................................................................................................................................2
1.1.1.2. Phân loại ........................................................................................................................................2
1.1.1.3. Vai trò của lipid .............................................................................................................................3
1.1.1.4. Tính chất vật lý..............................................................................................................................3
1.1.2. Acid béo ............................................................................................................................................5
1.1.2.1. Công thức cấu tạo..........................................................................................................................5
1.1.2.2. Tính chất vật lý..............................................................................................................................5
1.1.2.3. Phân loại ........................................................................................................................................7
1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo ..............................................................................................................8
1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học .............................................................................................12
1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic ........................................................................................12
1.1.3.1. Cấu trúc hóa học..........................................................................................................................12
1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể ...............................................................................................13
a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh .............................................................................................. 13
b) Tác dụng đối với thị giác

và màng tế bào..............................................................................................13
c) Tác dụng đối với não ............................................................................................................................. 13
d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương ........................................................ 14
e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch ..................................................................................................... 14
f) Tác dụng đối với sự viêm ....................................................................................................................... 15
g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp .......................................................................................................... 15
h) DHA và bệnh ung thư............................................................................................................................16
i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn ..................................................................................................... 16
1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA ..........................................................................16

DỤNG CỤ - NGUYÊN LIỆU ........................................................................................................36
2.1.1. Dụng cụ...........................................................................................................................................36
2.1.2. Nguyên liệu.....................................................................................................................................36
2.2.
PHƯƠNG PHÁP ............................................................................................................................37
2.2.1. Phương pháp transester hóa.........................................................................................................37
2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................38
2.2.3. Phương pháp tạo phức giữa urê và các ester béo .......................................................................41
PHẦN III: KẾT QUẢ
3.1. Kết quả phản ứng transester hóa ................................................................................................43
3.1.1.. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol methanol/mol dầu cá ................................................................43
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa
.................................................................................................................................................44
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác ......................................................................................................45
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác....................................................................................46
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng....................................................................................47
3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo với urê ........................................................................49
PHẦN IV: KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................................................54
4.2. ĐỀ NGHỊ........................................................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 5
LỜI MỞ ĐẦU
Từ nhiều thập kỷ nay, vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu, đặc biệt là vấn đề chăm sóc trẻ em
- nguồn nhân lực tương lai của đất nước. Hiện nay, cùng với những bước chuyển mình mạnh mẽ của thế giới thì các căn
bệnh thời đại cũng có chiều hướng gia tăng. Chính vì vậy mà các sản phẩm trên thị trường đang được các nhà khoa học
ra sức nghiên cứu để bổ sung thêm các thành phần quý, có tác dụng làm suy giảm và ngăn ngừa bệnh tật, đồng thời còn


Lipid có đặc tính chung là không tan trong nước, tan trong dung
môi hữu cơ như chloroform, benzen, ether.
Lipid gồm các acid béo, glycerid, glycerol, phospholipid, sterol.
1.1.1.2.
Phân loại
[8]

a.
Dựa vào phản ứng xà phòng hóa
CH
2
O
R
1

O
C
O
R
2
CH
2
OC
O
R
3
CH
C
O

cách nhiệt tốt giữ thân nhiệt ổn định nên có ý nghĩa đặc biệt đối với động vật ngủ đông ở các xứ lạnh.
1.1.1.4.
Tính chất vật lý
[18]

 Chất béo có tỷ trọng thấp hơn nước (0,86 – 0,97).
 Chất béo không tan trong nước, khi trộn với nước sẽ tạo thành hai lớp: nước ở dưới và chất béo ở trên, đầu COO
-
tiếp
xúc với nước, đuôi kị nước nằm ở phía trên. Dưới tác động của các chất gây nhũ tương hóa như xà phòng (muối Na
+
hay
K
+
của acid béo bậc cao) hoặc acid mật hay muối mật (do gan tiết ra), chất béo bị chia nhỏ trông như dạng sữa gọi là dạng
nhũ tương bền. Nhờ vậy, xà phòng là chất tẩy rửa dầu mỡ sau các dung môi hữu cơ. Ngoài ra, điều đó cũng giải thích các
bệnh nhân bị bệnh gan phải hạn chế thức ăn chứa chất dầu mỡ, mỡ, vì ở các cơ thể này, dầu mỡ trong thức ăn không được
nhũ tương hóa, do đó lipase phân giải chậm. Lipid bao gồm các acid béo, các triglycerid, glycerol, các phospholipid và
các sterol, trong đó acid béo là thành phần chính quan trọng nhất.
 Tính chất của glycerid phụ thuộc vào thành phần acid béo của chúng, chiều dài mạch carbon và số lượng liên kết đôi
trong phân tử. Ví dụ về điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid như bảng 1. 7
Bảng 1: Điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid
Acid béo Điểm nóng chảy (
o
C) Triacylglycerol Điểm nóng chảy (
o
C)

)
n
─COOH
Số nguyên tử carbon trong acid béo thường là chẵn (14 - 22C). Các acid béo thường gặp có số carbon từ 16 - 18.
Số thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch hydrocarbon của acid béo được tính từ nguyên tử carbon của nhóm carboxyl.
H
3
C
ω
(CH
2
)
n
C
β
C
α
3
2
C
OH
O
1

Ký hiệu: α, β, γ, ω,….để chỉ thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch.
Về cơ bản acid béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên
tử hydrogen. Ở một đầu của phân tử được xác định là đầu alpha, gắn với một nhóm carboxyl (−COOH). Một đầu còn lại
của mạch là đầu cuối (omega), là nhóm methyl (−CH
3
). (Trong bảng chữ cái Hy Lạp α là ký tự đầu tiên và ω là ký tự

CH
2
(CH=CH
_
CH
2
)
3
(CH
2
)
6
COOH
Linoleic 18:2 n-6 CH
3
(CH
2
)
4
CH=CHCH
2
CH=CH(CH
2
)
7
COOH
Oleic 18:1 n-9 CH
3
(CH
2

2
)
14
COOH (C16)
Acid stearic: CH
3
(CH
2
)
16
COOH (C18)

b)
Acid béo bất bão hòa
 Acid béo bất bão hòa đơn (monounsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa một nối đôi trong cấu tạo của nó.
Ví dụ: Acid oleic: C18 có một nối đôi ở C9
Ký hiệu: C18∆
9

Công thức hóa học: CH
3
(CH
2
)
7
CH=CH(CH
2
)
7
COOH

Dạng cis (dạng thuyền) Dạng trans (dạng ghế)
Đối xứng qua mặt phẳng Đối xứng qua tâm
Khi đun nóng có mặt chất xúc tác thì dạng cis chuyển thành dạng trans.
Mạch carbon của acid béo no thường ở dạng zic zắc, kéo thành chuỗi dài không cong. Các acid béo không no, có
một liên kết đôi dạng cis thì mạch carbon bị uốn cong 30
o
, càng có nhiều liên kết đôi, mạch carbon càng bị uốn cong
nhiều hơn. Có giả thiết cho rằng mạch carbon của acid béo không no dạng cis có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh
học.
Theo Paul B.Kelter và cộng sự,
[14]
các nghiên cứu gần đây cho thấy các acid béo dạng trans- trong chế độ
ăn có thể liên quan đến sự gia tăng nguy cơ xảy ra các cơn đau tim. Các phân tử không thể chuyển từ dạng cis-
sang trans- hoặc ngược lại trong trường hợp bình thường. Khi có sự hydrogen hóa từng phần của acid béo được
thực hiện, vài nối đôi còn lại kết thúc ở dạng trans- hơn là dạng cis- ban đầu. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là
nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau.
Vị trí của các nối đôi trong chuỗi carbon của acid béo bất bão hòa đa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể
con người chuyển hóa chúng.
Các tế bào của cơ thể của con người chỉ có thể tạo nối đôi C=C trong acid béo kể từ carbon thứ 9 trở đi. Điều
này có nghĩa là cơ thể con người không thể tự tổng hợp được acid béo Ω-3 và Ω-6. Do đó 2 loại acid béo nay chỉ có thể
được lấy qua chế độ ăn hàng ngày.

1.1.2.4.
Nguồn hiện diện acid béo
[4]

Triglycerid là lipid dự trữ có trong mỡ động vật và dầu thực vật.
Trong thực vật: có nhiều ở nhiều cơ quan như củ, quả, hạt (như đã trình bày ở phần trên).
Ví dụ: Dầu chiếm 65-70% ở hạt thầu dầu; 40-63% ở hạt vừng; 40-60% ở hạt lạc; 18% ở hạt đậu tương.
Ở động vật: trong mô mỡ acid béo chiếm 70-97%; trong tủy sống 14-20% khối lượng tươi. Phần trăm acid béo


42

Từ hạt lạt

Dầu đậu tương
18,4

15,0

25

60

Từ hạt đậu tương

CC
H
2
CH
CH
2
H10
Dầu ngô
30 – 40

16,0

Dầu dừa
47,6

94,0

5

1
Từ cơm dừa già

Dầu cọ
44,63

50

40

10
Từ cơm dầu cọ

Mỡ cá ba sa
25

36

35,0

14,7

Từ mỡ phần (mỡ

Từ con bò Bảng 4: Các acid béo thường gặp
[28],[35]

Tên thông thường Số nguyên tử C Số nối đôi Tên khoa học Nguồn hiện diện
Acid butyric 4 0 Acid butanoic Bơ
Acid caproic 6 0 Acid hexanoic Bơ
Acid caprylic 8 0 Acid octanoic Dầu dừa
Acid capric 10 0 Acid decanoic Dầu dừa
Acid lauric 12 0 Acid dodecanoic Dầu dừa
Acid myristic 14 0 Acid tetradecanoic Dầu cọ
Acid palmitic 16 0 Acid hexadecanoic Dầu cọ
Acid palmitoleic 16 1 Acid 9-hexadecenoic Mỡ động vật
Acid stearic 18 0 Acid octadecanoic Mỡ động vật
Acid oleic 18 1 Acid 9-octadecenoic Dầu olive
Acid linoleic 18 2 Acid 9,12-octadecadienoic Dầu bắp
Acid alpha-linolenic (ALA) 18 3 Acid 9,12,15-octadecatrienoic Dầu hạt lanh
Acid arachidic 20 0 Acid eicosanoic Dầu phộng, dầu cá
Acid gadoleic 20 1 Acid 9-eicosenoic Dầu cá 11
Acid arachidonic (AA) 20 4
Acid 5,8,11,14-
eicosatetraenoic
Mỡ gan
Acid eicosapentaenoic (EPA) 20 5
Acid 5,8,11,14,17-

Acid 5,8,11,14-
eicosatetraenoic
Acid arachidonic 20:4 (n-6) 304,5 -50
Acid 7,10,13,16-
docosatetraenoic
- 22:4 (n-6) 332,6
Acid 4,7,10,13,16-
docosapentaenoic
- 22:5 (n-6) 330,6
Acid 9,12,15-
octadecatrienoic
Acid α-linolenic 18:3 (n-3) 278,4 -11
Acid 6,9,12,15-
octadecatetraenoic
Acid stearidonic 18:4 (n-3) 276,4 -57
Acid 8,11,14,17-
eicosatetraenoic
- 20:4 (n-3) 304,5
Acid 5,8,11,14,17-
eicosapentaenoic
EPA 20:5 (n-3) 302,5 -54 12
Acid 7,10,13,16,19-
docosapentaenoic
DPA 22:5 (n-3) 330,6
Acid 4,7,10,13,16,19-
docosahexaenoic
DHA 22:6 (n-3) 328,6 -44

3
(CH
2
-CH=CH)
6
(CH
2
)
2
COOH
Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -44
0
C. DHA còn được kí hiệu là 22:6 n-3 và trong
tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic.

Hình 1: Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic.
[1]
1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể
a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh
[25]
13
Trẻ sơ sinh không có khả năng chuyển tiền tố DHA từ dầu thực vật hay thức ăn thay thế sữa mẹ khác sang DHA
nên người mẹ phải làm động tác trung chuyển đó, bằng cách sử dụng nhiều các sản phẩm có chứa DHA rồi cho con bú.
Sự phụ thuộc vào DHA nhiều nhất là ở bào thai trong suốt 3 tháng cuối thai kỳ và trẻ sơ sinh trong suốt ba tháng đầu sau
khi sinh. Trong sữa mẹ chứa: 12% acid linoleic, 0,5% acid alpha linolenic, 0,6% acid arachidonic, 0,3% DHA trong tổng
số trong lượng acid béo.
b) Tác dụng đối với thị giác

nhiều ít, ta có lipoprotein tỷ lệ thấp LDL (Low density lipoprotein), hay tỷ lệ cao HDL (high density lipoprotein).
HDL đưa cholesterol vào tích trữ trong gan để rồi được phế thải ra khỏi cơ thể, do đó làm bớt mỡ lưu thông
trong máu, giảm nguy cơ đóng mỡ ở thành động mạch, giảm nguy cơ bệnh vữa xơ động mạch.
Ngược lại LDL chuyển cholesterol vào các tế bào của cơ thể. Khi cholesterol trong máu lên cao, tế bào không đủ
chỗ nhận cholesterol, hóa chất này sẽ lởn vởn trong máu và tăng gia sự đóng bựa ở thành động mạch.
DHA hạ thấp lượng triglyceride, làm tăng độ lỏng của màng tế bào hồng cầu, từ đó làm tăng độ biến dạng, khả
năng linh hoạt để chúng có thể di chuyển dễ dàng qua các mao mạch, dẫn đến việc giảm độ nhớt của máu và giảm huyết
áp. DHA làm giảm huyết áp bằng cách giảm hàm lượng cortisol trong máu.

e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch
[10],[39]
14
Trong bệnh vữa xơ động mạch, thành động mạch có những bựa giống như cháo gồm có cholesterol và tế bào
máu đóng vào, khiến nó trở nên gồ ghề, thu hẹp gây trở ngại cho sự vận chuyển của máu. Máu huyết tới tim giảm, tim
kém được nuôi dưỡng, giảm hoạt động rồi một lúc nào đó đưa đến cơn kích tim. Những miếng bựa có thể bứt rời thành
mạch máu, ngao du khắp cơ thể theo hệ tuần hoàn gây ra nghẽn mạch. Lên đến não nó tạo ra tai biến mạch máu não, tới
tim nó gây ra nhồi máu cơ tim.
DHA có tác dụng ngăn ngừa tiểu huyết cầu dính với nhau, và còn có tác dụng ngăn các mảng vụn bám vào vách
mạch máu do đó giúp mạch máu khỏi bị nghẽn, tránh được nguy cơ nhồi máu cơ tim. DHA tinh khiết còn làm giảm độ
nhớt của máu. DHA và EPA (acid eicosapenraenoic) trong màng tế bào tim được phóng thích khi có sự thiếu hụt của
dòng máu đi đến một phần của tim. Hai loại acid này bảo vệ những tế bào tim khỏi việc tham gia vào hoạt động nhanh
của tim, liên quan đến sự gia tăng nguy cơ đột tử.
f) Tác dụng đối với sự viêm
[22],[25]

Dầu cá được sử dụng như là một chất chống viêm trong bệnh viêm khớp mãn tính. Mặc dù DHA dễ bị oxide hóa
hơn acid arachidonic (AA), các sản phẩm phân hủy của AA (endoperoxide và eicosanoid) tạo ra nhiều gốc tự do hơn sản


DHA được tìm thấy nhiều ở cá, đặc biệt là các loại cá béo, chứa nhiều mỡ và dầu như cá trích, cá thu, cá mòi, cá
hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải cũng chứa tiền 15
chất của DHA là α-linolenic acid. Ngoài ra, DHA cũng là một trong những acid béo chính trong thành phần acid béo của
một số loài vi nấm sống ở biển như Tharaustochytrium roseum, T. aureum và Schizochytrium aggeratum.
[2]

Hiện nay, dầu cá là nguồn thu nhận DHA chủ yếu, nhưng DHA cũng có thể được sản xuất bằng cách sử dụng vi
sinh vật. Các vi sinh vật biển có thể chứa một lượng lớn DHA và được xem như là nguồn thu nhận hiệu quả của acid béo
quan trọng này. Vài loài trong đó có thể tăng trưởng theo lối dị dưỡng trên những chất nền hữu cơ ở điều kiện không có
ánh sáng (như vi tảo crypthecodinium cohnii). Gần đây đã có nhiều tiến bộ trong việc sản xuất DHA trong công nghệ sinh
học từ các vi sinh vật biển.
[5],[11]

Như vậy, DHA có trong mỡ cá vùng biển sâu, vùng Green land Nhật Bản, hoặc đi theo con đường tổng hợp
nhưng hiện nay đã xác định được trong thành phần mỡ cá basa Việt Nam (Pangasius baucourti) cá nước ngọt, nuôi bè
trên dòng sông Mêkông không những có đủ thành phần acid béo không no – acid béo thiết yếu mà còn có thành phần
DHA.
Ở Việt Nam hiện nay phát hiện có 2 loại cá chứa DHA đó là cá tra và cá ba sa với thành phần chất béo như bảng
6.
Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng của cá tra, cá basa
[30]

Thành phần dinh dưỡng trên 100g sản phẩm ăn được
Tên
Calo (cal)
Calo từ

C, làm lạnh trong 18 giờ ở 16
o
C, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 13
o
C qua
đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được
trích ly với ether, làm khan dung dịch ether với Na
2
SO
4
và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và
được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và
loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử.
1.2.2.
Phương pháp sắc kí khí định lượng (preparative scale gas chromatography)
[16]

Dầu gan cá tuyết chứa 3 loại acid béo không bão hòa cần thiết (C18:4, C20:5, C22:6) được xà phòng hóa, và acid
được tìm thấy có chỉ số iod là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và 0,07% nối ba liên hợp,
những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng phương pháp urea – MeOH và
hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iod 401. Hỗn hợp này được ester hóa với MeOH-H
2
SO
4
và hỗn hợp ester qua
sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4, 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6, trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách.
Sắc kí định lượng được tiến hành trên cột cao 152,4 cm được nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là
150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp là 225
o
C. Phân đoạn thu được có thể được là tinh sạch hơn bằng sắc kí cột.