ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
W  X PHẠM THỊ ANH

PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH,THU NHẬN VÀ LÀM
GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC TRONG MỠ CÁ
BASA PANGASIUS BOCOURTI SAUVAGE KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC ĐỘNG VẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG

Lời mở đầu 1
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO 2
1.1.1. Lipid - Chất béo 2
1.1.1.1. Định nghĩa 2
1.1.1.2. Phân loại 2
1.1.1.3. Vai trò của lipid 3
1.1.1.4. Tính chất vật lý 3
1.1.2. Acid béo 5
1.1.2.1. Công thức cấu tạo 5
1.1.2.2. Tính chất vật lý 5
1.1.2.3. Phân loại 7
1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo 8
1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học 12
1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic 12
1.1.3.1. Cấu trúc hóa học 12
1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể 13
a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh 13
b) Tác dụng đối với thị giác

và màng tế bào 13
c) Tác dụng đối với não 13
d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương 14
e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch 14
f) Tác dụng đối với sự viêm 15
g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp 15
h) DHA và bệnh ung thư 16
i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn 16
1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA 16

2.1.2. Nguyên liệu 36
2.2. PHƯƠNG PHÁP 37
2.2.1. Phương pháp transester hóa 37
2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 38
2.2.3. Phương pháp tạo phức giữa urê và các ester béo 41
PHẦN III: KẾT QUẢ
3.1. Kết quả phản ứng transester hóa 43
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol methanol/mol dầu cá 43
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa
44
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác 45
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác 46
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng 47
3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo với urê 49
PHẦN IV: KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 54
4.2. ĐỀ NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 5
LỜI MỞ ĐẦU
Từ nhiều thập kỷ nay, vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu, đặc biệt là vấn đề chăm sóc trẻ em
- nguồn nhân lực tương lai của đất nước. Hiện nay, cùng với những bước chuyển mình mạnh mẽ của thế giới thì các căn
bệnh thời đại cũng có chiều hướng gia tăng. Chính vì vậy mà các sản phẩm trên thị trường đang được các nhà khoa học
ra sức nghiên cứu để bổ sung thêm các thành phần quý, có tác dụng làm suy giảm và ngăn ngừa bệnh tật, đồng thời còn
có ích cho việc phát triển trí não và tư duy của trẻ.

Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy nguồn acid béo bất bão hòa trong mỡ cá rất dồi dào trong đó có DHA, và ở Việt

1.1.1.2. Phân loại
[8]

a. Dựa vào phản ứng xà phòng hóa
CH
2
O
R
1

O
C
O
R
2
CH
2
OC
O
R
3
CH
C
O6
Lipid xà phòng hóa được. Nhóm này gồm các glycerid, glycerophospholipid và sáp nghĩa là những lipid mà
trong phân tử có chứa este của acid béo cao phân tử.
Lipid không xà phòng hóa được. Tức là những lipid trong phân tử không chứa chức este, nhóm này gồm các

+
hay
K
+
của acid béo bậc cao) hoặc acid mật hay muối mật (do gan tiết ra), chất béo bị chia nhỏ trông như dạng sữa gọi là dạng
nhũ tương bền. Nhờ vậy, xà phòng là chất tẩy rửa dầu mỡ sau các dung môi hữu cơ. Ngoài ra, điều đó cũng giải thích các
bệnh nhân bị bệnh gan phải hạn chế thức ăn chứa chất dầu mỡ, mỡ, vì ở các cơ thể này, dầu mỡ trong thức ăn không được
nhũ tương hóa, do đó lipase phân giải chậm. Lipid bao gồm các acid béo, các triglycerid, glycerol, các phospholipid và
các sterol, trong đó acid béo là thành phần chính quan trọng nhất.
 Tính chất của glycerid phụ thuộc vào thành phần acid béo của chúng, chiều dài mạch carbon và số lượng liên kết đôi
trong phân tử. Ví dụ về điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid như bảng 1. 7
Bảng 1: Điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid
Acid béo Điểm nóng chảy (
o
C) Triacylglycerol Điểm nóng chảy (
o
C)
Palmitat 63,1 Tripalmitin
≈ 80
Stearat 69,6 Tristearin
≈ 80
Oleat 13,4 Triolein 0

Mỡ động vật chứa nhiều acid béo no, trong nhiệt độ bình thường ở trạng thái rắn, nhất là mỡ bò, mỡ cừu. Dầu
thực vật cũng tùy theo tỷ lệ giữa acid béo no và không no, có điểm nóng chảy khác nhau. Ví dụ dầu ca cao chứa 35%
palmitat và 40% stearat có điểm nóng chảy là 30 - 34
o

)
n
C
β
C
α
3
2
C
OH
O
1

Ký hiệu: α, β, γ, ω,….để chỉ thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch.
Về cơ bản acid béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên
tử hydrogen. Ở một đầu của phân tử được xác định là đầu alpha, gắn với một nhóm carboxyl (−COOH). Một đầu còn lại
của mạch là đầu cuối (omega), là nhóm methyl (−CH
3
). (Trong bảng chữ cái Hy Lạp α là ký tự đầu tiên và ω là ký tự
cuối).

1.1.2.2. Tính chất vật lý
[18], [8]

Các phân tử acid béo bão hòa có mạch thẳng, thường dễ gắn chặt với nhau. Ngược lại, các phân tử acid béo bất
bão hòa có cấu tạo lệch, do đó chỉ gắn với nhau một cách lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ hơn hơn các acid béo bão
hòa. Vì vậy các chất béo giàu acid béo bất bão hòa có nhiệt độ tan chảy thấp hơn các chất béo giàu acid béo bão hòa (đặc
biệt các acid béo có chuỗi carbon dài hơn 12 carbon). Tóm lại, mỡ hoặc dầu được phân loại thành bão hòa, bất bão hòa
đơn hay bất bão hòa đa dựa trên hàm lượng cao hoặc thấp của các loại acid béo hiện diện.
Chiều dài của mạch carbon trong acid béo ảnh hưởng đến độ rắn chắc của triglycerid ở nhiệt độ thường. Cụ thể,

COOH
Linoleic 18:2 n-6 CH
3
(CH
2
)
4
CH=CHCH
2
CH=CH(CH
2
)
7
COOH
Oleic 18:1 n-9 CH
3
(CH
2
)
7
CH=CH(CH
2
)
7
COOH
(Ghi chú: Trong cách viết ký hiệu của acid béo, số thứ nhất biểu thị số carbon, số thứ hai biểu thị số nối đôi và n- (hay
ω
-
) chỉ nhóm của acid béo bất bão hòa. Cũng có thể sử dụng những cách viết khác, ví dụ như acid oleic có thể được ký hiệu
là C18:1 hoặc 18:1.)

 Acid béo bất bão hòa đơn (monounsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa một nối đôi trong cấu tạo của nó.
Ví dụ: Acid oleic: C18 có một nối đôi ở C9
Ký hiệu: C18∆
9

Công thức hóa học: CH
3
(CH
2
)
7
CH=CH(CH
2
)
7
COOH
 Acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa hai nối đôi trở lên.
Ví dụ: Acid linolenic: C18 có ba nối đôi ở C9, C12, C15
Ký hiệu : C18∆9, 12, 15 9
Công thức hóa học:
CH
3
(CH
2
)
7
CH=CHCH

thực hiện, vài nối đôi còn lại kết thúc ở dạng trans- hơn là dạng cis- ban đầu. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là
nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau.
Vị trí của các nối đôi trong chuỗi carbon của acid béo bất bão hòa đa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể
con người chuyển hóa chúng.
Các tế bào của cơ thể của con người chỉ có thể tạo nối đôi C=C trong acid béo kể từ carbon thứ 9 trở đi. Điều
này có nghĩa là cơ thể con người không thể tự tổng hợp được acid béo Ω-3 và Ω-6. Do đó 2 loại acid béo nay chỉ có thể
được lấy qua chế độ ăn hàng ngày.

1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo
[4]

Triglycerid là lipid dự trữ có trong mỡ động vật và dầu thực vật.
Trong thực vật: có nhiều ở nhiều cơ quan như củ, quả, hạt (như đã trình bày ở phần trên).
Ví dụ: Dầu chiếm 65-70% ở hạt thầu dầu; 40-63% ở hạt vừng; 40-60% ở hạt lạc; 18% ở hạt đậu tương.
Ở động vật: trong mô mỡ acid béo chiếm 70-97%; trong tủy sống 14-20% khối lượng tươi. Phần trăm acid béo
chứa trong một số loại thức ăn điển hình, acid béo bất bão hòa thường gặp được trình bày trong bảng 3, 4, 5.
Bảng 3: Phần trăm acid béo chứa trong một số loại thức ăn điển hình
[4]
Acid béo không no
Nguyên liệu
Hàm lượng
chất béo (%)
Acid béo no (%)
Loại một nối
đôi (%)
Loại nhiều
nối đôi (%)
Ghi chú
Dầu mè
46,4 – 56


CC
H
2
CH
CH
2
H10
Dầu ngô
30 – 40

16,0

30

54

Từ phôi

Dầu cám gạo
16 – 18

20,0

40

40

40

10
Từ cơm dầu cọ

Mỡ cá ba sa
25

36

35,0

14,7

Từ mỡ phần (mỡ
trong)

Bơ
83,5

66

30

4
Tách từ sữa

Mỡ lợn
20 – 30


Acid stearic 18 0 Acid octadecanoic Mỡ động vật
Acid oleic 18 1 Acid 9-octadecenoic Dầu olive
Acid linoleic 18 2 Acid 9,12-octadecadienoic Dầu bắp
Acid alpha-linolenic (ALA) 18 3 Acid 9,12,15-octadecatrienoic Dầu hạt lanh
Acid arachidic 20 0 Acid eicosanoic Dầu phộng, dầu cá
Acid gadoleic 20 1 Acid 9-eicosenoic Dầu cá 11
Acid arachidonic (AA) 20 4
Acid 5,8,11,14-
eicosatetraenoic
Mỡ gan
Acid eicosapentaenoic (EPA) 20 5
Acid 5,8,11,14,17-
eicosapentaenoic
Dầu cá
Acid behenic 22 0 Acid docosanoic Hạt cải dầu
Acid erucic 22 1 Acid 13-docosenoic Hạt cải dầu
Acid docosahexaenoic
(DHA)
22 6
Acid 4,7,10,13,16,19-
docosahexaenoic
Dầu cá
Acid lignoceric 24 0 Acid tetracosanoic Mỡ các loại

Bảng 5: Các acid béo bất bão hòa thường gặp
[28]


Acid 8,11,14,17-
eicosatetraenoic
- 20:4 (n-3) 304,5
Acid 5,8,11,14,17-
eicosapentaenoic
EPA 20:5 (n-3) 302,5 -54 12
Acid 7,10,13,16,19-
docosapentaenoic
DPA 22:5 (n-3) 330,6
Acid 4,7,10,13,16,19-
docosahexaenoic
DHA 22:6 (n-3) 328,6 -44
Acid 6,9,12,15,18,21-
tetracosenoic
Acid nisinic 24:6 (n-3) 356,6
Acid 5,8,11-
eicosatrienoic
Acid mead 20:3 (n-9) 306,5 1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học
[23]

 Thành phần cơ bản của lipid và chất béo
 Thành phần quan trọng trong cấu trúc màng tế bào.
 Giúp cho sự vận chuyển các chất dinh dưỡng hòa tan trong chất béo ngang qua màng tế bào cũng như trong
máu.

[1]
1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể
a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh
[25]
13
Trẻ sơ sinh không có khả năng chuyển tiền tố DHA từ dầu thực vật hay thức ăn thay thế sữa mẹ khác sang DHA
nên người mẹ phải làm động tác trung chuyển đó, bằng cách sử dụng nhiều các sản phẩm có chứa DHA rồi cho con bú.
Sự phụ thuộc vào DHA nhiều nhất là ở bào thai trong suốt 3 tháng cuối thai kỳ và trẻ sơ sinh trong suốt ba tháng đầu sau
khi sinh. Trong sữa mẹ chứa: 12% acid linoleic, 0,5% acid alpha linolenic, 0,6% acid arachidonic, 0,3% DHA trong tổng
số trong lượng acid béo.
b) Tác dụng đối với thị giác
[1]
và màng tế bào
[26]

Sự cạn kiệt DHA ảnh hưởng đến các thụ thể nằm trên màng là rhodopsin và làm thay đổi chức năng của nó. Sự
thiếu DHA làm giảm hoạt động thần kinh của võng mạc, làm giảm độ nhạy của thị giác, làm thay đổi những phản ứng
hành vi và gây ra những cơn khát bất thường, và cả những phản ứng bất thường về thính giác và khứu giác. Những sự bất
thường này có thể được gây ra do những receptor bề mặt bị ảnh hưởng do thiếu DHA.
Khi được ester hóa vào trong những phospholipid màng, DHA làm thay đổi một cách đáng kể nhiều tính chất cơ
bản của màng tế bào. Sự tương tác của DHA với những lipid khác trên màng, đặc biệt là cholesterol, có thể đóng một vai
trò nổi bật trong việc điều hòa cấu trúc và chức năng cục bộ của màng. DHA giúp giảm 50% nguy cơ mắc bệnh cận thị
khi lớn lên.
c) Tác dụng đối với não
[38],[27],[36]

Não được tạo nên từ hàng tỷ tế bào thần kinh gọi là neuron. Cấu tạo gồm vỏ myelin phủ lên đầu axon của tế bào

máu đóng vào, khiến nó trở nên gồ ghề, thu hẹp gây trở ngại cho sự vận chuyển của máu. Máu huyết tới tim giảm, tim
kém được nuôi dưỡng, giảm hoạt động rồi một lúc nào đó đưa đến cơn kích tim. Những miếng bựa có thể bứt rời thành
mạch máu, ngao du khắp cơ thể theo hệ tuần hoàn gây ra nghẽn mạch. Lên đến não nó tạo ra tai biến mạch máu não, tới
tim nó gây ra nhồi máu cơ tim.
DHA có tác dụng ngăn ngừa tiểu huyết cầu dính với nhau, và còn có tác dụng ngăn các mảng vụn bám vào vách
mạch máu do đó giúp mạch máu khỏi bị nghẽn, tránh được nguy cơ nhồi máu cơ tim. DHA tinh khiết còn làm giảm độ
nhớt của máu. DHA và EPA (acid eicosapenraenoic) trong màng tế bào tim được phóng thích khi có sự thiếu hụt của
dòng máu đi đến một phần của tim. Hai loại acid này bảo vệ những tế bào tim khỏi việc tham gia vào hoạt động nhanh
của tim, liên quan đến sự gia tăng nguy cơ đột tử.
f) Tác dụng đối với sự viêm
[22],[25]

Dầu cá được sử dụng như là một chất chống viêm trong bệnh viêm khớp mãn tính. Mặc dù DHA dễ bị oxide hóa
hơn acid arachidonic (AA), các sản phẩm phân hủy của AA (endoperoxide và eicosanoid) tạo ra nhiều gốc tự do hơn sản
phẩm của DHA nhưng DHA cũng ức chế sự tổng hợp nitric oxide (làm giảm sự hình thành các gốc tự do peroxynitrite) và
ức chế sự phiên mã yếu tố NF-κB (giảm sự hình thành các cytokine tiền phản ứng viêm).
Các cytokine và các yếu tố điều hòa sự viêm khác như interleukin IL và yếu tố hoại tử khối u TNF có một hoạt
động tế bào tiền phản ứng viêm. DHA cùng với acid eicosapentaenoic ức chế sự hình thành các cytokine IL-1β và TNF-α
qua một cơ chế hiện vẫn chưa được biết đến.
g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp
[10]

DHA có khả năng ngăn chặn phản ứng của hệ miễn dịch gây ra chứng viêm khớp, khiến khớp bớt cứng và sưng,
làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh này. Một số công trình nghiên cứu khi cho bệnh nhân dùng những liều dầu cá
từ 2-4g, thậm chí 5g/ngày, đã cho một số kết quả khá hứa hẹn: khớp bớt cứng và ít đau hơn.
h) DHA và bệnh ung thư
[3]

Noding và các cộng sự đã quan sát được rằng sự nhạy cảm của các tế bào khối u in vitro đối với DHA và những
sản phẩm oxid hóa của DHA phụ thuộc vào trạng thái chống khối u. Có bằng chứng đề nghị rằng các ω-3 LC PUFAS,


Như vậy, DHA có trong mỡ cá vùng biển sâu, vùng Green land Nhật Bản, hoặc đi theo con đường tổng hợp
nhưng hiện nay đã xác định được trong thành phần mỡ cá basa Việt Nam (Pangasius baucourti) cá nước ngọt, nuôi bè
trên dòng sông Mêkông không những có đủ thành phần acid béo không no – acid béo thiết yếu mà còn có thành phần
DHA.
Ở Việt Nam hiện nay phát hiện có 2 loại cá chứa DHA đó là cá tra và cá ba sa với thành phần chất béo như bảng
6.
Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng của cá tra, cá basa
[30]

Thành phần dinh dưỡng trên 100g sản phẩm ăn được
Tên
Calo (cal)
Calo từ
chất béo
Tổng lượng
chất béo (g)
Chất béo bão
hòa (g)
Cholesterol
(mg)
Natri (mg) Protein (g)
Cá tra 124,52 30,84 3,42 1,64 25,2 70,6 23,42
Cá basa 170 60 7 2 22 70,6 28

Qua bảng 6 nhận thấy rằng nguồn dinh dưỡng của cá ba sa nhiều hơn đặc biệt là tổng lượng chất béo, đó là lý do
hiện nay ở nước ta đang cố gắng làm giàu DHA, tiến tới tách DHA từ mỡ cá basa dần dần khỏi phải nhập ngoài, để bổ
sung vào sản phẩm thực phẩm nhằm góp phần cho con em chúng ta sau này thông minh hơn, khỏe mạnh hơn.

Hình 2: Cá tra

được tìm thấy có chỉ số iod là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và 0,07% nối ba liên hợp,
những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng phương pháp urea – MeOH và
hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iod 401. Hỗn hợp này được ester hóa với MeOH-H
2
SO
4
và hỗn hợp ester qua
sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4, 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6, trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách.
Sắc kí định lượng được tiến hành trên cột cao 152,4 cm được nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là
150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp là 225
o
C. Phân đoạn thu được có thể được là tinh sạch hơn bằng sắc kí cột.
1.2.3. Phương pháp sắc kí cột (column chromatography)
[12]

Các acid béo bất bão hòa và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc kí cột sử dụng CO
2
siêu tới hạn hoặc
CO
2
lỏng như là pha động và oxid nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Việc xử lý trước, tốt nhất là với NaOH trong
dung môi nước hữu cơ, cho thấy những kết quả được cải thiện với acid béo bất bão hòa đa.
Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương
đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa
ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate và cột được giải
li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester.
Phương pháp sắc kí cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl
ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0,5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml
nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong
cuộn nhôm để tránh ánh sáng.

2
) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả
trong việc sử dụng SC-CO
2
và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo
sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33
o
C và áp suất thấp 17.7MPa để tránh sự oxid hóa các acid béo bất bão hòa đa.
Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO
2
. Lượng phospholipid được trích ly
tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận).
Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO
2
lỏng siêu tới hạn”
(Supercritical Fluid CO
2
Extraction Machine). Ba mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), ba mức nhiệt độ khác
nhau (35, 40 và 45
o
C) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng
nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 40
o
C và 300 phút.
1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc (silver nitrate method)
[8]

Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật
là phương pháp sắc kí lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4%
trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục

2
H
OH
OH
OH R
1
COOR
R
2
COOR
R
3
COOR
xuùc taùc
CH
2
O R
1

O
C
O
R
2
CH
2
OC
O
R
3

Xúc tác bazơ thường được sử dụng trong công nghiệp như: NaOH, KOH, Carbonat kim loại kiềm, CH
3
ONa,…
Trong đó, CH
3
ONa được xem là xúc tác hoạt động tốt nhất (cho hiệu suất trên 98% trong 30 phút với một lượng nhỏ
0,5%).
a) Ưu điểm:
- Xúc tác bazơ ít có tính ăn mòn đồng thời cũng thúc đẩy tiến trình xảy ra nhanh hơn khi so sánh với xúc tác
acid.
- Giá thành rẻ (KOH, NaOH). Việc tăng nồng độ xúc tác lên khoảng 1% hoặc 2% là có hiệu suất cao không kém
gì alkoxid kim loại.
- K
2
CO
3
được dùng với nồng độ 2% hoặc 3% cũng cho hiệu suất cao đồng thời tránh được sự thủy phân ester do
bicarbonat được tạo thành thay vì nước ở xúc tác hydroxyd. 19
b) Nhược điểm:
- KOH và NaOH với giá thành rẻ nhưng kém hoạt động hơn K
2
CO
3
, CH
3
ONa. Tuy nhiên, với loại xúc tác
hyroxyd này sẽ làm sản sinh ra một lượng nước ngay cả trong môi trường khan nước ban đầu (do phản ứng với rượu),

của enzym cao, tỷ lệ chất nền, và thời gian ủ tăng thì sự hợp thành DHA cũng tăng. Trong một tiến trình phản ứng sự hợp
thành DHA tăng lên 25,2% sau 24giờ. Cao nhất là 37,4% khi tỷ lệ dầu cây anh thảo/DHA là 1/3.
Cây anh thảo
[42]
(Oenothera biennis L.) là cây hai năm thuộc họ dừa nước (Onagraceae) là một loại cây thông
thường sống ở Bắc Mỹ. Điều thú vị là dầu anh thảo có chứa γ-linolenic acid (GLA; 18:3 ω-6) (Senanayake và Shahidi,
1999a).
Ưu điểm:
[14]

Đa số các enzym làm xúc tác đều được thực hiện ở điều kiện bình thường (nhiệt độ phản ứng là 20-40
o
C),
không tốn năng lượng và không đòi hỏi thiết bị phức tạp. Các chất thải enzym dễ bị phân hủy nên không gây ô nhiễm môi
trường. Hiệu lực xúc tác của enzym lại rất lớn (vận tốc phản ứng gấp 10
8
-10
11
lần) so với những phản ứng dùng xúc tác
hóa học thông thường.
Nhược điểm:
[14]

Mỗi loại enzym chỉ xúc tác nên một số chất nền và kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử. Ngoài ra, việc sử
dụng xúc tác enzym có mặt hạn chế là thời gian phản ứng rất lâu (20 giờ). Đồng thời phải tìm được loại enzym phù hợp
với đối tượng nghiên cứu.
20

CO
3
(0,1125 mol), pH = 8-10.
Trong phần thực nghiệm này chúng tôi không sử dụng xúc tác là Zeolit vì qui trình tổng hợp hơi phức tạp.
Chúng tôi sử dụng loại xúc tác có sẵn là bazơ (KOH, NaOH) rẻ tiền và kinh tế với hàm lượng nhỏ khoảng 1-2%.

1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA
1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột
[12]

Theo Teshima, S. et al
[40]
, mô tả về phương pháp cô lập của EPA và DHA từ dầu cá bằng xà phòng hóa với
ethanol xúc tác KOH. Phần metyl ester của acid béo thô được làm tinh bằng sắc kí cột trên silica gel và sau đó EPA được
phân chia ra khỏi DHA bằng sắc kí cột trong hỗn hợp bạc nitrat và silica gel.
Sắc ký pha lỏng trên cột (Sắc ký cột hở) là tên gọi chung cho một số hệ thống vật lý trong đó một cột được nạp
chặt chẽ bởi chất hấp thu và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua.
Sắc ký cột nhanh khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc giải ly của
pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được.
Ưu điểm của sắc ký nhanh cột khô là nhờ có lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly nên thời gian triển khai
nhanh hơn sắc ký cột cổ điển. Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thuận lợi là sử dụng các thiết bị có sẵn trong phòng thí
nghiệm (phễu, bình tam giác, vòi nước tạo áp suất kém.v.v…).
Hệ thống bao gồm: phễu lọc xốp thủy tinh loại 150ml, fiole, và hệ thống tạo áp suất bằng vòi nước (20-70
mmHg).
Chất hấp thu là silica gel khô vào phễu đến tận miệng, gõ nhẹ ngoài thành phễu để chất hấp thu gọn lại. Gắn
phễu vào hệ thống tạo áp suất kém và dùng nút thủy tinh có đáy bằng để nén ép đều silica gel xuống đáy phễu, tạo thành
một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều cao của chất hấp thu sau khi nén cao khoảng 5cm.
Tiền giải ly cột bằng ether dầu hỏa. Rót dung môi lên đầu cột, gắn vào hệ thống tạo áp suất kém, dung môi sẽ đi
xuống xuyên qua cột. Thực hiện vài lần để có cột đồng nhất.
Cột được rút khô, tắt áp suất kém.

Phương pháp:
Metyl ester (100mg) trộn trong hexan (4ml), methanol (1ml) và urê (1,5g). Để qua đêm, phần rắn được lọc ra khỏi
dung dịch và rửa với hexan, phần được rửa và phần lọc trộn chung rồi rửa lại với nước, làm khô bằng muối sulfat natri
khan và làm bay hơi. Còn lại phần bất bão hòa và/hoặc có phân nhánh.
Một phương pháp khác từ Shucheng Liu và cộng sự
[43]
: Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự
do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng
kết hợp với khuấy kỹ ở 60 – 70
o
C đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Ban đầu để kết tinh ở nhiệt độ phòng sau đó ở
các nhiệt độ khác nhau (25
o
C, 15
o
C, 0
o
C, -15
o
C, -25
o
C). Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất
là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -5
o
C trong 20 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng
phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H
2
SO
4
đậm đặc sao

Các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết chính có Rf khoảng từ
0,3 - 0,7).
Mỗi hợp chất sẽ cho một vết, với giá trị Rf khơng đổi, trong một hệ giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lơ sản xuất
nhất định. Rf được tính bằng cơng thức: Mục đích chính của sắc ký lớp mỏng trong bài thực nghiệm này là để theo dõi diễn tiến của q trình transester
hóa .
Sắc ký lớp mỏng có các ưu điểm:
¾ Mẫu để phân tích chỉ cần một lượng rất ít.
¾ Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích.
¾ Việc triển khai sắc ký nhanh, nên trong một thời gian ngắn có thể biết kết quả mẫu cần phân tích.
¾ Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
¾ Sau q trình giải ly, dung mơi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hoặc hóa học để phát
hiện sự hiện diện chất, nên khơng phải lo đến vấn đề hậu sắc ký như ở sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

1.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CÁ BASA Ở VIỆT NAM
1.4.1. Phân loại
[17]

Cá Basa là một trong số 11 lồi thuộc họ Cá tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sơng Cửu Long.
 Giới động vật Animalia
Rf
Khoảng đường di chuyển của hợp chất
Khoảng đường di chuyển của dung môi
Rf

1
mỡ thực phẩm. Chủ yếu là chiên mỡ cá, bằng gia nhiệt trực tiếp thành dạng lỏng, sau đó đem trộn với mỡ heo bán cho tư
nhân hoặc bán ở vùng cao, Campuchia, Trung Quốc… Ngoài ra, mỡ cá thô sau khi tinh luyện làm dầu thực phẩm, được
phối trộn sử dụng thay thế shortening- một loại mỡ để chiên mì ăn liền hay đem phối chế sản xuất margarin.
1.4.3.1. Tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá basa
[32]

Qui trình công nghệ chiết tách mỡ lỏng từ mỡ cá basa được trình bày trong sơ đồ 1. Tỷ lệ acid béo không bão
hòa và bão hòa có trong nguyên liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô được trình bày trong bảng 8. Nhận xét với loại cá basa
đạt trọng lượng 1 - 1,5kg:
- Tỷ lệ mỡ cá so với trọng lượng cá 25%
- Trong đó tỷ lệ mỡ phần (mỡ trong) 12,03%
- tỷ lệ mỡ bụng (mỡ ngoài) 12,25%
Mỡ cá thô có đặc tính: 24
- Tỷ trọng 30
o
C 0,917
- Chỉ số chiết quang ở 40
o
C 1,460
- Chỉ số acid 0,22 mg KOH/g
- Chỉ số peroxyd 4 ml Na
2
SO
3

- Chỉ số xà phòng 196,96 mg KOH/g
- Chỉ số Iod 78,72 g I

25
Rửa bằng dung dịch nước muối 10% Lắng tách nước Mỡ lỏng sạch

Bảng 7: Tỷ lệ acid béo không bão hòa và bão hòa có trong nguyên liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô (*)
Thứ tự Nguyên liệu
Acid béo loại
một nối đôi (%)
Acid béo loại
nhiều nối đôi
(%)
Acid béo bão
hòa (%)
1
2
3
4
5
6
Dầu dừa
Dầu cọ
Bơ

mì ăn liền, phần lỏng làm dầu thực phẩm phối trộn thành dầu ăn, sản xuất margarin có thành phần mỡ cá đặc biệt có ω-3
đạt 0,34% rất tốt cho trẻ em, người già. Thành phần acid béo trong mỡ cá basa thô và sau khi tinh luyện được trình bày ở
bảng 8.
Bảng 8: Thành phần acid béo trong mỡ cá basa thô và sau khi tinh luyện