TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN


NGUYỄN THỊ MAI DUNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
NGUỒN CACBON, pH VÀ NHIỆT ĐỘ
TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, tháng 5 năm 2010


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân còn
có sự tạo điều kiện của nhà trường, của khoa và sự hướng dẫn tận tình của
thầy, cô giáo. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong
thời gian qua. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong
khoa Sinh-KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Em xin chân thành cám ơn!


SLTB

: Số lượng tế bào

TB

: Tế bào

HL

: Hàm lượng

Tg

: Thời gian

Nxb

: Nhà xuất bản

ĐHSP

: Đại học sư phạm

STT

: Số thứ tự

V


Biểu đồ
Biểu đồ 3.1. SLTB trung bình sau 24h nuôi cấy ở các giá trị pH khác nhau

20

Biểu đồ 3.2. SLTB trung bình sau 24h nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 21
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo 25
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo

27

Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

28

Đồ thị
Đồ thị 3.1. Động thái lên men vang táo mèo

Nguyễn Thị Mai Dung

24

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2



23

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo 25
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang táo mèo

26

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang táo mèo

28

Bảng 3.11. Kết quả phân tích rượu thành phẩm

29

Nguyễn Thị Mai Dung

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1


11

2.3. Phạm vi nghiên cứu

14

2.4. Địa điểm thực hiện đề tài

14

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

15

3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men

15

3.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng, phát triển của T3 trong
quá trình nhân giống

19

3.3. Nghiên cứu động thái lên men vang táo mèo

23

3.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men vang táo mèo

25

vị đặc trưng của từng loại quả. Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 2 tỷ lít
rượu vang, trong đó các nước sản xuất nhiều nhất là: Pháp, Italia, Angieri.
Ở Việt Nam sản xuất vang nho bắt đầu xuất phát từ một số cơ sở nhỏ
lẻ. Sau đó phát triển thành các nhà máy vang Thăng Long, Gia Lâm, Thanh
Ba… Trong sản xuất rượu vang tùy từng phương thức sản xuất và loại quả
chế biến mà cho ra các loại rượu khác nhau. Trên thế giới có hàng trăm loại
rượu vang có chất lượng cao như Chianti, Rhine…
Nước ta có khí hậu nhiệt đới nên các loại cây hoa quả phong phú, trong
đó có nhiều loại quả có thể là nguồn nguyên liệu tốt cho sản xuất rượu vang.
Miền núi phía Tây Bắc nước ta có cây táo mèo cho quả có hương vị thơm
ngon và đặc trưng. Hiện nay quả táo mèo chủ yếu là ăn tươi, ngâm rượu,
ngâm dịch siro. Tổng diện tích trồng táo mèo khoảng 40.000 ha [9], [10]. Nơi
có diện tích cây táo mèo nhiều nhất là các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Điện Biên,
Lai Châu. Tuy nhiên số lượng mang đi tiêu thụ hàng năm không đáng kể
(khoảng 35%), số còn lại thường bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ,
vận chuyển khó khăn, hoặc giá thành rẻ. Hầu hết người trồng quả táo mèo có
thu nhập thấp, đời sống gặp nhiều khó khăn.
Ngành sản xuất rượu vang ở nước ta đang phát triển, có nhiều sản phẩm
bán trên thị trường. Nhưng ứng dụng công nghệ vi sinh vào sản xuất vang
chưa được phổ biến, việc nghiên cứu một số chủng vi khuẩn áp dụng lên men
vang đã được đề cập đến nhưng còn ít.
Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng quả táo mèo để sản xuất rượu vang là
cần thiết và phù hợp với thực tiễn Việt Nam. Chúng tôi đã chọn và tiến hành

Nguyễn Thị Mai Dung

1

K32B-Sinh-KTNN



Nguyễn Thị Mai Dung

2

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về rƣợu vang
1.1.1. Các loại rượu vang
Rượu vang theo đúng nghĩa là nước ép nho lên men (không qua chưng
cất). Ngày nay người ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lên
men từ các loại quả khác nhau như táo, dâu, vải…
Rượu vang có thể chia làm 2 loại chính:
- Vang không ga (vang bàn ăn).
- Vang có ga (vang bọt sâm banh)
+ Loại không ngọt
+ Loại rất ít đường
+ Loại ngọt [5], [7].
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Nước ta là nước nhiệt đới gió mùa không thích hợp cho cây nho phát
triển tốt. Tuy nhiên nước ta lại có hoa quả phong phú, đây là nguồn nguyên
liệu phục vụ cho ngành nông nghiệp chế biến rượu vang (mơ, táo, dứa,
vải,…). Thành phần hóa học của quả, điều kiện chăm sóc, khí hậu,… có ảnh
hưởng lớn đến chất lượng rượu vang.

3,9
0,6
0,249
9,0
1,1
0,249
9,19
0,49
0,31
4,8
1,45
0,249

3

Tanin
0,07
0,83
0,83
0,83
0,035
0,83

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2



K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Cấu tạo chủ yếu của tế bào là hemicellulose chiếm 70% trọng lượng
khô (trong đó 31% manman, 29% glucan). Ngoài ra còn chứa 1-3% kitin, 610% protein, 8-8,5% lipid, 7% khoáng. Thành phần nội bào quan trọng của
nấm men là ti thể, không bào và nhân. Số lượng ti thể khoảng 10-20/tế bào.
Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, sinh sản của nấm
men. Không bào được hình thành từ thể Golgi hay mạng lưới nội chất. Không
bào chứa hệ thống keo bao gồm : Enzyme, protein, hydrocarbon, muối canxi,
kali, phenolflavin, riboflavin, acid nucleic, và các chất dự trữ khác. Nhân có
hình ovan, tròn nằm gần không bào trung tâm với kích thước khoảng 2,4  m .
Nhân chứa toàn bộ hệ men tham gia điều khiển quá trình sinh tổng hợp của tế
bào nấm men.
- Hình thái tế bào: Đa số có hình trứng, cầu hay ovan. Kích thước từ (310) x (5-12)  m. Hình dạng kích thước tế bào điển hình chỉ được tạo ra
trong điều kiện môi trường phù hợp. Khi điều kiện bất lợi thì hình dạng, kích
thước tế bào sẽ bị biến dạng (khi môi trường nghèo dinh dưỡng nấm men có
hình đế giày).
1.2.1.2. Sinh sản của tế bào nấm men
Trong điều kiện bình thường tế bào nấm men sinh sản bằng lối nảy
chồi. Trong điều kiện không thuận lợi một số có thể chuyển sang sinh sản
bằng bào tử.
Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi
nhỏ gọi là mầm (chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một
đầu của tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm, tế bào con phát triển trên cơ thể mẹ

có loài còn gây đục vang. Đó thường là các loài vi khuẩn Acetobacter
xylnium, Acetobacter aceti. Pasteur đã tìm ra cơ chế làm hỏng vang khi rượu
vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus [10].
Do vậy để bảo quản rượu vang người ta có thể dùng thanh trùng
Pasteur nhưng nó lại làm giảm chất lượng rượu vang. Ngoài ra, người ta còn
dùng phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO 2
(75-120 mg/l).
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa
thiết bị hoặc do bụi không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus [6], [10].

Nguyễn Thị Mai Dung

6

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.2.4. Bệnh vang
Bệnh vang luôn là vấn đề phải quan tâm của các nhà sản xuất rượu
vang. Vấn đề bệnh vang được khám phá đầu tiên bởi Pasteur. Bệnh vang làm
cho rượu bị chua, mùi khó chịu và phẩm chất rượu giảm rất nhanh [5], [9].
Các vi sinh vật kị khí: vi khuẩn Lb. brevia, Lb. pasteurianus, Lb. plantarum
đã làm cho vang bị vẩn đục, làm chuyển hóa acid c itric, tạo ra lượng lớn acid
lactic, acid acetic và 2,3-butanediol.


như S, P đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào nấm men. Ion
Fe 3 , Mg 2 nằm trong tế bào của enzyme hoạt động.
1.3.3. Ảnh hưởng của oxy
Quá trình tăng sinh của nấm men là quá trình hiếu khí vì vậy oxy là
nguồn quan trọng để nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn nhân giống.
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men vang
1.4.1. Hàm lượng cồn và pH
Nấm men lên men luôn sản sinh một lượng cồn. Nồng độ cồn thích hợp
cho nấm men phát triển tốt là 9-14%V. Khả năng chịu cồn và lên men tốt
trong môi trường có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn
chủng nấm men cho quá trình sản xuất rượu.
Trong quá trình lên men pH môi trường luôn biến đổi. Ở giai đoạn cuối
pH hơi tăng do nấm men tự phân hủy giải phóng ra NH3. Ở pH =2,3 quá trình
lên men yếu, pH > 6,5-7,5 khả năng lên men không còn. pH thích hợp là 4-5
[10].
1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khá lớn đến quá trình lên men. Mỗi loại nấm
men có khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển:
- Nhiệt độ

Nguyễn Thị Mai Dung

9

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thiết bị và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Quả táo mèo thu nhận từ hai tỉnh Yên Bái và Sơn La.
- Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch quả táo mèo có
vị trí phân loại theo Yelinov N.P (1996) sau đây:
1. Lớp: Hemiascocetes
2. Bộ : Endomycetales
3. Họ : Saccharomyces
4. Loài: Cerevisiae
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Một số hóa chất được sử dụng: MgSO 4 , KH 2 PO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 , acid
citric, các loại muối, các loại đường…
2.1.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, đường kế, tủ sấy, tủ lạnh, buồng cấy vô trùng,
buồng đếm Goriaev, giấy quỳ tím, máy li tâm, kính hiển vi quang học, nồi


K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2) g/l
1. Đường glucose : 50g
2. Pepton

:5g

3. MgSO 4

: 0,5g

4. KH 2 PO 4

: 1g

5. (NH 4 ) 2 SO 4

: 1g

6. Nước

: 1000ml


K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt lực lên men
- Phương pháp cân bình trọng lượng:
Lên men trong các bình có cùng thể tích 100ml, cùng một lượng tế bào
nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h, mở nắp bình lên men, đem cân
trọng lượng bình một lần thấy trọng lượng bình giảm đi. Đó là do lượng CO 2
sinh ra trong quá trình lên men bay hơi. Lượng CO2 sinh ra càng nhiều, trọng
lượng bình càng giảm thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao.
- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev:
Trong môi trường nhân giống nuôi ở 300C lắc đều canh trường, dùng
pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm kính.
Chú ý tránh để dịch xuống các rãnh thành bọt khí. Sau đó, đặt lá kính lên để
yên 3-5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại
1000 lần. Đếm số lượng tế bào trong 5 ô chéo lớn.
Cách tính số lượng tế bào trong 1ml.
M=A.50.N
Trong đó: M: số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù
N: Độ pha loãng của dung dịch huyền phù
A: Số lượng tế bào có trong 1 ô vuông

* Lưu ý: Từ phương pháp này ta có thể lấy được V dịch chứa số lượng
tế bào bằng nhau để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình
nhân giống.
2.2.1.3. Phương pháp hoạt hóa giống

- Giá trị trung bình số học
n

X

 Xi
i 1

n

-Độ lệch chuẩn
S

 ( X i  X )2

S

 ( X i  X )2

n 1

( nếu n  30 )

( nếu n  30 )

n

- Sai số trung bình học
m


Phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học sư phạm
Hà Nội 2.

Nguyễn Thị Mai Dung

14

K32B-Sinh-KTNN


Khóa luận tốt nghiệp

Trường ĐHSP Hà Nội 2

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn, xác định tên khoa học của chủng nấm men
Tác nhân chính thực hiện quá trình chuyển hóa đường trong dịch táo
mèo là nấm men. Vì vậy ta phải phân lập và tuyển chọn sao cho lấy được mẫu
tốt nhất. Chúng tôi dựa vào các chỉ tiêu sau để phân lập, tuyển chọn chủng
nấm men.
- Chịu được độ cồn, độ acid cao.
- Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn.
- Có khả năng lên men tốt trên môi trường có hàm lượng đường cao.
- Hương thơm có tạo este đặc biệt.
- Dễ lắng trong [12].
3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch táo mèo
Bằng phương pháp chọn khuẩn lạc nấm men (đã trình bày ở trên) chọn
được 4 mẫu có đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm. Chúng tôi dùng 4 mẫu
làm đối tượng nghiên cứu tiếp, kí hiệu là T1, T2, T3, T4.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men táo mèo

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Hình 3.3. Mẫu tế bào nấm men quan sát dƣới kính hiển vi quang học
độ phóng đại 1000 lần
3.1.2.2. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men ở độ pH khác nhau
Xác định hoạt lực lên men (phương pháp đã trình bày rõ ở mục 2.2.1.2)
thông qua hàm lượng CO2 được sinh ra (g/l) khi tiến hành lên men trong các
bình cùng dung tích. Hàm lượng CO2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên
men càng tốt.
Môi trường nghiên cứu là dịch siro táo mèo bổ sung cao men và được
pha loãng để đạt nồng độ đường là 22%. Tiến hành lên men trong các bình
100ml với thời gian 28h, thu được kết quả ở bảng dưới. Các mẫu đều có khả
năng sinh trưởng, phát triển tốt, đạt số lượng tế bào cực đại ở 24h nuôi cấy.
Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của các mẫu nấm men ở độ pH khác nhau
STT

Mẫu

1

pH
3

3,5

4

4,5

5


++

++

+++

++++

++

4

T4

+

++

+++

+++

++

Nguyễn Thị Mai Dung

17

K32B-Sinh-KTNN

trường dinh dưỡng khác nhau (mỗi môi trường ứng với một loại đường).
Chúng tôi dựa vào một số tiêu chí đánh giá khả năng lên men đường là:
- HL đường sót.
- HL cồn.
- Lượng CO2 tạo thành.
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của mẫu T3
Loại đường

Khả năng lên men

Saccharose

Lên men nhưng không mạnh

Glucose

Lên men mạnh

Sorbitol

Lên men mạnh

Dịch quả

Lên men

Kết quả cho thấy mẫu T3 phát triển tốt trên các môi trường đường
saccharose, glucose, sorbitol, dịch quả. Đặc biệt là glucose.

Nguyễn Thị Mai Dung