TRƯỜNG ĐAỊ HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN


NGUYỄN THỊ HÀO

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN
CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN VANG TÁO MÈO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung

Hà Nội, tháng 5 năm 2010


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Trong những năm gần đây công nghệ vi sinh đã được ứng dụng một cách
rộng rãi và có hiệu quả trên nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Nhận biết được
vai trò quan trọng của công nghệ vi sinh trong cuộc sống em đã tìm hiểu, nghiên
cứu về lĩnh vực này. Dưới sự hướng dẫn tận tình chu đáo của cô Đinh Thị Kim
Nhung cùng các thầy cô trong bộ môn vi sinh học Trường ĐHSP Hà Nội 2. Do
vậy em đã hoàn thành tốt đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả
năng lên men vang táo mèo”.

Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8

2.

6

Số lượng tế bào nấm men x10
Hoạt lực lên men của 4 chủng nấm men
Khả năng lên men của 4 chủng nấm men
Khả năng kết lắng của 4 chủng nấm men
Động thái quá trình lên men
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến lên men vang
Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Ảnh hưởng của độ pH

Trang
19
19
20
21
24
26
27
29

Danh mục biểu đồ và hình

Khuẩn lạc chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae
TM4
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae TM4 trên
kính hiển vi quang học x1000
Tế bào nấm men Saccharomyces cervisiae TM4 trên môi
trường thạch nghiêng

22
23
23


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
PHẦN NỘI DUNG
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Cây táo mèo (Docynia indica)
1.1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây táo mèo
1.1.2. Tình hình chế biến táo mèo
1.2. Hệ vi sinh vật của vang
1.2.1. Nấm men (yeast)
1.2.2. Vi khuẩn
1.2.3. Nấm mốc
1.3. Công nghệ sản xuất vang
1.3.1. Khái quát chung về vang
1.3.2. Một số biến đổi trong quá trình lên men

4
4
7
7
7
7
8
9
13
13
13
13
13
14
17
17
17
17
22
22
23
24
26
27
30
31
32
33
34



4.
5.
6.

Vị chát
Vị ngọt
Mức độ hài hòa

2
2
3

7.

Tính đặc trưng

4

8.

Đánh giá chung

3

Tổng điểm

Mức độ yêu cầu
Trong ánh, không cặn lắng
và cặn lơ lửng.

16. Đánh giá chung
Tổng điểm

TM1
1,5
1
1
2
1
1
2
2
11,5

Chủng nấm men
TM2
TM3
1,5
2
1
1,5
1,5
2
1,5
2
2
2
2
2
2

vang. Vang là một loại đồ uống có cồn được làm từ hoa quả và không qua
trưng cất, trong đó vang nho là một loại đồ uống quan trọng và kinh tế nhất.
Nó được chế biến theo một qui trình công nghiệp và được kiểm tra một cách
nghiêm ngặt. Vang có hương, vị đặc trưng vì vậy nó là một loại đồ uống được
ưa chuộng ở khắp nơi trên thế giới.
Vang có thành phần hóa học rất phức tạp, hàm lượng các chất trong
vang tùy thuộc vào môi trường, nguồn nguyên liệu và vào qui trình lên men.
Thành phần hóa học chính của vang là: alcol, axit, tanin, đường và các sắc tố.
Ngoài những thành phần này vang còn có đầy đủ các loại axit amin, vitamin
và muối khoáng. Vì vậy vang được coi là loại đồ uống có giá trị dinh dưỡng cao.
Nguồn nguyên liệu truyền thống cho sản xuất vang là quả nho, vang
được sản xuất từ loại quả này được gọi là vang nho. Đây là một loại vang
được ưa chuộng nhất, ở các nước phương Tây chúng là thứ đồ uống không thể
thiếu cho bữa ăn hàng ngày. Sở dĩ vang nho lại được ưa chuộng như vậy là vì
không những đạt được điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động của các vi
sinh vật mà nó còn chứa các thành phần tạo nên hương, vị đặc trưng cho sản
phẩm.
Trên thực tế thì vang có thể sản xuất từ rất nhiều nguồn nguyên liệu khác
nhau bất kì một loại quả nào có chứa đường, axit, vitamin, khoáng... và không
độc hại thì đều có thể làm nguyên liệu để sản xuất vang. Tuy vậy ở Việt Nam
hiện nay ngành sản xuất vang thực sự chưa chú ý đến những nguồn nguyên
liệu khác mà vẫn dùng những nguồn nguyên liệu chính là nho, mơ, mận. Điều

Nguyễn Thị Hào

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


Ý nghĩa đề tài

Ý nghĩa khoa học: Nhằm đi sâu tìm hiểu hình thái, đặc tính sinh
lý, sinh hóa của chúng nấm men Saccharomyces cerevisiae TM4 có khả năng
lên men vang táo mèo.
Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình sản
xuất vang từ táo mèo, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam.

Nguyễn Thị Hào

2


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẦN NỘI DUNG

Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1.

Cây táo mèo (Docynia indica)

1.1.1. Đặc điểm sinh học và sinh thái của cây táo mèo
Cây táo mèo thuộc dạng cây tự nhiên, chưa được thuần hóa. Chúng
xuất hiện trong các vùng rừng núi phía Bắc thuộc các tỉnh Sơn La (Mường
La), Yên Bái (Trạm Tấu) và mọc ở độ cao 700-1500m, có khả năng chịu lạnh
tốt.
1.1.1.1. Rễ cây

chín có hương thơm đặc trưng, có vị ngọt, chát, chua giảm.
1.1.2. Tình hình chế biến táo mèo
Cho đến nay, quả táo mèo sau khi chín chủ yếu vẫn được dùng để ăn
tươi chứ chưa có một hình thức chế biến nào. Quả táo mèo có hương thơm rất
đặc trưng, nó còn có tên địa phương là quả Sơn Tra. Theo kinh nghiệm dân
gian quả táo mèo có tác dụng giải nhiệt và chữa các bệnh về đường tiêu hóa,
giảm lượng mỡ trong máu, giảm colesteron. Mặt khác hàm lượng đường trong
quả táo mèo khi chín tương đối cao. Vì vậy mà quả táo mèo khá được ưa
chuộng trên thị trường. Thịt quả táo mèo rất rắn nên có thể cách chế biến hợp
lí nhất vẫn là ngâm đường để thu dịch siro táo mèo.
Từ dịch siro này có thể sử dụng bằng cách cho thêm nước và pha thêm
rượu để uống. Ngày nay dịch siro còn được sử dụng để lên men vang, đây là
một hướng rất mới có triển vọng trong việc nâng cao giá trị kinh tế của quả
táo mèo.
1.2.

Hệ vi sinh vật của vang
Hệ vi sinh vật của vang rất đa dạng và phong phú, bao gồm cả vi sinh

vật có lợi và vi sinh vật có hại. Các vi sinh vật có lợi là nấm men, vi khuẩn
thuần chủng được cấy vào. Còn các vi sinh vật có hại là các nấm men dại, vi
khuẩn gây hỏng vang tồn tại trong tự nhiên trên môi trường vỏ quả.
1.2.1. Nấm men (yeast)
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thường
sinh sản bằng nảy chồi, cũng có khi theo hình thức phân cắt tế bào. Nấm men
được đặc trưng bởi khả năng phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên, nhất
là trong môi trường chứa đường và pH thấp: trong đất, nước, không khí, trong
lương thực, thực phẩm, trong hoa quả [5].

Nguyễn Thị Hào

bọc bởi hai lớp màng.
Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces: nấm men có nhiều hình
thức sinh sản (vô tính, hữu tính). Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy
chồi khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo
bào tử. Sinh sản nảy chồi ở nấm men là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào
phát triển đến mức độ nhất định thì trên cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ
gọi là mầm (chồi). Các mầm có thể đâm ra ở nhiều phía khác nhau của tế bào
Nguyễn Thị Hào

5


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

mẹ. Ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế
bào mẹ, sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập,
cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men
giống cành cây. Trong điều kiện thuận lợi một tế bào con được hoàn chỉnh và
tách khỏi tế bào mẹ là 20-30 phút.
Nấm men Saccharomyces có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi
được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang (1-8 bào tử). Bào tử túi sau
khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành một tế bào nấm men,
tiếp theo tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi.
1.2.1.2. Ứng dụng của nấm men
Nấm men được ứng dụng từ rất sớm trong sản xuất rượu vang. Khoảng
6000 năm trước, loài người đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu vang.
Nấm men dùng trong sản xuất rượu vang thường là các giống thuần chủng
hoặc là những chủng nấm men tự nhiên có sẵn trên bề mặt quả. Trong công

khuẩn có lợi là những chủng vi khuẩn tạo cho vang có vị, hương thơm đặc
trưng như vi khuẩn lactic và nhiều chủng vi khuẩn khác thuộc giống
Lactobacillus. Ngược lại một số vi khuẩn có thể làm hỏng vang hoặc làm cho
vang có mùi khó chịu. Pasteur đã khám phá ra cơ chế làm hỏng vang của các
vi sinh vật khi rượu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus.
Trên bề mặt của vang còn là một môi trường thuận lợi cho sự hoạt động
của vi khuẩn acetic. Sự hoạt động của loại vi khuẩn này làm biến đổi alcol
thành acid acetic, dẫn đến làm giảm chất lượng của vang.
1.2.3. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang,
thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến. Ví dụ: Aspergillus.
1.3.

Công nghệ sản xuất vang

1.3.1. Khái quát chung về vang
Vang là một loại đồ uống có cồn nhẹ, có giá trị dinh dưỡng và được
mọi người ưa chuộng. Vang được làm từ dịch trái cây nhờ tác động của các vi
sinh vật, trong đó vai trò quan trọng thuộc về nấm men.Từ thời Ai Cập cổ đại
người ta đã biết đến sản xuất vang, từ đây kỹ thuật sản xuất vang được di
nhập dần sang các quốc gia vùng Địa Trung Hải vào khoảng 600 năm trước
công nguyên vào thế kỉ 15 mới xuất hiện ở châu Âu.
Công nghệ sản xuất vang chỉ được bắt đầu vào năm 1857, khi lần đầu
tiên nhà bác học người Pháp Louis Pasteur công bố kết quả nghiên cứu về quá
trình lên men rượu. Trong đó ông chỉ ra cơ sở khoa học của quá trình lên men
rượu, xác định rõ vai trò của nấm men trong sản cồn. Công trình nghiên cứu
Nguyễn Thị Hào

7


xúc tác của enzyme hexokinase và isomerase.

Nguyễn Thị Hào

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

- Giai đoạn 2: Biến đổi fructose - 1,6 - diphosphate thành 3 phosphoglyxeraldehyde và phosphodioxyaceton. Nhờ xúc tác của enzyme
aldolase.
- Giai đoạn 3: Trước hết là 3- phosphoglyxeraldehyde biến đổi thành
photphoglyxerate và tiếp tục biến đổi thành 2-photphoglyxerate nhờ xúc tác
của enzyme photphoglyxeratmutase. Giai đoạn cuối cùng của giai đoạn này là
sự biến đổi 2-phosphoglyxerate thành acid pyruvic nhờ xúc tác của enzyme
aldolase và kinase.
- Giai đoạn 4: Acit pyruvic phân cắt nhờ xúc tác của enzyme
decarboxylase thành acetaldehyde, giải phóng CO2.
- Giai đoạn 5: Tạo thành ethanol từ acetaldehyde nhờ xúc của
alcoldehydrogenase.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 → 2C2H5OH + 2ATP + H2O
Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy quá trình oxi
hóa khử của enzyme trong tế bào nấm men tham gia. Tốc độ lên men của các
chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác nhau đối với các loại đường.
Tốc độ lên men đường glucose và fructose nhanh hơn đường saccarose. Tốc
độ lên men được xác định bằng lượng CO2 bay ra từ 1 thể tích môi trường
nhất định trong một đơn vị thời gian.

có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm
mức thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên
men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định,
trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh trường [7]. Trong điều kiện lên men
rượu, pH tối ưu để tạo ethanol là 4,5-5. Nếu tăng pH thì môi trường dễ bị
nhiễm khuẩn, glicerine sẽ tạo ra nhiều hơn và do đó giảm hiệu suất lên men.
1.3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng đường
Nồng độ đường quá cao sẽ dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu và làm mất
cân bằng trạng thái sinh lí của nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến
tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nồng độ dịch
đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ giảm năng suất thiết bị lên men [7].
Trong nước quả thường có hàm lượng đường không đều do vậy người
ta thường bổ sung thêm đường saccarose. Đa số cấc loại nấm men hoạt động
bình thường trong môi trường có hàm lượng đường nhỏ hơn 20%. Có một số
chủng hoạt động ở môi trường có hàm lượng đường cao hơn. Khi nhân giống
thường dùng môi trường có hàm lượng đường thấp dưới 10% [6].

Nguyễn Thị Hào

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.3.3.4. Ảnh hưởng của SO2
Ngày nay, việc thêm SO2 đã được dùng phổ biến trong nghành rượu
vang. SO2 được biết đến hầu hết trong thực phẩm. Nó cũng được tạo thành 1
lượng nhỏ trong quá trình lên men rượu. Nó được thêm vào trong hầu hết các

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1.3.3.6. Hàm lượng giống
Tác nhân của quá trình lên men là nấm men vì vậy hàm lượng,
chất lượng men giống ảnh hưởng tới quá trình lên men. Hàm lượng men
tăng quá trình lên men tăng nhưng tăng nhiều quá sẽ xảy ra sự cạnh
tranh của nấm men, ảnh hưởng đến quá trình lên men, thông thường tỷ lệ
men giống vào khoảng 10% [3].

Nguyễn Thị Hào

12


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nhiên cứu
2.1. Dụng cụ - Thiết bị
- Tủ sấy
- Tủ cấy vô trùng
- Cân kỹ thuật và cân phân tích
- Nồi hấp áp lực
- Cồn kế, đường kế, máy đo PH
- Buồng đếm hồng cầu
- Kính hiển vi quang học
- Bình tam giác, hộp lồng (đĩa petri), ống nghiệm

men (MT3) g/l
Dịch siro : 200ml.
MgSO4.7H2O: 0,5g.
KH2PO4:
1g.
(NH4)2SO4:
1g.
Nước cất: 1000ml.

2.3. Nguyên lệu: Siro táo mèo.
2.4. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae từ dịch siro táo mèo.

Nguyễn Thị Hào

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường
thạch đĩa
Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men tôi dùng phương pháp phân
lập trên hộp petri. Môi trường để tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi
trường Hansen.
Cách tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân bố vào
các hộp vô trùng petri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur. Dịch hoa

phóng đại 1000 lần.
2.5.5. Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế.
- Xác định độ cồn bằng alcol kế và phương pháp hóa học.
- Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.
- Xác định hàm lượng axit trong dung dịch lên men bằng cách dựa vào
nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml NaOH 0,1N
dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng axit trong dich lên men.
2.5.6. Phương pháp cảm quan
Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác
của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có
của sản phẩm, thực phẩm như: màu sắc, hình thái, mùi vị…Cảm quan của
vang được tính theo thang điểm 20 (phụ lục 1).
2.5.7. Xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men được xác định dựa trên tốc độ lắng của
sinh khối, phương pháp này được tiến hành như sau: hòa sinh khối nấm men
vào dung dịch đệm acid ( có pH= 4,5) được đựng trong các bình có kích
thước bằng nhau với thể tích dung dịch đệm và số lượng nấm men như nhau.
Lắc kỹ trên máy lắc tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút và để lắng
trong 15 phút. Sau đó tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng, lớp kết lắng cao
nhất thì chủng tương ứng có khả năng kết lắng cao nhất.

Nguyễn Thị Hào

15


Trường ĐHSP Hà Nội 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

-

Hệ số biến động: cv %

Xi
n

n

X

.100%

N: số lần lặp lại
Xi: giá trị đo lần thứ i.

Nguyễn Thị Hào

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và biện luận
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men lên vang táo mèo
3.1.1. Chỉ tiêu cơ bản để tuyển chọn chủng nấm men
Trong thực tế sản xuất, không có một chủng nấm men nào là toàn
năng. Vì chất lượng của rượu vang phụ thuộc vào chủng nấm men còn phụ


hành lắc trên máy lắc. Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống nghiệm có độ pha loãng
10-1 cho vào ống 2 và các thao tác cũng lặp lại như đã làm sẽ thu được dịch
lên men pha loãng ở mức độ: 10-1, 10-2, 10-3,…10-7. Chúng tôi chọn mẫu có
độ pha loãng 10-5- 10-7 để tiến hành các bước tiếp theo.
Phân lập nấm men trên môi trường thạnh đĩa (đã vô trùng), dùng pipet
vô trùng hút lấy 1 ít dịch lên men đã có sẵn nấm men ở các ống nghiệm (có
độ pha loãng 10-5-10-7) nhỏ vào hộp petri, mỗi hộp 1 giọt dịch lên men, sau đó
dùng que trang dàn đều giọt dịch lên men ra khắp toàn bộ bề mặt thạch. Đặt
ngược các hộp lồng, bao gói lại và đặt vào tủ ấm ở 28-300C. Sau 2-3 ngày lấy
ra quan sát khuẩn lạc (về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ dày, bề mặt,
đường viền bao quanh và độ trong của khuẩn lạc). Chọn ra những khuẩn lạc
có kích thước to, đứng riêng rẽ cấy vào các ống thạch nghiêng (trong đó có
môi trường Hansen đã được vô trùng) và chuyển toàn bộ ống nghiệm đã cấy
khuẩn lạc vào tủ ấm 28-300C. Chúng tôi tạm ký hiệu là: TM1, TM2, TM3,
TM4. Sau 2-3 ngày lấy ống nghiệm ra quan sát và làm tiêu bản kiểm tra hình
thái tế bào nấm men trên kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại (60x10) và
(100x10), đồng thời tiến hành các thí nghiệm trên MT2, MT3 để tuyển chọn
chủng nấm men phù hợp với mục đích nghiên cứu.
3.1.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men để lên men vang táo mèo
Sau khi phân lập được các chủng trên, chúng tôi tiếp tục bố trí các thí
nghiệm để xác định xem chủng nào có khả năng cho vang chất lượng cao
nhất.
3.1.2.2.1. Kiểm tra khả năng phát triển của các chủng nấm men
Môi trường nuôi cấy sau khi được khử trùng, được đưa vào các bình
250 ml và đặt lên máy lắc ổn nhiệt (20-300C) tốc độ 150 vòng/ phút. Tiến

Nguyễn Thị Hào

18


6,2±2

5,4±2

10±2

6,5±2

16h

88±2

66±2

100±2

103±2

24h

240±2

305±2

390±2

406±2

32h

TM3
TM4

3,4
+
+
++
++

3,8
+
++
++
++

pH
4,2
+
++
+++
++

4,5
++
+++
++++
++

5
++