Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
………… o0o…………
HOÀNG THỊ BÍCH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI
TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG
STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM



PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI
TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG
STENERNEMA SP.TĐ3 Ở TAM ĐẢO, VĨNH PHÚC CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM

LUẬN ÁN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, 2010
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
Ngày nay, nhờ sự có mặt của nhiều kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn
mạnh nên đã góp phần giải quyết được nhiều bệnh nhiễm trùng mắc phải. Tuy

cộng sinh có ý nghĩa khoa học không chỉ ở Việt Nam mà còn có ý nghĩa trên
thế giới trong việc nghiên cứu các chất kháng sinh mới phục vụ cho con
người, động vật, thực vật.
Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứ u về tuyế n trù ng rất có giá trị v à có
ý nghĩa khoa học trong xác định hình thái , đa dạ ng loà i nhưng chưa có nhiều
nghiên cứ u về vi khuẩ n cộ ng sinh vớ i tuyế n trù ng và các sản phẩm trao đổi
chất của chúng. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài
Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký
sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp.TĐ3 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc có
khả năng kháng khuẩn, kháng nấm.
Với mục tiêu:
- Phân lập vi khuẩn cộng sinh từ tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 ở
Tam Đảo, Vĩnh Phúc.
- Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi
khuẩn phân lập được.
- Xác định một số ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng
kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng vi khuẩn cộng sinh.
- Tách chiết hoạt chất và thử khả năng kháng vi sinh vật kiểm định.
- Định loại vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 bằng
phương pháp sinh học phân tử trên cơ sở phân tích đoạn gen 16S rDNA.
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng
Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng là loài giun tròn (Nematodes)
có ích, ký sinh ở một số loài côn trùng có hại- làm suy yếu hoặc giết chết
những côn trùng này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và thực
vật [3].

cái trưởng thành, cho phép chúng có điều kiện ghép đôi trong vật chủ.
Ở giai đoạn đầu, con cái đẻ trứng vào cơ thể côn trùng và trứng nở
thành ấu trùng thế hệ 1. Các ấu trùng của thế hệ 1 không phát tán ra ngoài mà
ở lại bên trong xác chết cơ thể vật chủ để dinh dưỡng bằng chính các mô của
côn trùng vật chủ và phát triển nhanh chóng đạt đến giai đoạn trưởng thành
thế hệ 2. Trong trường hợp xác chết vật chủ vẫn còn nguồn thức ăn, thế hệ 2
tiếp tục giao phối và tiếp tục phát triển qua thế hệ 3, thậm chí cả thế hệ 4 bên
trong cơ thể vật chủ. Cuối cùng, khi nguồn dinh dưỡng đã hết, thế hệ cuối
cùng trong xác chết côn trùng dừng lại ở pha ấu trùng tuổi 2. Các ấu trùng này
bắt đầu chui ra khỏi xác chết côn trùng và phát tán ra môi trường bên ngoài và
trở thành IJs (tuổi 3) và từ đây chúng tiếp tục một chu kỳ phát triển mới với
côn trùng vật chủ mới.
1.1.2. Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis
Không giống với các loài Steineinema, ở các loài tuyến trùng
Heterorhabditis, IJs khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng phát triển thành con
cái lưỡng tính (Hermaphroditis). Con cái này có khả năng sản sinh ra tinh
trùng cùng với trứng và tự thụ tinh để sinh sản. Từ thế hệ 2 trở về sau, IJs mới
phát triển thành con trưởng thành phân tính đực cái và sinh sản bằng hình
thức giao phối. Giai đoạn đầu của con cái cả lưỡng tính và phân tính, chúng
đẻ trứng (oviparous) nhưng ở giai đoạn sau khi con cái về già chúng đẻ trứng
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thai (oviviparous); lúc này ấu trùng nở ra bên trong cơ thể con mẹ và sử dụng
cơ thể mẹ làm nguồn thức ăn để phát triển thành ấu trùng tuổi 2, biến con cái
thành bọc chứa ấu trùng tuổi 2. Khi phá vỡ thành cơ thể con mẹ chui ra ngoài
trở thành ấu trùng cảm nhiễm (tuổi 3) chúng vẫn giữ lại vỏ cutin của ấu trùng
tuổi 2 [3].
1.2. Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN
Mỗ i ấ u trù ng xâm nhiễ m củ a tuyế n trù ng EPN (infective juveniles –IJs)

EPN
VKCS
Tài liệu tham khảo
1
Steinernema
abbasi
Flavimonas
oryzihabitans
Elawad et al., 1998
2
S. affine
X. bovienii
Akhurst & Boemare, 1990
3
S. apuliae
X. kozodoii
Tailliez et al., 2006
4
S. arenarium
X. kozodoii
Tailliez et al., 2006
5
S. bicornutum
X. budapestensis
Tailliez et al., 2006
6
S. carpocapsae
X. nematophila
Akhurst & Boemare, 1990
7

Tailliez et al., 2006
15
S. kraussei
X. bovienii
Akhurst & Boemare, 1990
16
S. kushidai
X. japonica
Nishimura et al., 1994
17
S. longicaudum
X. ehlershii
Tailliez et al., 2006
18
S. monticolum
X. hominickii
Fischer-Le Saux et al., 1998
19
S. puertiricense
X. romanii
Tailliez et al., 2006
20
S. rarum
X. szentirmaii
Tailliez et al., 2006
21
S. riobravis
X. cabanillasii
Tailliez et al., 2006
22

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 1.1 cho thấy X. bovienii có quan hệ cộng sinh với 4 loài
Steinernema, trong khi X. poinarii với 2 loài, còn 3 loài vi khuẩn
Xenorhabdus khác chỉ có quan hệ cộng sinh với duy nhất 1 loài Steinernema.
Điều đó cho thấy tính chuyên hóa của tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn nhưng
cũng có tính đa dạng khá cao.
1.2.2. Vi khuẩn Photorhabdus
Photorhabdus có kích thước 0,5 -2 x 1- 10 μm, Gram âm, không sinh
bảo tử và di động bằng lông rung. Hô hấp kị khí không bắt buộc, nhiệt độ tối
ưu là 28
0
C; một số chủng phát triển ở 37- 38
0
C. Photorhabdus có phản ứng
catalase dương tính nhưng không khử nitrat (chủ yếu âm tính với một số loài
thuộc họ Enterobacteriaceae). Photorhabdus lên men glucose sinh axit, không
sinh khí và cũng có khả năng lên men đường Fructose, D- mannose, maltose,
ribose, và N – acetylglucosamine sinh axit, lên men glycerol yếu.
IJs củ a cá c loà i tuyế n trù ng Heterorhabditis spp., thì vi khuẩn cộng
sinh nằ m dả i rá c theo chiề u dà i củ a ruộ t , nhưng chủ yế u vẫ n là ở nử a trướ c
của ống ruột. Hầu hết các loài vi khuẩn giống Photorhabdus có khả năng tạo
sáng huỳnh quang sinh học [8].
1.2.3. Sự chuyển pha của vi khuẩn cộng sinh
Sự biến đổi pha là một đặc điểm phổ biến của vi khuẩn, đó là sự thay
đổi đảo nghịch cho phép vi khuẩn tránh được hàng rào miễn dịch của côn
trùng vật chủ hoặc sự nhiễm của thực khuẩn thể. Sự biến đổi pha cũng xuất
hiện ở các loài vi khuẩn giống Xenorhabdus và Photorhabdus.
Sự biến đổi pha trong Xenorhabdus được mô tả như là sự dị hình 2

Tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh tương tác với nhau, mỗi bên
đều thực hiện những nhiệm vụ, chức năng riêng để sinh tồn và phát triển
nhưng lại giúp bên kia để tồn tại, tổ hợp này không thể tách rời và tồn tại độc
lập trong môi trường tự nhiên được.
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.3.1. Vai trò của tuyến trùng
* Tuyến trùng làm vector vận chuyển vi khuẩn cộng sinh:
Khi xâm nhập vào vật chủ côn trùng các IJs đóng vai trò như vector vận
chuyển vi khuẩn cộng sinh vào bên trong vật chủ côn trùng, sau đó tuyến trùng
di chuyển thẳng vào xoang máu côn trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh.
* Tuyến trùng bảo vệ vi khuẩn cộng sinh:
- Bảo vệ vi khuẩn cộng sinh ở môi trường ngoài côn trùng vật chủ,
bằng cách để vi khuẩn cộng sinh trong bọc chứa nằm trong ruột chúng do vi
khuẩn cộng sinh không thể tự tồn tại ở ngoài môi trường (đất, nước).
- Bảo vệ vi khuẩn cộng sinh ở trong cơ thể côn trùng: khi vi khuẩn
cộng sinh được giải phóng từ cơ thể tuyến trùng vào xoang máu của côn
trùng, thì theo phản ứng tự nhiên, côn trùng thường tiết ra một số chất kháng
thể (dạng protein) để hạn chế hoặc loại bỏ vi khuẩn cộng sinh , trong khi đó
nhờ tuyến trùng cũng có khả năng tiết ra một số chất làm trung hòa là làm mất
tác dụng kháng thể của các chất này. Nhờ vậy, tuyến trùng bảo vệ cho vi
khuẩn cộng sinh phát triển bình thường trong cơ thể côn trùng [3].
1.3.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh
* Vi khuẩn cộng sinh sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm:
Độc tố do vi khuẩn cộng sinh tiết ra một số protein độc có khả năng
nhiễm cho xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng vật chủ chết
một cách nhanh chóng trong vòng 24 – 48h. Như vậy, thời gian chết côn trùng
vật chủ khác nhau tùy loại tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn và cũng phụ thuộc
vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48h.

trưởng và phát triển được là nhờ hệ enzyme như proteinase, lypase, có tác
dụng vừa gây độc đối với côn trùng vật chủ, vừa thuỷ phân nguồn dinh dưỡng từ
côn trùng tạo các sản phẩm trao đổi chất đơn giản, dễ hấp cho tuyến trùng [3].
Cùng với đó, các chất trao đổi thứ cấp của vi khuẩn cộng sinh mang
hoạt tính kháng khuẩn, ngăn cản các vi sinh vật khác xâm nhập vào xác chết
côn trùng, bảo vệ nguồn thức ăn cho tuyến trùng.
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn cộng sinh là những dẫn xuất indol,
xenorhabdin và xenocoumacins.
Xenorhabdin có hoạt tính kháng khuẩn [35], Xenorhabdin I, II, III, IV
và V là những chất kháng sinh và thuốc trừ sâu. Các chất này được tổng hợp
từ X. nematophila hay X. luminesce. Trong đó, xenorhabdin I và III được
phân lập từ X. bovienii ATCC 39497 nhờ sử dụng sắc ký cột. Những hợp chất
hoá học này tương ứng với xenomides I và III là đều có hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm khi chúng lần lượt kháng lại Bacillus subtillis và Botrytis
cinerea [41,42].
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của xenorhabdincin
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nematophin đã được phân lập từ X. nematophila và phát hiện trong tất

Hoạt tính
Tài liệu tham khảo
X. nematophila
Xenocoumacin
1,2,3
McInemey et al., 1991a
Xenorhabdin
1,2,4
McInemey et al., 1991b;
Li et al.,1995
Bacteriocin
1
Boemare et al., 1992
Xenorhabdicin
1
Thaler et al.,1992
Nematophin
1,2
Li et al.,1997
Chitinase
2
Chen et al., 1996
X. bovienii
Indole derivatives
1,2
Paul et al., 1998;
Li et al.,1995
Xenorhabdins
1,2,4
McInemey et al., 1991b;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.4.2. Hoạt tính diệt côn trùng
Mc Inerney et al., (1991a) xác định 5 chất nguồn gốc từ dithiopyrolone,
xenorhabdins, từ dịch nuôi Xenorhabdus spp., và trong số đó xenorhabdin II
cũng có tác dụng diệt côn trùng.
Xenorhabdin II gây chết 100% cho ấu trùng Heliothis punctigera ở 150
g/ml

với liều LC
50
là 59,5 g/ml. Nó cũng làm giảm trọng lượng của ấu
trùng còn sống sót. Ở nồng độ 37,5 g/ml chỉ có 18,8% ấu trùng chết nhưng
giảm 64,7% trọng lượng của ấu trùng sống sót so với đối chứng.
1.4.3. Hoạt tính diệt tuyến trùng ký sinh thực vật
Hu et al.,(1995) thấy rằng dịch nuôi Xenorhabdus và Photorhabdus
trong môi trường nước thịt (TSB) có độc đối với ấu trùng giai đoạn 2 của giun
tròn ký sinh rễ Meloidogyne incognita, và đối với ấu trùng và con trưởng
thành của giun tròn ký sinh ở gỗ thông Bursaphelenchus xylophilus. Tác dụng
độc tố của dịch nuôi Xenorhandus spp. lên ấu trùng giai đoạn 2 và trứng của
M. incognita được công bố bởi Grewal et al., (1999). Các nghiên cứu khác
cho thấy indole và 3,5- dihydroxy-4- isopropylstilbene (ST) tách từ dịch nuôi
Photorhabdus luminescens cũng có hiệu lực diệt giun tròn thực vật [25] Ở liều 100 g/ml, ST gây chết gần 100% cho ấu trùng giai đoạn 4 và
con trưởng thành của giun tròn Aphelenchoides rhytium và Bursaphelenchus
spp. và những giun tròn ăn vi khuẩn Canorhabditis elegans. Tuy nhiên, không
Hình 1.3. Công thức hoá học của 3,5- dihydroxy-4-
isopropylstilbene


dithiolopyrrolone từ Xenorhabdus , cho thấy khả năng chống ung thư như ung
thư phổi, trực tràng, da, tuyến tiền liệt, vú và ung thư vòm họng [39].
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Glaser (1929) là người đầu tiên đã phát hiện tuyến trùng ký sinh ở bọ
cánh cứng Nhật Bản (Popillia japonica) ở New Jersey, Mỹ. Ông cũng là
người đầu tiên nhân nuôi thành công tuyến trùng Steinernema glaseri để
phòng trừ loài sâu hại này. Mặc dù vậy, trong thời gian này do sự bành trướng
của thuốc hoá học nên thành tựu quan trọng này của ông chưa được đánh giá
và ít được chú ý. Chỉ đến đầu những năm 1970, xuất hiện sự kháng thuốc của
sâu hại và các hậu quả môi trường do thuốc hoá học gây ra nên các tác nhân
sinh học, trong đó có tuyến trùng mới được quan tâm [3].
Ngày nay, các tuyến trùng EPN đang được quan tâm khoa học lớn
không chỉ vì chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học, mà là vì tầm quan
trọng về y tế và nông nghiệp; tiềm năng của các sản phẩm trao đổi chất của vi
khuẩn cộng sinh của chúng.
Gần đây trên thế giới cũng có nhiều nghiên cứu về các sản phẩm trao
đổi chất từ vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN và ứng dụng của chúng
như: tìm ra các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật, xác định công thức
hóa học của chúng, thử khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và ngăn ngừa sự
tăng sinh của dòng tế bào ung thư [29, 39].
Hơn 30 hoạt chất trao đổi thứ cấp thuộc các nhóm khác nhau đã tìm
thấy từ dịch nuôi cấy của Xenorhabdus và Photorhabdus. Những sản phẩm
trao đổi chất này không chỉ đa dạng về cấu trúc hóa học mà còn đa dạng về
hoạt tính sinh học đối với y học và nông nghiệp, như kháng khuẩn, kháng
nấm, côn trùng và giun tròn thực vật, chống viêm, chống ung thư và kháng
virus [29].
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Dự án: “Genomic approaches to metabolite exploitation from
Xenorhabdus / Photorhabdus - GAME XP” là dự án giữa Việt Nam, Thái Lan,
CHLB Đức và Anh do EC tài trợ với mục đích nghiên cứu các hợp chất tự
nhiên từ chất tiết của vi khuẩn Xenorhabdus/Photorhabdus cộng sinh với
tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema và Heterorhabditis phục
vụ trong y dược. Ở Việt Nam, dự án sẽ tập trung phân lập, phân loại tuyến
trùng cùng với vi khuẩn cộng sinh và tách chiết các hoạt chất sinh học. Trong
khuôn khổ của dự án, Phan Kế Long & cs (2009) đã phân lập được một số
loài tuyến trùng, vi khuẩn cộng sinh ở một số vùng ở Việt Nam và cũng đã
xác định được hợp chất Diketopiperazin từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của
vi khuẩn Xenorhabdus sp. cộng sinh với tuyến trùng Steinernema
robustispiculum TN 21[10].
Chính vì vậy, nghiên cứu về vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng và hoạt
chất sinh học của chúng có thể sẽ là hướng nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa
học và thực tiễn trong y học và nông nghiệp.
19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Tuyến trùng
Tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc do phòng
Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp.

Hình 2.1: Tuyến trùng (IJs) Steinernema sp.TĐ3
2.1.2. Ấu trùng Bướm sáp lớn
Ấu trùng Bướm sáp lớn (Galleria mellonella) đượ c nhân nuôi tại
phòng thí nghiệm Tuyến trùng học – Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật


21
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Bể ổn nhiệt
- Bộ điện di (Advance Tech, Nhật Bản)
- Cân phân tích 10
-4
g (Mettler Toledo)
- Kính hiển vi
- Kính hiển vi soi nổi
- Lò vi sóng
- Máy cô quay chân không
- Máy khuấy trộn Vortex (RotoLap, OSI)
- Máy lắc điều nhiệt
- Máy li tâm lạnh (Sorvall Biofuge Fresco)
- Máy ly tâm (Microcentrifuge- Sorvall, Mỹ)
- Máy PCR
- Máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad, Mỹ)
- Nồi hấp khử trùng (Nhật Bản)
- Tủ cấy vô trùng (Sanyo)
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu (-20
0
C), (-75
0
C) (Sanyo, Nhật Bản)
- Tủ nuôi ấm
- Tủ sấy
2.2. Môi trường
2.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh (Môi trường NBTA) [3]
Tryptone 1%, Cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, Bromothymon Blue

Tiến hành gây nhiễm khoảng 50-60 tuyến trùng/ấu trùng BSL. Để trong
tối ở 25-28
0
C. Sau 24, 48h. Thu những ấu trùng bướm sáp lớn đã chết để phân
lập vi khuẩn cộng sinh và thu tuyến trùng IJs bằng phương pháp Whitetrap để
giữ nguồn tuyến trùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
* Phương pháp whitetrap: Các xác ấu trùng BSL chết được để lên đĩa
đồng hồ, quấn parafilm và để trong tủ ấm 28
0
C trong khoảng 10-15 ngày, thu
ấu trùng cảm nhiễm, tinh sạch và bảo quản ở 12
0
C.
2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn cộng sinh
Ấu trùng bướm sáp lớn chết sau 24 -48h được chuyển vào một cốc thủy
tinh và rửa bằng cồn 70 trong 5 -10 phút. Mổ xác chết bằng panh kẹp lột
23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nhẹ phần lưng của xác sâu, chú ý không làm vỡ ruột ấu trùng bướm sáp lớn
để tránh nhiễm. Dùng que cấy vòng đã vô trùng dưới ngọn lửa đèn cồn lấy
một giọt huyết tương rồi cấy zic zăc trên đĩa petri có chứa môi trường NBTA.
Nuôi cấy trong tủ ấm ở 30
0
C, sau 24 - 48 h quan sát khuẩn lạc thu được.
2.3.4. Xác định hình thái khuẩn lạc, tế bào VKCS
2.3.4.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc các biến thể của VKCS [26,31]
Cấy chấm điểm vào giữa đĩa thạch có chứa môi trường NBTA + 0,8%
Agar. Để trong tủ ấm từ 24 -48h, quan sát sự khác nhau giữa khuẩn lạc pha sơ
cấp và pha thứ cấp của vi khuẩn cộng sinh.