BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

NGUYỄN QUANG HIỆU

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA HAI LOÀI HUPERZIA,
HỌ THẠCH TÙNG (LYCOPODIACEAE)
THU HÁI Ở TAM ĐẢO (VĨNH PHÚC)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

NGUYỄN QUANG HIỆU

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA HAI LOÀI HUPERZIA,

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em Vũ Thu Thủy - K67, các bạn, các
anh chị em chuyên ngành Dược học cổ truyền và các em sinh viên khóa 67, 68
làm đề tài tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ,
động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới gia đình và
bạn bè, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ và giùp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và đạt kết quả như ngày hôm nay.
Hà Nôi, ngày 31 tháng 3 năm 2017
Học viên
Nguyễn Quang Hiệu


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. Đặc điểm chung của họ Thạch tùng (Lycopodiaceae) ..................................................3
1.2. Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật chi Huperzia Bernh. .........................3
1.2.1. Vị trí phân loại chi Huperzia Bernh. ............................................................. 3
1.2.2. Đặc điểm phân bố chi Huperzia Bernh. ...................................................... 4
1.2.3. Đặc điểm thực vật chi Huperzia Bernh. ........................................................ 4
1.2.4. Một số loài thuộc chi Huperzia Bernh. tại Việt Nam........................................ 4
1.2.4.1. Huperzia cancellata (Spring) Trevis. ............................................................. 5
1.2.4.2. Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis. ........................................................ 5
1.2.4.3. Huperzia chinense (Christ.) Ching........................................................... 6
1.2.4.4. Huperzia hamiltonii (Spring) Trevis. ........................................................... 6
1.2.4.5. Huperzia subdisticha Mak. .......................................................................... 6

2.2. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................................28
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hóa chất.................................................................. 28
2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................................. 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................................29
2.3.1. Về đặc điểm thực vật................................................................................. 29
2.3.1.1. Phân tích hình thái thực vật của hai mẫu nghiên cứu ............................ 29
2.3.1.2. Giám định tên khoa học của hai mẫu nghiên cứu .................................. 29
2.3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm vi học của hai mẫu nghiên cứu ........................... 30
2.3.2. Về so sánh thành phần hóa học của hai mẫu nghiên cứu.......................... 30


2.3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng
hóa học. ............................................................................................................... 30
2.3.2.2. Sắc ký lớp mỏng ..................................................................................... 36
2.3.2.3. Chiết xuất và phân lập một alkaloid trong mỗi mẫu nghiên cứu. .......... 37
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 39
3.1. Mô tả đặc điểm hình thái ................................................................................................39
3.2. Nghiên cứu hiển vi ..........................................................................................................42
3.2.1. Đặc điểm vi phẫu....................................................................................... 42
3.2.2. Đặc điểm bột ............................................................................................. 44
3.3. Nghiên cứu về hóa học ...................................................................................................46
3.3.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất ...................................................................... 46
3.3.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng ............................................................... 47
3.3.2.1. Đối với dịch chiết methanol ................................................................... 47
3.3.2.2. Đối với dịch chiết alcaloid toàn phần .................................................... 50
3.3.3. Chiết xuất và phân lập một alkaloid trong mỗi mẫu nghiên cứu .............. 53
3.3.3.1. Chiết xuất ............................................................................................... 53
3.3.3.2. Phân lập, tinh chế ................................................................................... 54
3.3.3.3. Sơ bộ nhận dạng hai hợp chất S2 và C2 .................................................. 54
3.3.4. Xác định cấu trúc hóa học ......................................................................... 55

H-NMR:

Cộng hưởng từ hạt nhân proton (Hydro-1-Nuclear Magnetic
Resonance)

AchE:

Acetylcholinesterase

Cắn HC:

Cắn alcaloid toàn phần loài Huperzia carinata (Desv. ex Poir.) Trevis.

Cắn HS:

Cắn alcaloid toàn phần loài Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.

CHCl3:

Cloroform

COSY:

Correlaction spectroscopy

D/c:

Dịch chiết

Dd:

Heteronuclear single quantum coherence

IR:

Infrared Spectroscopy.

IC50:

Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

MeOH:

Methanol

MS:

Mass Spectrum

NOESY:

Nuclear overhauser effect spectrocopy

NXB:

Nhà xuất bản

PTLC:

Preparative Thin Layer Chromatography



Ultra Violet

VAST:

Vietnam Academy of Science and Technology

WHO:

Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số lycopodium alcaloid phân lập được từ chi Huperzia Bernh. ....... 13
Bảng 1.2. Một số terpenoid phân lập được từ Huperzia Bernh. ......................... 22
Bảng 3. 3. Kết quả định tính các nhóm chất trong hai mẫu nghiên cứu bằng phản
ứng thường quy ................................................................................. 46
Bảng 3.4. Kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết methanol hai loài nghiên cứu
triển khai với hệ dung môi II ............................................................ 49
Bảng 3.5. Kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết alcaloid toàn phần hai loài
nghiên cứu triển khai với hệ dung môi IV ........................................ 52
Bảng 3.6. Độ tan của S2 và C2 trong một số dung môi ....................................... 54
Bảng 3.7. Định tính S2 và C2 trong một số dung môi.......................................... 55
Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR proton H1 và C13 của hợp chất S2 .......................... 55
Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR proton H1 và C13 của hợp chất C2 .......................... 58
Bảng 4.10. Phân biệt các mẫu Thạch tùng dựa vào đặc điểm hình thái .................. 62
Bảng 4.11. Phân biệt các mẫu Thạch tùng dựa vào đặc điểm hiển vi ................ 62


DANH MỤC CÁC HÌNH

loại thuốc đầy tiềm năng cho việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer.
Trên thực tế, thuốc "Shuangyiping", được bào chế có huperzin A chiết xuất từ
Huperzia serrata, được phát triển vào năm 1996 và nó đã được chấp nhận như
là một loại thuốc mới để điều trị triệu chứng của Alzheimer ở Trung Quốc
[51]. Huperzin A cũng đã được FDA chấp nhận là thực phẩm chức năng và
được bán trên thị trường Hoa Kỳ dùng dưới dạng viên nén hoặc dạng viên
nang (200-400 µg/ngày) cho tình trạng suy giảm trí nhớ [29], [84]. Ở Việt
Nam, loài Thạch tùng răng cưa có diện phân bố hẹp và số lượng ít ; mặc dù
vậy loài này vẫn bị khai thác quá mức làm cho nguồn nguyên liệu trong tự
nhiên dần bị cạn kiệt (trước đây loài này đã từng bị đưa vào sách đỏ). Do vậy,
nghiên cứu của chúng tôi dự kiến so sánh cả về đặc điểm thực vật và thành
phần hóa học giữa loài Thạch tùng răng cưa với một loài khác cùng chi
Huperzia có ở Tam Đảo, từ đó đề xuất khả năng thay thế nguồn nguyên liệu
khan hiếm này.
Tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc) đã phát hiện có một số loài Huperzia, họ
Thạch tùng hay Thông đất (Lycopodiaceae) như: Thạch tùng răng cưa,
Thạch tùng Hamilton, Thạch tùng sóng, Thạch tùng song đính... Những loài
này phân bố ở nhiều nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc và vùng Trung Mỹ.
Ở nước ta, chúng phân bố rải rác tại các tỉnh trung du và vùng núi cao Tây
Bắc, miền Trung và Tây Nguyên [4], [12]. Đây là những cây cỏ sống lâu
năm; thân đứng, nằm hoặc thõng xuống đất, phân nhánh theo lối rẽ đôi; lá
nhỏ đơn một gân, thường xếp theo đường xoắn ốc, mọc so le. Cây thường
mọc thành đám nhỏ trên đất ẩm có tầng dày và nhiều mùn hay trên gốc cây
có nhiều rêu trong rừng rậm thường xanh, trên đá ẩm ở độ cao từ 10003000m [4], [78].
1


Đây là các loài cây thuốc quý, nhưng chưa được nghiên cứu theo hướng
ứng dụng trong điều trị. Cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào công
bố đầy đủ về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của các loài Huperzia,

Theo hệ thống phân loại thực vật của Ollgaard (1987), chi Huperzia
Bernh. được phân loại như sau:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Thạch tùng: Lycopodiophyta
Lớp Thạch tùng: Lycopodiopsida
Bộ Thạch tùng: Lycopodiales
Họ Thông đất: Lycopodiaceae
Chi: Huperzia Bernh. [56].
Sự phân nhóm đối với các họ và chi này vẫn chưa đạt được sự thống nhất.
Trước đây, theo hệ thống phân loại của Ching (1978), bộ Lycopodiales bao gồm
hai họ, họ Huperziaceae và họ Lycopodiaceae. Trong đó, họ Huperziaceae có 2
chi là Huperzia, Phlegmariurus còn họ Lycopodiaceae được phân thành 5 chi:
Lycopodium, Lycopodiella, Phahinhaea, Diphasiastrum và Lycopodiastrum
3


[51]. Dựa trên sự phân loại của Ching, Holub (1985) cũng phân bộ Lycopodiales
thành 2 họ, tuy nhiên họ Huperziaceae chỉ có một chi duy nhất là Huperzia, họ
Lycopodiaceae được chia thành nhiều chi hơn, bên cạnh 5 chi kể trên thì còn có
thêm các chi Diphasiopsis, Diphasium, Pseudolycopodium, Lateristochys,
Phylloglossum [51]. Năm 1987, Ollgaard đã đề xuất sự phân loại mới: chia họ
Thông đất (Lycopodiaceae) thành 4 chi là: Lycopodium L., Lycopodiella Holub,
Huperzia Bernh. và Phylloglossum Kunze [56]. Và cho tới nay, hệ thống phân
loại này của Ollgaard được chấp nhận rộng rãi nhất trên thế giới.
Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, họ Thông đất phân bố ở Việt Nam có 3
chi gồm: Lycopodiella Holub., Lycopodium L., Huperzia Bernh. [4].
1.2.2. Đặc điểm phân bố chi Huperzia Bernh.
Chi Huperzia Bernh. là chi lớn nhất trong họ Thông đất với khoảng trên
300 loài, phân bố rộng khắp toàn cầu, trải dài từ vùng nhiệt đới (chủ yếu ở đây
là các loài sống biểu sinh) cho tới Bắc Cực và phía Bắc của Nam cực [82].

Tên đồng nghĩa: Lycopodium squarrosum (Forst.) Trevis.
Tên Việt Nam: Râu rồng, Thạch tùng vảy, Thông đất nhám.
Mô tả: Cây thảo phụ sinh, thân thòng thường mập, hình trụ, mọc đứng
ở phần gốc, sau gập thõng xuống dài 30-70 cm [4], dài 50-60 cm [3], 1-2 lần
lưỡng phân, to 4-5 mm. Lá hẹp, nhọn, xếp xoắn ốc hình dải - ngọn giáo, tỏa
rộng ra, không cuống, mép nguyên, lá ở đỉnh thì ngắn hơn lá ở gốc. Chùy dài
ở dưới chót nhánh. Bào tử diệp không khác lá thường, chỉ hơi nhỏ hơn; bào tử
nang hình thận, nở thành 2 mảnh không bằng nhau [4]. Bộ phận sinh sản ở
ngọn thân thành bông không phân nhánh, dài khoảng 10 cm, lá bào tử giống
lá thật, nhưng ngắn hơn 2 lần, thẳng, nhọn, hơi phình ở gốc. Túi bào tử hình
thận, có 2 mảnh vỏ bằng nhau [1], [12].
Sinh thái: Thường mọc ở thân cây, đá ẩm, vùng núi: Râu rồng là cây ưa
ẩm, ưa bóng, thích nghi với điều kiện khí hậu mát và ẩm vùng núi. Cây thường
bám trên vách đá, hoặc trên thân, cành những cây gỗ lớn trong rừng kín thường
xanh ẩm còn nguyên sinh hay tương đối nguyên sinh. Cây sinh sản bằng bào tử
diễn ra trong môi trường nước (chủ yếu là nước mưa). Cây cũng có khả năng
mọc chồi nhanh sau khi bị cắt hoặc bị gãy. Hiện nay, tình trạng trồng làm cảnh
khác môi trường sống tự nhiên của nó và kích thước quẩn thể cây nhỏ nên râu
rồng có thể xếp vào nhóm cây đang bị đe dọa [1].
Phân bố khá hẹp, ở một số vùng núi thấp, có khi cả núi trung bình của
Cao Bằng (Trà Lĩnh), Thanh Hóa, Lâm Đồng (núi Lang Bian) và Khánh Hòa
(hòn Vọng Phu). Còn gặp ở Lào, Campuchia cũng như nhiều nước thuộc xứ
5


hệ thực vật cổ nhiệt đới. Trên thế giới còn có ở Trung Quốc, Lào, từ
Mađagátxca đến châu Đại Dương, Đài Loan và Himalaya [12].
1.2.4.3. Huperzia chinense (Christ.) Ching [3], [4], [12]
Tên đồng nghĩa: Lycopodium chinense (Christ.) Ching
Tên Việt Nam: Thạch tùng nhiều bông.

Lá xoắn ốc, xoan dài 1cm, thường nằm vào thân, gân giữa rõ. Chùy dài 15 cm, 1-2
lần lưỡng phân; bào tử diệp nhỏ, xoan tròn, mở thành 2 mảnh bằng nhau.
Phân bố: Vùng núi cao Quảng Trị, Nha Trang, Đà Lạt.
1.2.4.7. Huperzia phlegmaria (L.) Rothm. [3], [4], [12]
Tên đồng nghĩa: Lycopodium phlegmaria (L.) Rothm.
Tên Việt Nam: Thạch tùng đuôi ngựa, Râu cây, Mã vĩ sam.
Mô tả: Cây thảo phụ sinh có thân thõng, dài 30-100 cm, 1-4 lần lưỡng
phân, to 3 mm. Lá xoan tam giác, rộng nhất ở đáy, dài 6-13 cm, gắn thẳng góc
vào thân. Chùy ở ngọn nhánh, dài đến 16 cm; bào tử diệp nhỏ, dài cỡ 1 mm;
bào tử nang mở thành 2 mảnh bằng nhau.
Sinh thái: Gặp ở độ cao 700-2000m. Ưa ẩm và bóng, thường sống bám
trên cây gỗ hay các tảng đá ẩm có nhiều rêu và mùn trong rừng rậm thường
xanh, nhiều khi là rừng mây mù.
Phân bố: Rộng ở nhiều vùng núi thấp và trung bình ở Trung Bộ vào tới Đà
Nẵng, Kiên Giang. Cũng có ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản.
1.2.4.8. Huperzia salvinoides (Herter) Alston. [3], [4], [12]
Tên Việt Nam: Thạch tùng bèo.
Mô tả: Cây thảo phụ sinh có thân lưỡng phân đều, to 1 mm. Lá nhỏ, gắn theo
4 hàng, xoan rộng 1 mm, dầy, cứng, gần như không cuống. Chùy ở ngọn nhánh,
hẹp với bào tử diệp nhỏ, bào tử nang tròn, tự khai 2 mảnh bằng nhau.
Sinh thái: Ưa ẩm và bóng, thường sống bám trên cây gỗ trong rừng rậm
thường xanh, nhiều khi là rừng mây mù, trên đá vôi.
Phân bố: Ở rừng già trung du phía bắc. Còn gặp ở một số nước nhiệt
đới châu Á.
1.2.4.9. Huperzia serrata (Thunb.) Trevis. [3], [4], [12]
Tên đồng nghĩa: Lycopodium serratum (Thunb.) Trevis.
Tên Việt Nam: Thạch tùng răng, Thạch tùng răng cưa, Chân sói.
Mô tả: Cây mọc ở đất. Thân đứng cao 15-40cm, đơn hay lưỡng phân 12 lần, đường kính khoảng 2mm, hình trụ. Lá hình thon hẹp (bầu dục - mũi
7


ưu thế trong các loài thuộc chi này [52].
1.3.1. Nhóm hợp chất alcaloid
Kể từ khi huperzin A, một chất ức chế acetylcholinesterase mạnh, thuận
8


nghịch, có chọn lọc và được hứa hẹn sẽ là một loại thuốc đầy tiềm năng cho việc
điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer được phát hiện từ loài Thạch tùng
răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis., nhiều nỗ lực nghiên cứu phân lập
các alcaloid mới từ Huperzia serrata và các cây trong chi Huperzia Bernh. đã
được thực hiện bởi nhiều nhóm nghiên cứu, do đó đã phân lập được một loạt các
hợp chất hóa học, đặc biệt là các lycopodium alcaloid có cấu trúc đa dạng với
nhiều khung độc đáo [49], [85].
Lycopodium alcaloid là alcaloid có cấu trúc khung quinolizin, pyridin
hoặc α-pyridon, có cấu trúc hệ thống vòng độc đáo, công thức phân tử thường
là C16N hoặc C16N2 với 3 hoặc 4 vòng, chúng được chia thành 4 nhóm dựa
vào cấu trúc khung carbon và con đường sinh tổng hợp: lycopodin, lycodin,
fawcettimin và miscellaneous. Những alcaloid này thường chứa một bộ khung
gồm 16 carbon, đôi khi nhiều hơn như 32 carbon (trường hợp dimer hóa) hoặc
ít hơn 16C (do sự phân tách các liên kết) [48], [85]. Cho tới nay đã có 201
lycopodium alcaloid được phân lập từ 54 loài thuộc chi Huperzia Bernh.[48].
1.3.1.1. Nhóm lycopodin alcaloid
Đây là nhóm có số lượng lớn nhất và phân bố rộng rãi nhất trong số các
lycopodium alcaloid đã biết. Lycopodin alcaloid 1-40 (Bảng 1.1.) đã được phân
lập từ các loài Huperzia serrata, Huperzia selago, Huperzia miyoshiana,
Huperzia chinense, Huperzia saururus, Huperzia lucidulum. Nhóm này được đặc
trưng bởi bốn vòng sáu cạnh liên kết với nhau, vòng A và C tạo thành hệ thống
vòng quinolizidine, liên kết C=C có thể tồn tại ở vị trí C-11 và C-8. Các vị trí C-5,
C-6, C-8, C-10 và C-12 thường bị oxy hóa thành nhóm carbonyl và hydroxyl hoặc
bị este hóa bởi acid acetic và acid dihydroferulic; nhóm carbonyl trong vòng B



thống vòng 5/6/6/6 mới [85].

Hình 1.3. Công thức tổng quát của nhóm lycodin alcaloid

44

49
Hình 1.4. Một số hợp chất của nhóm lycodin alcaloid
1.3.1.3. Nhóm fawcettinmin alcaloid
Alkaloid 56-101 (Bảng 1.1.) thuộc về nhóm fawcettimin, được coi là
sản phẩm của sự di chuyển liên kết C-4/C-13 thành liên kết C-4/C-12 từ các
tiền chất là nhóm lycopodin, C-13 thường bị oxy hóa để tạo nhóm hydroxyl
hoặc tạo thành liên kết C=C với C-14. Phlegmariurin A (94), B (95) được
hình thành bằng cách phân cắt liên kết C-12, trong khi phlegmariurin C là
lycopodium alcaloid dime đầu tiên được tạo thành bởi sự ghép cặp hai nửa
phlegmariurin A ở vị trí C-6. Lycopodin A và 8α-hydroxy lycopodin A có
một vòng lacton sáu cạnh giữa C-5 và C-13 với một hệ thống vòng tetracyclic
6/6/6/7 mới, được hình thành bởi sự phân cắt liên kết C-4 và tạo liên kết mới
giữa C-4 và C-12. Trong obscurinin, một vòng mới được hình thành bởi một
nguyên tố nitơ nối giữa C-3 và C-13, trong khi đó hợp chất 8-deoxy-13dehydroserratinin hình thành một vòng pyrol bổ sung giữa nguyên tử N và C4. Lycoposerramin U (87), lycoflexin và N-oxid của nó có thể là sản phẩm
của quá trình N-methyl hóa, hình thành liên kết C-C giữa N-methyl và C-4.
11


Carinatin B được tạo thành bằng cách phá vỡ liên kết N-C-13 và nối C-4 với
C-9, tạo ra một vòng piperidin, một vòng cyclopentanon, một vòng
cyclopentan và một vòng β-cyclohexanon không no với một nhóm methyl
thay thế ở vị trí C-15. Malycorin đã được hình thành bằng cách liên kết

1.

Acetyllycoclavine

Lycopodium serratum [63]

2.

Acrifoline

Lycopodium selago [59]
13


[∆11,12,8-oxo-dihydrolycopodine (5βOH)
3.

Anhydrodihydrolycopodine

Lycopodium saururus [61]

4.

Annotinine

Lycopodium selago [51]

5.

Clavolonine (8β-hydroxylycopodine)


Huperzia serrata [75]

10.

12-Epilycodoline (isolycodoline or
pseudoselagine)

Huperzia miyoshiana [77]
Lycopodium lucidulum [27,
61] Lycopodium selago [22]

11.

12-Epilycodoline N-oxide [(12α,
15R)-12-hydroxy-15methyllycopodan-5-one N-oxide]

Huperzia serrata [67]

12.

Fawcettiine (β-lofoline,5β-O-acetyl8β-hydroxydihydro-lycopodine)

Lycopodium saururus [28,
59]

13.

Flabelliformine
(4α-hydroxylycopodine)