TRƯ

QUÁCH TH
NGHIÊN C
VÀ THÀNH PH
LOÀI THU
ỘC CHI
BÀ R
KHÓA

BỘ Y TẾ
TRƯ
ỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
QUÁCH TH
Ị THÚY NGA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT
ỘC CHI
STEPHANIA
LOUR.

1. TS. Nguyễn Quốc Huy
2. ThS.NCS. Hoàng Văn Thủy
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực vật
HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận này em đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều
kiện của Ban Giám Hiệu, phòng Đào Tạo, Trường Đại Học Dược Hà Nội, sự hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô ở Bộ Môn Thực vật, gia đình và bạn bè.
Em xin được gửi tới lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS.Nguyễn Quốc Huy,
ThS.NCSHoàng Văn Thủy, các thầy đã trực tiếp hướng dẫn em tận tình trong quá
trình làm khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô Bộ môn Thực Vật,
Trường ĐH Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá
trình làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới DS. Nguyễn Thị Thùy Linh, bạn Phạm
Thị Việt Hồng lớp M2K65, Lương Thị Lan lớp M1K65, Tống Xuân Quang lớp
A3K65, em Nguyễn Thị Mai Hạnh lớp M3K66, em Lê Thiên Kim lớp P1K66, những
người đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện, và em xin gửi tới gia đình, bạn
bè, những người đã động viên, khích lệ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa
luận.

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2015

2.1.1.Nguyên liệu 13
2.1.2.Hóa chất và dụng cụ 13
2.2.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.2.1.Nghiên cứu về thực vật 14
2.2.2.Nghiên cứu về hóa học 14
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.3.1.Phương pháp nghiên cứu về thực vật 14
2.3.2.Phương pháp nghiên cứu về hóa học 14
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1.THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20
3.1.1.Kết quả về thực vật 20
3.1.2.Kết quả về thành phần hóa học 24
3.2.BÀN LUẬN 35
3.2.1.Về thực vật 35
3.2.2.Về hóa học 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy (Sắc ký lớp mỏng hiệu DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của oxostephanin 9
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái của loài nghiên cứu 21
Hình 3.2. Đặc điểm bột dược liệu 22
Hình 3.3.Vi phẫu thân 22
Hình 3.4.Vi phẫu cuống lá 23
Hình 3.5.Vi phẫu lá 23
Hình 3.6. SKLM dịch chiết tổng 31
Hình 3.7. SKLM của 3 hệ dung môi khác nhau 31
Hình 3.8. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33
Hình 3.9. Sác ký đồ của các mẫu chuẩn và thử 34

 Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu; bán định lượng oxostephanin
bằng phương pháp HPTLC.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI STEPHANIA LOUR.
1.1.1. Vị trí phân loại chi Stephania Lour.
Theo tài liệu [6], [24], [32], chi Stephania Lour.thuộc:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)
Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)
Bộ Hoàng liên (Ranunculales)
Phân bộ Tiết dê (Menispermineae)
Họ Tiết dê (Menispermaceae)
1.1.2. Đặc điểm của chi Stephania Lour.
Theo tài liệu [2], [19], [24], [32], chi Stephania Lour.được mô tả như sau:
Dây leo, sống lâu năm, hầu hết mảnh khảnh. Thân cỏ. Thân non thường
nhẵn, xanh nhạt, xanh bóng hay xanh thẫm. Thân già thường có rãnh dọc, mụn cóc
sần sùi màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to thành rễ
củ.Rễ củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hay có hình dạng bất định.
Tùy thuộc vào loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà vỏ củ có nhiều thay
đổi (nhẵn, xù xì, màu nâu xám nhạt, xám tro hay đen,…)
Lá mọc so le.Cuống lá thường gấp khúc ở gốc, hai đầu phình lên, đính vào
phiến lá khoảng 1/5-1/3 chiều dài phiến lá. Phiến lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc
rải rác có lông, hình lọng, thường hình trứng hay gần tròn, có cạnh hoặc tam giác
tròn, mép lá nguyên hoặc chia thùy, gân lá hình chân vịt, gồm 8-13 gân xuất phát từ
đỉnh cuống lá.
Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay trên thân cây già không lá, thường có dạng tán

nạc. Quả chưa rõ.
1.1.3.2. Stephania yunnanensis H. S. Lo [32]
Dây leo, thân thảo, dài 4 – 5m, nhẵn. Thân và lá đều có dịch màu đỏ. Cuống
lá gần bằng hoặc dài hơn thân lá, lá có hình dạng tam giác rộng đến tam giác nhọn,
5 – 11cm, chiều dài lá gần bằng hoặc dài hơn một ít chiều rộng lá, lá mỏng như
4

màng, cả 2mặt đều nhẵn, gốc lá cụt hoặc hơi nhọn, đỉnh lá tròn hoặc hơi tù, mép
nguyên hoặc hơi lượn sóng; gồm 9 – 10 gân lá mọc từ gốc, tất cả đều màu nâu khi
khô. Cụm hoa mọc dạng xim tán. Hoa đực có cuống cụm hoa dài 2 – 6cm, hoặc dài
hơn, tán gồm 4 – 8 nhánh, có cuống mỗi nhánh dài hơn 2,5cm, lá bắc hình mũi mác
dài 1,5 – 2,5mm. Hoa đực đài 6 chia 2 vòng, mỗi vòng 3 đài, vòng ngoài nhỏ hơn,
hình trứng hơi hẹp ở gốc, dài 1,2 – 1,6 mm, tràng 3, kích thước 1×1,8 mm. Hoa cái
dạng tán, dài 1 – 2,5cm. Cuống quả không dày, dài 5mm. Quả hạch màu đỏ khi
chín, hình hơi tròn, 6-7mm.
1.1.3.3. Stephania longipes H. S. Lo [32]
Dây leo, thân thảo, nhẵn. Thân và lá đều có dịch màu đỏ, màu nâu khi khô,
dọc thân có khía.Cuống lá rất dài, ít nhất là hơn gấp 2 lần chiều dài của lá. Lá hình
tam giác tròn, kích thước 9 -15 × 8 – 14cm, màu xanh đen khi khô, gốc lá cụt, mép
lá có răng cưa, ngọn lá nhọn đôi khi hơi tù, gồm 10 – 11 gân lá. Cụm hoa mọc dạng
xim tán. Cuống cụm hoa đực 3 – 4cm, tán gồm 5 – 7 nhánh, cuống tán dài 1,5cm,
cuống mỗi hoa dài 3 – 5mm rõ khi khô. Hoa đực đài 6 – 8, mép nguyên, màu nâu
khi khô, kích thước 1,2 – 1,5mm, mỏng như màng. Tràng 3 hoặc 4, phẳng, kích
thước 0,8 – 1 mm, gốc hơi rộng. Hoa cái có cuống cụm hoa dài 4 – 11cm, tán có 10
-12 nhánh có cuống dài 8 – 15mm, cuống hoa dài 3mm. Hoa cái có đài 1, tràng 2,
hơi rộng.
1.1.3.4. Stephania dielsiana Y.C.Wu. [17], [32]
Tên thường dùng: Củ dòm. Tên khác: Bình vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên
Quang), củ gà ấp. Phân bố: Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa
Bình, Phú Thọ, Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh. Dây leo nhỏ, sống

Ở nước ta, các loài Bình vôi phân bố rộng khắp cả 3 miền [16], [19], [25]:
 Miền Bắc: Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang,
Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hòa Bình, Nam
Định, Ninh Bình.
 Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng,
Bình Định, Phú Yên, Lâm Đồng, Đắc Lắc.
 Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu.
6

Bảng 1.1.Phân bố của các loài thuộc chi Stephania Lour.ở Việt Nam
STT Tên loài Tên Việt Nam

Phân bố Tài liệu
1 S. brachyandra Diels.
Bình vôi núi
cao, Bình vôi
nhị ngắn
Lai Châu, Lào Cai.

7, 9, 17
2 S. cambodia Gagnep.
Bình vôi
Campuchia
Đắc Lắc, Lâm
Đồng.
7, 9, 17
3 S. cepharantha Hayata Hán phòng
kỷ, Bình vôi
hoa đầu
Quảng Ninh (Cẩm

7 S. hainanensis H.S.Lo Bình vôi Vùng núi. 9, 17, 25
8
S.hernandifolia (Willd.) Dây mối, Dây Lào Cai, Hà Nội,
7, 9, 17
7

STT Tên loài Tên Việt Nam

Phân bố Tài liệu
Spreng lõi tiền
Ninh Bình, Quảng
Nam, Đà Nẵng,
Ninh Thuận, Lâm
Đồng, Đồng Nai.
9
S. japonica (Thunb.)
Miers
Thiên kim
đằng, Dây lõi
tiền
Hà Nội, Nam
Định, Nghệ An,
Đồng Nai.
7, 16, 17,
19
10
S. japonica (Thunb.)
Miers var. discolor (Bl)
Forman
Dây mối, Lõi

Bình vôi lá
nhỏ, Ngải
tượng trắng
Ninh Bình, Bình
Định, Phú Yên,
Khánh Hòa, Bình
Thuận, Ninh
Thuận, Bà Rịa –
Vũng Tàu.
7, 9, 16,
25
15 S. sinica Diels
Bình vôi tán
ngắn
Lạng Sơn, Quảng
Ninh, Hà Nội, Hòa
Bình, Hà Nam,
9, 16, 25
8

STT Tên loài Tên Việt Nam

Phân bố Tài liệu
Ninh Bình tới Bà
Rịa – Vũng Tàu.
16 S. tetrandra S. Moore
Phấn phòng
kỷ
Lào Cai, Yên Bái,
Hà Bắc, Hà Giang,

2
Bis benzyl isoquinolin Gồm 47 chất được phân lập từ 14 loài,
trong đó có chất Cepharanthin
(C
37
H
38
N
2
O
6
)
3
Aporphin Gồm 75 chất được phân lập từ 33 loài,
trong đó có chất Roemerin (C
18
H
19
NO
3
)
4 Proaporphin Gồm 8 chất được phân lập từ 9 loài, trong
9

đó có chất Stepharin (C
18
H
19
NO
3

trong đó có chất Cephanramin (C
19
H
23
NO
4
)
8 Eribidin Có 1 chất la Protostephanin (C
21
H
27
NO
4
)
9
Stephaoxocan Gồm 2 chất, trong đó có chất
Stephaoxocanin (C
18
H
21
NO
4
)
1.3.2. Những nghiên cứu về oxostephanin trong chi Stephania Lour.
 Oxostephanin là một alcaloid mới đã được phân lập từ loài có dịch màu đỏ
S.dielsiana Y. C. Wu ở Việt Nam [17].
 Trên thế giới, oxostephanin là alcaloid đã được phân lập từ 3 loài: S. zippeliana,
S. japonica, S. suberosa [34], [35].
 Oxostephanin thuộc nhóm aporphin, có công thức phân tử là C
18

Hình 1.1.Cấu trúc hóa học của oxostephanin
1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.4.1. Sắc kí lớp mỏng
 Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một
lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá
10

đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt
trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi
ion… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung
môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1].
 R
f
là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ R
f
. Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
R
f
= d
R
/ d
M
Trong đó:d
R
: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
d
M

= 0,3 – 0,75
thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết[4].
- So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai
triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau. Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3
vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn). Nếu
trên cả 3 sắc kí đồ mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số R
f
, về hình
dạng vết, về màu sắc vết trước và sau khi hiện màu)thì có thể sơ bộ kết luận
mẫu thử và mẫu chuẩn là đồng nhất [4].
- Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một qui trình chiết xuất như nhau, dịch chiết
của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu
chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng). Sau đó so
sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, R
f
của các vết, hình dạng các vết,
màu sắc các vết, tỉ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược
liệu chuẩn [4].
- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất định,
trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là
không đổi về số vết, về trị số R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết,
tỉ lệ tương đối giữa các vết…Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu
trong công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu [4].
- Theo kết quả thống kê trong tài liệu [15], SKLM là một trong các tiêu chuẩn
định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển.
Dược điển thảo dược Hoa Kì có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010)
có 873 chuyên luận và con số này trong Dược điển Việt NamIV là 168. Hình
ảnh sắc kí đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu. Ứng dụng này giúp

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ.
2.1.1. Nguyên liệu
 Mẫu nghiên cứu được thu hái tại Bà Rịa-Vũng Tàu, được phân tích và mô tả
đặc điểm thực vật,sau đó được đem về trồng tại vườn thực vật trường Đại học
Dược Hà Nội và vườn nghiên cứu ở Ba Vì để theo dõi sự phát triển của cây, thu
các cơ quan sinh trưởng và sinh sản trong 2 năm 2013 và 2014 để giám định tên
khoa học. Mẫu được lưu tại Phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội với
mã số tiêu bản là: HNIP/18073/14.
 Mẫu nghiên cứu để xây dựng quy trình bán định lượng bằng HPTLC: Mẫu củ
và lá cây loài nghiên cứu.
 Mẫu củ được rửa sạch, thái lát, sấy khô và xay thành bột dược liệu.
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ
2.1.2.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
 Kính hiển vi Leica.
 Kính lúp soi nổi Nikon của Nhật.
 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm máy Linomat 5,
ADC2, TLC Visualizer, phần mềm winCATS, phần mềm VideoScan.
 Bình chiết Soxhlet 250ml.
 Bình triển khai sắc ký.
 Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F
254
(Merck) dành cho HPTLC và TLC.
 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 100 và 200 ml; bình định mức 100 ml; pipet 1
ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh.
 Tủ sấy WiseVen (R) WOF.
 Máy đo hàm ẩm Precisa HA60.
2.1.2.2. Hóa chất
 Chloroform, Methanol, n-Butanol, Dichloromethan, Nước cất, Ammoniac đặc,
Ethylacetat, n – hexan.

- Chuẩn bị dịch chấm sắc kí:
+ Mẫu thử:lấy 10g bột dược liệu, chiết như phần định tính bằng các phản ứng
hóa học rồi cô cách thủy đến khô, cắn còn lại để nguội, hòa tan trong methanol.
Dịch chiết dùng để chấm sắc kí.
15

+Mẫu chuẩn: Chất chuẩn oxostephanin (độ tinh khiết 99.90%) [21].
- Dung môi khai triển [12], [20]:
+ Hệ 1: Chloroform/methanol = 9/1.
+ Hệ 2: Chloroform/methanol/ammoniac = 50/9/1.
+ Hệ 3: Toluen/aceton/cồn/ammoniac = 45/45/7/3.
 Tiến hành:
+ Chấm lên bản mỏng dung dịch mẫu thử trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy
bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Phun hiện màu bằng thuốc thử
Dragendorff.
+ Chấm song song mẫu thử và mẫu oxostephanin chuẩn trên cùng một bản
mỏng, triển khai ở 3 hệ dung môi trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng
ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Soi dưới ánh sáng có bước sóng 366 nm.
2.3.2.3. Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu
Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp được ghi trong Dược điển
Việt Nam III [5]:
Cân chính xác 10,00 g bột dược liệu đã sấy khô. Thấm ẩm bằng ammoniac
6N trong 2 giờ.Sau đó cho vào túi lọc, đặt vào bình Sohxlet, chiết bằng chloroform
cho đến hết alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff). Cất thu hồi chloroform,
hòa tan cắn trong dung dịch HCl 5% (5-7 lần, mỗi lần 5 ml). Rửa dịch chiết acid
bằng ether dầu hỏa (3 lần, mỗi lần 10ml); kiềm hóa bằng amoniac 6N đến pH = 10-
11. Chiết bằng chloroform 5 lần, mỗi lần 10ml để lấy hết alcaloid. Tập trung dịch
chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính.Bốc hơi dịch chiết tới khô. Hòa tan cắn
với một lượng chính xác 20 ml dung dịch H
2

Cl
2
cho đến hết alcaloid.
+ Lựa chọn độ pha loãng: Dịch chiết cô đến cắn. Hòa tan cắn trong chính xác 25,
50, 100, 200 ml MeOH để được các dung dịch chấm mẫu. Tiến hành triển khai
sắc ký mẫu thử với các độ pha loãng khác nhau để lựa chọn độ pha loãng phù
hợp.
- Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn: Triển khai
SKLMcác mẫu thử và mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng. Xây dựng đường
chuẩn định lượng dựa trên mối liên hệ giữa nồng độ oxostephanin và diện tích
pic đáp ứng. Từ đường chuẩn định lượng, khảo sát khoảng nồng độ
oxostephanin trong các mẫu thử, từ đó lựa chọn được nồng độ của dãy dung dịch
oxostephanin chuẩn.
- Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC [29], [36]:
+ Bản mỏng:Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F
254
(Merck) hoạt hóa ở 110˚C
trong 30 phút. Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm.
+ Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu
Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 1,5 cm, cách mép dung
môi từ 0,8 – 1 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là
1,5 cm. Độ dài băng chấm 6 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2 µl. Mỗi bản mỏng
kích thước 20 × 10 cm chấm tối đa 15 vết.
+ Hệ dung môi khai triển: Khai triển một số hệ dung môi sau [12], [20]
Chloroform: methanol: ammoniac (50:9:1).
Chloroform: methanol (9:1).
Toluen: aceton : cồn : ammoniac (45:45:7:3).
17

Lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực phù hợp, cho hiệu năng tách tốt, đồng

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần
phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu
sắc, giá trị R
f
với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các