NÔNG THỊ THANH HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
CÂY NẦN TRẮNG
(Dioscorea chingii Prain & Burkill)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Nội, người thầy tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Thầy đã truyền cho em những kiến thức quý báu cùng tác phong làm việc khoa học,
kiên trì. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS. Hoàng Thị Tuyết Nhung bộ môn
Hóa vô cơ trường Đại học Dược Hà Nội, cô đã luôn quan tâm sát sao và tận tình
hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên tại bộ
môn Dược liệu và phòng Đông Dược – Dược liệu Viện Kiểm Nghiệm đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận.

Em xin trân trọng cảm ơn ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, các thầy cô giáo
giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền cho em kiến thức cùng nhiệt
huyết của thầy cô trong suốt những năm học tập tại trường.

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, người thân đã ở bên động viên,
giúp đỡ em thực hiện khóa luận. Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Nông Thị Thanh Hiền
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Chi Dioscorea L. 2

3.1.3.1. Đặc điểm vi phẫu lá 18
3.1.3.2. Vi phẫu thân 19
3.1.3.3. Vi phẫu thân rễ 20
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 21
3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 21
3.2.1.1. Định tính alcaloid 21
3.2.1.2. Định tính glycosid tim 22
3.2.1.3. Định tính coumarin 23
3.2.1.4. Định tính tanin 24
3.2.1.5. Định tính flavonoid 24
3.2.1.6. Định tính anthranoid 25
3.2.1.7. Định tính chất béo, caroten, sterol 25
3.2.1.8. Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin 26
3.2.1.9. Định tính polysaccharid 27
3.2.1.10. Định tính saponin 27
3.2.2. Sắc ký lớp mỏng 31
3.2.3. Định lượng diosgenin 33
3.2.4. Chiết xuất, phân lập và xác minh mẫu thử. 35
3.2.4.1. Chiết xuất 35
3.2.4.2. Phân lập chất D2. 36
3.2.4.3. Xác minh chất D2 38
3.3. Bàn luận 42
KẾT LUẬN 44
ĐỀ XUẤT 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


STT : Số thứ tự
TT : Thuốc thử
RSD : Relative standard devition (Độ lệch chuẩn tương đối)
UV : Ultra violet (Phổ tử ngoại)
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang
Bảng 1.1
: Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất
diosgenin trong công nghiệp
6
Bảng 3.1 : Tiến hành xác định chỉ số phá huyết

29
Bảng 3.2
: Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong Nần trắng

30
Bảng 3.3
: Kết quả đo diện tích pic của mẫu diosgenin đối chiếu 34
Bảng 3.4
: Kết quả định lượng HPLC của 6 mẫu nần trắng


Một số đặc điểm bột thân rễ Nần trắng 18
Hình 3.7:
Vi phẫu gân lá Nần trắng 19
Hình 3.8:
Vi phẫu phiến lá Nần trắng 19
Hình 3.9 : Vi phẫu thân Nần trắng 20
Hình 3.10 : Vi phẫu thân rễ Nần trắng 21
Hình 3.11 : Sắc ký lớp mỏng dịch chiết toàn phần (T), diosgenin đối
chiếu (C)

32
Hình 3.12
: Đồ thị đường chuẩn diosgenin 34
Hình 3.13
: Tinh thể chất D2 37
Hình 3.14
: Sắc ký lớp mỏng chất D2 với diosgenin đối chiếu 39
Hình 3.15
: Sắc ký đồ của diosgenin đối chiếu 40
Hình 3.16
: Sắc ký đồ của chất D2 40
Hình 3.17
: Phổ UV diosgenin đối chiếu 41
Hình 3.18
: Phổ UV của chất D2

41

các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế được rất
nhiều các nhà khoa học quan tâm.
Diosgenin là một trong những chất như vậy. Khoảng 50 – 60% dẫn chất
steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin. Tuy chất này có
mặt trong nhiều họ thực vật, song “chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea L.) thì
mới có giá trị thực tế” trong việc khai thác chiết xuất diosgenin [4]. Hằng năm, ước
tính ngành Dược cần 10.000 tấn thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [24], [12].
Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày càng lớn,
trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp ngày càng giảm do sự khai thác quá mức
[18], [24], [26]. Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu khác cung
cấp diosgenin.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành
phần hóa học của cây Nần trắng – Dioscorea chingii Prain & Burkill, họ Củ nâu
– Dioscoreaceae” với mục tiêu:
- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Nần trắng.
- Góp phần khảo sát nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin.
Để phục vụ mục tiêu trên đề tài bao gồm các nội dung nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học của mẫu Nần trắng.
- Định tính sơ bộ các nhóm chất trong mẫu Nần trắng.
- Chiết xuất, phân lập và định lượng diosgenin trong mẫu Nần trắng.
2
Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Chi Dioscorea L.
1.1.1. Vị trí của chi Dioscorea L. trong hệ thống phân loại thực vật của
Takhtajan 1987[2]
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp Hành (Liliidae)
Bộ Củ nâu (Dioscoreales)

ngắn. Hoa cái giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không
phong phú như hoa đực. Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo
thành 3 cặp. Quả nang chẻ ô có 3 cánh. Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của
cánh với trục quả. Hạt 6, có cánh ở tất cả các loài.
1.1.3. Phân bố
Chi Dioscorea L. có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới
châu Á, Australia, châu Mỹ. Ở Việt Nam có hơn 40 loài [16], [8], [28]. Ở châu Á có
khoảng 140 loài [30].
1.1.4. Ứng dụng của chi Dioscorea L.
1.1.4.1. Ứng dụng trong đời sống
 Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài Dioscorea được sử
dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp hạt như: khoai
mỡ (D. alata), củ từ (D. esculenta), khoai rạng (D. glabra), củ mài (D. persimilis)…
[2], [16] [8].
 Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: Củ nâu (D.
cirrhosa), từ ngược mùa (D. intempestiva) …[15],[8].
 Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm mũi tên
như: củ mài gừng (D. zingiberensis), từ poilane (D. poilanei), từ tam giác (D.
deltoidea), củ nần (D. hispida)… [15],[8]
1.1.4.2. Ứng dụng trong y học
4
 Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ. Ngoài ra, nhiều loài
trong chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc. Dưới đây là một số tác dụng của các
loài Dioscorea:
 Bổ dưỡng, nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D. alata, D. esculenta, D.
glabra, D. persimilis… [2],[16] .
 Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D. bulbifera, D. cirrhosa, D. esculenta… [16], [2],
[8].
 Mạnh gân xương, trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối: D. hispida, D.
pentaphylla, D. collettii… [16], [2], [8].

là các công ty đã khai thác một lượng lớn thân rễ loài này từ các khu rừng, bất chấp
những quy định nghiêm ngặt về khai thác, những vùng ở Kashmir và Himachal
Prades bị khai thác cạn kiệt hoàn toàn. Nghiêm trọng hơn là ở những nơi D.
deltoidea còn sót lại, thành phần diosgenin giảm mạnh so với trước [18]. Ngày nay,
đa phần thuốc tránh thai đường uống ở phương Tây được tổng hợp toàn phần, song
ở Ấn Độ và Trung Quốc thuốc tránh thai đường uống và một số thuốc có khung
steroid khác lại được bán tổng hợp từ diosgenin, một chất được chiết xuất từ các
loài Dioscorea.
D. nipponica và D. zingigerensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở Trung
Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [18].
Bảng 1.1. là bảng tóm tắt các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản
xuất diosgenin trong công nghiệp trên thế giới [26]. 6
Bảng 1.1. Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất diosgenin trong
công nghiệp trên thế giới.
Tại Việt Nam, vào những năm 1980 Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích, Nguyễn
Bá Hoạt và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ bản nguồn nguyên liệu cung cấp
diosgenin ở Việt Nam trong 4 họ: Dioscoreaceae (chi Dioscorea), Costaceae (chi
Costus), Zygophyllaceae (chi Tribulus), Taccaceae (chi Tacca). Qua đó phát hiện 4

diosgenin từ dược liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D. floribunda trên quy mô
phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp. Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp
16-DPA và các dẫn xuất steroid [15], [13].
1.2.2. Ứng dụng của diosgenin
- Diosgenin được chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức cholesterol
máu và là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản phẩm nội tiết như:
dehydroepiandrosteron, progesteron. Diosgenin có tác dụng ngăn ngừa sự mất
xương ở mức độ tương tự estrogen. Do vậy diosgenin được sử dụng để điều trị cho
bệnh nhân sau mãn kinh để làm giảm sự tiến triển loãng xương [29].
- Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài thời
gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PT).
Do đó, nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim mạch như bệnh mạch vành
và cơn đau thắt ngực [21].
- Trong các tế bào ung thư vú HER2-overexpressing, người ta thấy có sự tăng
lên rõ rệt của Fatty acid synthetase (FAS). Diosgenin có khả năng năng ngăn chặn
sự xuất hiện của FAS trong các tế bào ung thư vú. Diosgenin ưu tiên ức chế sự tăng
sinh và gây độc tế bào ung thư HER2-overexpressing. Hơn nữa diosgenin ức chế
phản ứng phosphoryl hóa Akt, mTOR và JNK. Diosgenin có khả năng ức chế sự tồn
tại, sự phát triển và gia tăng của các tế bào ung thư vú [19], [22].
- Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng hợp ra
16-dehydro pregnenolon acetat (16 – DPA), là chất trung gian để tổng hợp các dẫn
xuất steroid. Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được
8
sản xuất từ diosgenin. Hàng năm, ước tính ngành dược cần 10.000 tấn thân rễ
Dioscorea để sản xuất diosgenin [24], [26].

Sơ đồ thoái biến diosgenin thành 16-dehydro pregnenolon acetat [12]. Trong số hàng trăm sapogenin steroid được biết cho đến nay, thực tế cũng chỉ

dung môi với chất nội chuẩn cholesterol rồi phân tích bằng máy sắc ký khí [7].
* Phương pháp HPLC
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi,
hòa tan trong methanol rồi phân tích bằng máy HPLC [27].
* Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi,
hòa tan cắn trong chloroform. Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy diosgenin chuẩn.
Sau đó đo mật độ vết sắc ký bằng Densitometer [12], [23].
Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và gặp
sai số lớn trong quá trình tách chiết mẫu. Phương pháp đo quang phụ thuộc vào độ
bền màu của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử. Phương pháp sắc ký khí có quá trình
chuẩn bị mẫu phức tạp. Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến hiện nay.
Phương pháp HPTLC kết hợp với máy Densitometer dễ thực hiện và kết quả khá
chính xác.
1.3 Nần trắng.
1.3.1 Đặc điểm thực vật cây Nần trắng (Dioscorea chingii Prain & Burk.).
Thực vật chí Việt Nam mô tả [8]:
Dây leo nhiều năm, dài 5 – 10m, quấn trái. Thân rễ nằm ngang, thô, to, vỏ
ngoài màu nâu đen, ruột màu trắng hoặc màu vàng trắng, thân trên mặt đất màu lục
có khi có màu đỏ tím. Lá đơn, mọc cách, phiến lá hình trứng, hình mũi giáo dạng
tam giác, kích thước 7,5 - 20 x 4,5 – 10cm, chất giấy, mép nguyên, 2 mặt không có
lông, 7 gân, chóp nhọn dần hoặc nhọn dài, gốc hình tim. Hoa đều, đơn tính, khác
gốc, mẫu 3. Cụm hoa bông đực dài 10cm, mọc ở nách lá, nhiều hoa, 2 - 6 chiếc tập
trung ở nách lá bắc. Cụm hoa bông cái gồm 1 - 3 cụm hoa, dài 6 – 10cm. Hoa đực,
10
bao hoa 6 mảnh, hình chuông, dài 0,2cm dính nhau ở gốc, trên có 6 thùy, rời nhau,
xếp 2 vòng, 3 thùy vòng ngoài hình trứng rộng, dài 0,15cm, 3 thùy vòng trong hình
thuôn. Nhị 6, tất cả hữu thụ; chỉ nhị rời nhau, đính ở gốc bao hoa hoặc trên đế hoa,
uốn cong ra ngoài; bao phấn hướng trong đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc. Hoa cái:
bao hoa 6 mảnh, hình trứng hoặc hình trứng rộng. Bầu hạ, 3 ô, mỗi ô 2 - nhiều

dài dưới 2mm; Nhụy hoa dài 6mm, nằm trên đài hoa, sợi hoa dài 1,25mm, mọc
vươn hướng ra ngoài. Quả có 3 cánh, mỗi cánh dài 1,5 - 2cm, rộng 1 – 1,5cm. Hạt
nằm trong trung tâm quả, bên ngoài có 1 lớp cánh mỏng bao bọc 4 phía.
1.3.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố cây Nần trắng.
Dioscorea chingii ra hoa vào tháng 4 – 7, có mùa quả tháng 8 – 10, mọc trong
rừng lá rộng thường xanh hoặc rừng trên núi đá vôi [8].
Loài Dioscorea chingii phân bố ở bìa rừng, sườn núi, có độ cao từ 1200 –
1800m ở Quảng Tây, Vân Nam (Trung Quốc) [2],[17], hoặc mọc trên đồi dốc với
độ cao dưới 600m cách mực nước biển, dưới bóng râm của các bụi cây tại tỉnh
Quảng Tây (Trung Quốc).
Ngoài ra, Dioscorea chingii còn phân bố ở ít nơi trên độ cao 600m trong rừng
bắc Việt Nam [2], như Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai Châu, Hang Kia), Ninh
Bình ( Cúc Phương)[8].
1.3.3. Ứng dụng của cây Nần trắng.
Dioscorea chingii có tác dụng tiêu thũng chỉ thống, thân rễ của cây được dùng
để trị đòn ngã tổn thương ở Trung Quốc [2], dân gian Trung Quốc còn thường hay
dùng rễ và thân cây giã nát, uống hoặc bôi ngoài vết thương do bị ngã [17].
Ngoài ra, Dioscorea chingii còn được dùng để chữa vết thương phần mềm
(thân rễ giã nát đắp ngoài hoặc nước sắc để rửa)[8].
Cho đến nay, chưa thấy tài liệu nào nghiên cứu về thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của cây Nần trắng.
12
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Thân rễ Nần trắng thu hái ở Mộc Châu, Sơn La vào tháng 8 năm 2012.

2.2. Nội dung nghiên cứu
* Nghiên cứu đặc điểm thực vật
 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu theo khóa phân loại theo đơn
vị thứ để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
 Mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu:
+ Vi phẫu: thân, thân rễ, lá.
+ Bột Dược liệu: thân, thân rễ, lá.
* Nghiên cứu thành phần hóa học
 Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu Nần trắng.
 Chiết xuất, phân lập, định lượng Diosgenin trong mẫu Nần trắng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp vi học
 Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo
phương pháp mô tả phân tích [1]
 Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô
 Xác định tên khoa học của cây bằng phương pháp đối chiếu các đặc điểm
hình thái của mẫu thu được với các tài liệu thực vật chí Trung Quốc [14], Từ điển
cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi) [2], Thực vật chí Đông Dương [30], Thực vật chí
Việt Nam [4], Trung Quốc cao đẳng thực vật đồ giám [17].
 Đặc điểm vi phẫu: vi phẫu được cắt bằng dụng cụ cắt cầm tay, tẩy và
nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm
vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi [1].
 Đặc điểm bột: lá, thân, thân rễ được sấy khô ở 60ºC, nghiền nhỏ thành bột
bằng cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc
điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi [10].
* Phương pháp hóa học
14
 Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành các phản ứng định tính đặc trưng
cho từng nhóm chất [1].
 Chiết xuất diosgenin tham khảo phương pháp chiết xuất diosgenin từ D.