TRƯỜ
NG Đ
NGUY
NGHIÊN CỨ
U Đ
THÀNH PHẦ
N HÓA H
HOÀNG LIÊN
FOLIOLOSUM
KHÓA LUBỘ Y TẾ
NG Đ
ẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUY
ỄN THỊ LƯƠNG
U Đ
ẶC ĐIỂM THỰ
C V
N HÓA H
ỌC CỦ
A CÂY TH
HOÀNG LIÊN

NGUYỄN THỊ LƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY THỔ
HOÀNG LIÊN -THALICTRUM
FOLIOLOSUM DC. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
N
gười hướng dẫn:
TS.Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành
tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và


Br
Berberin
Dd
Dung dịch
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HPTLC
High Performance Thin Layer Chromatigraphy
IR
Infrared Radiation
MS
Mass spectrometry
NMR
Nuclear magnetic resonance
P. t. l
Phân tử lượng
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
STT
Số thứ tự
TLC
Thin Layer Chromatography
TN
Thí nghiệm
TT
Thuốc Thử
UV
Ultraviolet


31
5
Bảng 3.4.
Nồng độ Berberin chuẩn và diện tích pic đáp ứng
33
6
Bảng 3.5.
Giá trị R
f
và diện tích pic của các vết 34
7
Bảng 3.6.
Kết quả bán định lượng Berberin bằng HPTLC 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Hình Tên hình Trang
1

12
Hình 3.10.
Kết quả chồng pic của mẫu trắng (1), mẫu thử
(2), mẫu chuẩn (3).
32
13
Hình 3.11. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33
14
Hình 4.1.
Hình ảnh Thalictrum foliolosum DC. (A; C; E)
và Thalictrum ichangensis Lecoyer ex Oliv. (B;
D; C)
36
MỤC LỤC
TÊN MỤC Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2

1.1. VỀ THỰC VẬT 2


1.6.6. Định lượng Berberin 8

1.7. ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU 9

1.7.1. Định tính 9
1.7.2. Định lượng 10

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 12

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.2. Hóa chất 12

2.1.3. Máy móc và dụng cụ nghiên cứu 12

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.2.1. Nội dung nghiên cứu 13

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 13

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21

3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 21


4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 37
4.2.1. Về định tính các nhóm chất chính 37

4.2.2. Về định tính alcaloid 37

4.3. VỀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BĂNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC . 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay,Berberin được biết đến là một alcaloid có nhiều tác dụng chữa bệnh
như: Bệnh đường tiêu hóa (tiêu chảy, viêm dạ dày ruột),tiểu đường, bệnh tim mạch
(tăng lipid máu, hạ huyết áp), các tình trạng viêm, điều trị ung thư
,[24],[25],[29],[31], [36].Các tác dụng này đã được nghiên cứu, chứng minh và được
ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng.
Berberin được tìm thấy trong 150 loài thuộc 23 chi và 7 họ thực vật khác nhau.
Ở Việt Nam, các họ thường chứa berberin làhọ Hoàng liên (Ranunculaceae), họ
Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Ruta-
ceae)[17], họ Thuốc phiện (Papaveracae)[8]. Với nhiều tác dụng của Berberin, các
nguồn dược liệu chứa Berberin đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học

Bộ Hoàng liên (Ranuculales)
Họ Hoàng liên (Ranuculaceae)
Chi Thailictrum L.[5],[37].
Thalictrum L. là một chi lớn, gồm khoảng 200 loài, phân bố ở vùng ôn đới Bắc
bán cầu, một số phân bố ở Nam Mỹ, Nam Phi hoặc vùng nhiệt đới núi cao châu Á. Ở
Trung Quốc có 70 loài, Đài Loan 6 loài, Ấn Độ gần 50 loài. Riêng Việt Nam, theo các
tài liệu ghi nhận có 2 loài, đó là T. foliosum DC. và T. ichangense Lecoy ex
Oliv.[9],[14],[22],[37].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Thalictrum L.
Cây cỏ sống nhiều năm. Thân rễ hoá gỗ có thịt màu vàng hoặc rễ củ. Lá mọc ở
gốc hoặc trên cành, lá có cuống hoặc không cuống, lá mọc ở thân thường so le,lá kép
hình lông chim, ít khi lá đơn, lá chét hình tim, hình trứng hoặc hình mác, mép nguyên
hoặc khía răng. Cụm hoa ở đầu cành hay nách lá, cụm hoa xim hoặc chùm, nhiều hoa
nhỏ,lá bắc 2, 3 hoặc 6 – 9. Hoa thường lưỡng tính. Đài 4 – 10, màu xanh vàng hoặc
tím, hình mác hoặc hình thìa, không tồn tại cùng quả; không có tràng; bộ nhị nhiều; bộ
nhuỵ gồm 4 – 6 hoặc nhiều lá noãn, 1 noãn. Quả đóng [5], [37].
3
1.1.2. Loài Thalictrum foliolosum DC.
1.1.2.1. Khóa phân loại xác định loài Thalictrum foliolosum DC. theo Thực vật chí
Trung Quốc
Thực vật chí Trung Quốc đã xác định Thalictrumfoliosum DC. dựa trên khoá
như sau [37]:
1.b Lá kép lông chim hoặc chụm 3 (gân)
2.b Hoa luôn luôn lưỡng tính, không bao giờ đơn tính,núm nhụy không bao
giờ hình roi, hiếm khi dài hơn bầu nhụy
3.b Lá chét hình trứng, dạng trứng ngược, hoặc hình cầu, thường có dạng thùy
4.b Lá chét không hình khiên, cuống nhỏ đính vào gốc

non, rễ chùm nhiều, cứng [1],[6],[15].
Lá 3 lần kép, cuống chung dài 15cm, lá chét bậc ba dài 1– 2,5cm, rộng 0,5 –
1,5cm, không lông, mép trên có răng to[10].Lá kép 3 lần lông chim, dài 28 cm, cuống
chung dài 10 – 20cm, có bẹ. Lá chét mỏng, gần hình tròn hoặc hình trứng, mép khía
tai bèo, kích thước 1 – 1,5 x 0,5 – 1,2 cm[1],[4].
Cụm hoa là chuỳ rộng, phân nhánh nhiều, nụ to 6 – 7mm; lá đài màu trắng và
thường là vàng nhạt hoặc có sọc tía, hình bầu dục, dài 3 – 4,5mm; nhị nhiều, dài 6 –
7mm. Lá noãn 4 – 6[1],[4].
Quả đóng nhỏ, hình thoi, hơi dẹp, dài 3mm, có mỏ, thuôn, nhọn 2 đầu có các
đường vân dọc theo sườn rõ[4],[10].
1.1.2.3. Phân bố
Trên thế giới, Thalictrumfoliosum DC. xuất hiện ở Afghanistan [1], Ấn Độ,
Nêpan, Trung Quốc[1],[4]. Ở Trung quốc, loài này gặp ở các khu vực Tứ Xuyên, Tây
Tạng và Vân Nam với độ cao 1500 – 3200 m[4].
Trong nước, loài Thalictrumfoliosum DC. được phân bố ở Lai Châu (Phong
Thổ, Sìn Hồ), Điện Biên (Tủa Chùa), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Đồng Văn), Vĩnh
Phúc, Sơn la[4],[15],[22].
1.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Các nghiên cứu đều cho thấy thành phần chính trong thân rễThổ hoàng liên
làBerberin, palmatin, atrorrhizin và thalictrin[1],[4],[10],[15].
Dược điển Việt Nam có quy định dược liệu Thổ hoàng liên (Thalictrum
foliolosum DC.) phải chứa ít nhất 1% berberin (tính theo dược liệu khô kiệt)[6].
5
Theo S.K Chattopadhyay và cộng sự, từ Thalictrum foliolosum DC. đã phân lập
được mười một alcaloid bao gồm là protoberberin thalifendin, palmatin, berberin, co-
lumbamin, jatrorrhizin, thalidastin, dehydrodiscretamin, benzylisoquinolines rugosion,
tem–betarine, aporphin xanthoplanin và magnoflorin[34].

nghiệm[35].
1.4.2. Tác dụng hạ nhiệt
Dịch nước của thân rễ Thalictrum foliolosumđược thử tác dụng hạ nhiệt ở
chuột bạch đã được gây sốt với liều lượng 300, 400, và 500 mg / Kg và được so sánh
với thuốc Paracetamol chuẩn(150mg / kg ). Kết quả các dịch chiết nước của thân rễ
cho thấy khả năng hạ nhiệt đáng kể sau 2 giờ với liều 300 & 400 mg / Kg cơ thể trong
khi liều lượng 500mg / kg đã có hiệu quả trong vòng một giờ so với
Paracetamol[15],[26].
1.4.3. Độc tính cấp
Theo Đỗ Tất Lợi,cao khô chiết bằng ethanol 50% của rễ Thổ hoàng liên thử
trên chuột nhắt trắng tiêm màng bụng có LD 50 =125mg/kg[16].
1.5. CÔNG DỤNG
Rễ Thổ hoàng liên có vị rất đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc,
khu phong[10],[16].
Thổ hoàng liên thường dùng để chữa lỵ, giải nhiệt, đổ máu cam, mất ngủ(Viện
dược liệu). Dùng ngoài để chữa đau mắtvà mụn nhọt [10], trị đau mắt nhặm, viêm ruột
, tiêu chảy, viêm gan, vàng da, tim nhiệt, phổi nhiệt sốt cao [15].
Ở Trung Quốc Thổ hoàng liên được dùng để trị sởi đậu khó mọc[10].
Ở Ấn Độ rễ dùng chữa chứng khó tiêu do mất trương lực cơ và giúp khôi phục
sau những cơn đau cấp tính và dùng đắp trị đau mắt[10].
1.6. VÀI NÉT VỀ BERBERIN
1.6.1. Công thức hoá học và nguồn gốc của berberin
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin (5,6 dihydro-8,9-
dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno (5,6-a) anthracen)
Công thức phân tử C
20
H
18
NO
4

ụ
khuẩn), thể protozoal
, vi n
sinh trùng số
t rét, kí sinh trùng đư
Berberin
có tác d
hưởng tới sự phát triển
bình th
Berberin cótác d
ụng chống ung th
đường, chống viêm, ch
ống oxy
7

ợc phát hiện trong 150 lo
ài thu
ộc nhiều họ thực vật kh
.Trong đó
Việt Nam các họ
Hoàng Liên (Ranunculaceae), h
Berberidaceae
), họ Tiết D
ê (Menispermaceae), h
(Papaveracae)
chứa berberin[8], [17].
ờng có lẫn tạp chất alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin

ác nhau
Hoàng Liên (Ranunculaceae), h
ọ
ê (Menispermaceae), h
ọ Cam (Rutaceae),
caloid khác như: palmatin, jatrorrhizin
[7].
Độ tan
1 : 20
1 : 30
1 : 100

shigella
, tụ cầu và liên cầu
m men, ký sinh trùng gây b
ệnh (ký
t khi dùng
không ảnh
30
],[23].
ạ glucose máu, chống trầm cảm
, đái tháo
8
1.6.3. Chỉ định của berberin
Berberin thường được dùng trong các bệnh hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy,
viêm ống mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt rét, mụn nhọt.Ngoài ra, berberin
còn được dùng để điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (do nắng,

khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các
yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được
kiểm soát và hạn chế tới tối đa các thay đổi.
Với những ưu điểm trên HPTLC ngày càng đươc ứng dụng nhiều trong định
tính, định lượng.
1.7. ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU
1.7.1. Định tính
Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm
mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác
nhau. Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng R
f
= 0,30 – 0,75 thì có
thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết. Việc khẳng định sự tinh khiết
của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phổ học khác (UV, IR, NMR, MS)
[2].
So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai
triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau. Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3 vết: vết I
(mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn). Nếu trên cả 3 sắc ký đồ
mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số R
f
, về hình dạng vết, về màu sắc vết
trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu chuẩn là đồng
nhất [2].
Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch chiết
của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn
(thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng). Sau đó so sánh các vết
cùng trên 1 bản mỏng về số vết, R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ
lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu chuẩn [2].

trường [11]. Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm chăm
sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất trong dược
liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển. Năm 2010,
nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ. Kết quả hàm
lượng berberin là khoảng 4.0%. Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của phương
pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7%[27]. Cũng ứng dụng quy trình trên, năm 2012,
Nguyễn Thị Thu Hằng cũng đã định lượng berberin trong thân và rễ của 1 số cây loài
11
Berberis. bằng phương pháp HPTLC. Kết quả hàm lượng berberin trong mẫu rễ là
3.98% và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [13].

12
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Thân rễ Thổ hoàng liên thu hái tại xã Co Mạ, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La
vào thời gian 11/04/2012.
Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu được làm tiêu bản cây khô và lưu tại
phòng tiêu bản, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã số tiêu bản là: HNIP/18125/15.
Mẫu nghiên cứu về hoá học được phơi khô, sấy ở 55
o
C – 60
o
C cho tới khi đạt

2.2.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu

Làm vi phẫu rễ, quan sát, mô tả đặc điểm qua kính hiển vi màn hình.

Làm tiêu bản giọt ép soi bột và xác định đặc điểm bột dược liệu qua kính hiển
vi kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T.
2.2.1.2. Định tính thành phần hóa học

Định tính các nhóm hợp chất chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học.

Định tính berberin và palmatin bằng sắc ký lớp mỏng

Chiết xuất alcaloid toàn phần.

Tiến hành sắc ký lớp mỏng.

Phát hiện vết bằng thiết bị UV-Visualizer và sử lý kết quả bằng phần mềm win-
cat.
2.2.1.3.Bán định lượng Berberin trong cây Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum
bằng phương pháp HPTLC

Chiết xuất alcaloid toàn phần trong dược liệu.

Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ chuẩn.

Khảo sát lựa chọn nồng độ pha loãng dịch chiết.

Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC.

4
5%, dd H
2
SO
4
1N, dd NH
3
6N (20ml).
 Thuốc thử: anhydrit acetic, H
2
SO
4
đặc, bouchardat, dragendoff, mayer, Dd natri
acetat, dd FeCl
3
5%, formol, HCl đặc, gelatin, chì acetat 10%, Dd NaOH 10%,
dd NH
3
đặc, Dd H
2
SO
4
đặc, TT Diazo, TT xanhydrol, acid acetic, bột Mg, octa-
nol, acid picric, chì acetat 30%.
 Dụng cụ: máy xay, bình nón 100ml, 50ml; bình gạn 50ml, 100ml; ống nghiệm
lớn, ống nghiệm nhỏ, pipet, giấy lọc, phễu lọc, kính hiển vi, đèn tử ngoại


acid hydrochlorid (100:1). Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết. Thêm 50
ml hỗn hợp dung môi methanol : acid hydrochlorid (100:1) chiết tiếp 2 lần tương tự.
Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn. hòa tan trong nước nóng 5 lần, mỗi
lần 15 ml, lọc lấy dịch chiết. Cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn trong methanol, chuyển
vào bình định mức 100 ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc
0,45µm[13],[19],[20].
 Tiến hành sắc ký lớp mỏng
 Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng TLC silica gel 60 GF
254
(Merck) hoạt hóa ở
110˚C trong 60 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.
 Chuẩn bị pha động:
Pha động là 1 số hỗn hợp dung môi sau:
- Hệ I: N-butanol: acid acetic: nước (7,0 : 1,0 : 2,0) [19]
- Hệ II: Chloroform: methanol (9,0 : 1,0 ) [19]
- Hệ III: Propanol: nước: acid fomic (90,0 : 8,0 : 0,4) [19], [27]
- Hệ IV: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic: nước (1,5 : 5,5 : 1,0 : 2,0)[19]
- Hệ V: Ethylacetat: n-butanol: acid acetic : nước (1,0 : 7,0: 1,0 : 2,0) [13]
- Hệ VI: Toluen: ethyacetat: methanol: n-propanol: amoniac (12,0: 6,0 : 3,0 :
3,0 :1,0)
- Hệ VII: Chloroform: butanol (1,0 : 7,0)
- Hệ VIII: Methanol: nước: amoniac (8,0 : 1,0 :1,0) [32]
- Hệ IX: Chloroform: methanol: amoniac (14,0 : 5,0 : 1,0 ) [32]
 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: dung dịch Berberin chuẩn 0.08 % và Palmatin
chuẩn dùng để định tính alcaloid trong các mẫu nghiên cứu.
Hòa tan chính xác 0,0200 g berberin chlorid chuẩn (83,7 %), palmatin chlorid
chuẩn (96,24%) trong methanol, chuyển vào bình định mức 25ml, thêm methanol vừa
đủ tới vạch, lắc đều, lọc. Thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,08%.
 Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: là dung dịch alcaloid toàn phần pha loãng 100 lần.