BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
DÂU DÂY (AMPELOPSIS HETEROPHYLLA
SIEB. ET. ZUCC. VAR. HANCEI PLANCH.,
VITACEAE) THU HÁI Ở TAM ĐẢO,
VĨNH PHÚC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2013
Đầu tiên, tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn TS. NGUYỄN THỊ BÍCH
THU đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt
nghiệp.
Luận văn này là kết quả của quá trình học tập trong gần 16 tháng liên tục.
Do đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy, cô trường Đại học
Dược Hà Nội, những người đã tham gia vào quá trình giảng dạy và trang bị cho
tôi những kiến thức để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn của mình tới TS. PHƯƠNG THIỆN
THƯƠNG, TS. ĐỖ THỊ HÀ cùng các anh chị, các em trong Viện Dược liệu đã
tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm luận
văn.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới người thân, bạn
bè, đặc biệt là gia đình của tôi đã luôn động viên, giúp đỡ tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013
Học viên Nguyễn Thị Ngọc Lan
MỤC LỤC
3.2.1. Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong phần trên mặt đất (lá và
thân) cây Dâu dây (xem Bảng 3.1) 27
3.2.2. Định lượng và định tính cắn ở các phân đoạn. 29
3.3. Phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học. 34
3.3.1. Chiết xuất: 34
3.3.2. Phân lập: 34
3.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất 38
3.3.4. Sắc ký đồ của dịch chiết phân đoạn với AG-1, AG-2 và AG-3 43
3.3.5. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được. 45
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 54
4.1. Về phương pháp. 54
4.2. Về thực vật 54
4.3. Về thành phần hóa học 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
SKC: Sắc ký cột
SKĐ: Sắc ký đồ
TLC: Thin Layer Chromatography
UV: Ultra Violet
VAST : Vietnam Academy of Science and Technology.
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên b
ảng
Trang
1
B
ảng 3.1. Kết quả
đ
ịnh tính các nhóm
ch
ất chính
trong phần trên mặt đất (lá và thân) cây Dâu dây
1
3
C
-
NMR (125 MHz) của chất AG-1
47
6
Bảng 3.6: Số liệu phổ
1
H-NMR (500 MHz) và
13
C-
NMR (125 MHz) của chất AG-2
49-50
7
B
ảng 3.7: Số
li
ệu phổ
1
H
-
NMR (500 MHz) và
1
3
C
-
NMR (125 MHz) của chất AG-3
Hình 2. 2. S
ơ đ
ồ chiết phân
đo
ạn các nhóm chất
21
3
Hình 3.3
.
Ảnh hình thái cây Dâu dây
23
4
Hì
nh 3.4
.
Ảnh chụp vi phẫu lá cây Dâu dây
25
5
Hình 3.5. Ảnh chụp vi phẫu thân cây Dâu dây.
25
6
Hình 3.9
. S
ắc ký
đ
ồ phân
đo
ạn cắn ethylacetat
32
10
Hình 3.10
. S
ắc ký
đ
ồ phân
đo
ạn cắn n
-
butanol
33
11
Hình 3.11
. Sơ đ
ồ chiết xuất, p
hân l
Hình 3.17. Sắc ký đồ HPLC của chất AG-3
42
18
Hình 3.18. Sắc ký đồ SKLM của cắn EtOAc, AG-1,
AG-2
43
19
Hình 3.19
. SKLM d
ấu vân tay ở b
ư
ớc sóng 254 và
365 nm (trước khi phun thuốc thử)
44
20
Hình 3.20
. SKLM d
ấu vân tay ở ánh sáng th
ư
ờng
và UV 365 nm (sau khi phun thuốc thử)
44
21
Hình 3.21. Công thức cấu tạo của 4’-O-methyl
myricitrin
Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, thực vật phát
triển quanh năm, rất đa dạng và phong phú. Thực vật không những cung cấp
chất dinh dưỡng mà còn là nguồn thuốc chữa bệnh quí giá cho con người.
Hiện nay có rất nhiều các loại thuốc đang được lưu hành trên thế giới hoặc
đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên
nhiên. Do vậy, hướng nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
của các cây thuốc đang rất thu hút sự quan tâm của giới khoa học.
Cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla Sieb. et. Zucc. var. hancei
Planch.), còn gọi là cây nho dại, nho rừng, song nho dị diệp. Cây phân bố ở
các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới. Ở nước ta, cây phân bố tương đối rộng rãi
từ các tỉnh vùng đồng bằng đến trung du và vùng núi thấp. Cây thường leo lên
các lùm bụi ở ven rừng, đồi, bờ nương rẫy và đôi khi thấy ở cả quanh làng
bản. Theo Y học cổ truyền, cây có vị ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng thanh
nhiệt, tiêu sưng, chữa phong thấp. Trong dân gian, cây được dùng phối hợp
với các vị thuốc khác nhau để chữa sốt rét, chữa đau quanh vai, lưng gối đau
nhức, chân sưng phù, chữa vết thương bầm tím sưng đau [2].
Cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào công bố sâu về thành
phần hóa học, tác dụng sinh học của cây Dâu dây (Ampelopsis heterophylla
Sieb.et.Zucc.var. hancei Planch.), mọc ở Việt Nam.
Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng dược liệu có
hiệu quả hơn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên cứu đặc điểm
thực vật và thành phần hóa học của cây Dâu dây (Ampelopsis
heterophylla Sieb. et. Zucc. var. hancei Planch., Vitaceae) thu hái ở Tam
Đảo, Vĩnh Phúc” với mục tiêu:
Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Dâu dây
2
Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
1. Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá, thân, đặc điểm bột lá,
Bộ: Vitales
Họ: Vitaceae
Chi: Ampelopsis 1],3.
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Chi Ampelopsis có khoảng 30 loài là những loài đặc hữu của khu vực
châu Á và Trung, Bắc Mỹ [42]. Ở Ấn Độ và Trung Quốc có 5-6 loài được mô
tả. Ở Việt Nam, có tác giả ước tính tới 5 loài (Nguyễn Tiến Bân, 1997) [1].
Hầu hết các loài thuộc chi này phát triển ở các vùng núi có khí hậu ôn
đới. Tất cả các loài thuộc chi Ampelopsis là dạng dây leo thân gỗ có tua cuốn.
4
Ở một số loài, tua cuốn có thể ôm lấy hoa. Lá thường, chân vịt hoặc lá kép
chân vịt. Cụm hoa dạng xim, tràng hoa có 5 cánh tù. Quả mọng có 1 đến 4 hạt
hình trứng ngược [2].
1.2.3. Thành phần hóa học
Theo Xu. Zihong và cộng sự, lá chè dây (Ampelopsis cantoniensis
Planch) chứa flavon (4,73%), protein (9,25%) và giàu K
+
, Ca
2+
, Fe, Zn cùng
các vitamin E, B
1
, B
2.
Phạm Thanh Kỳ và cộng sự phát hiện lá chè dây tại Cao
Bằng có chứa flavonoid (18-19%), tanin (10,82-13,30%), đường và đã phân
lập và định lượng được 2 flavonoid tinh khiết từ lá chè dây bao gồm (+)
myricetin (1) và dihydro myricetin (2) [13].
thương gan, thông số đánh giá là: mức độ bị hoại tử của trung tâm tiểu thùy,
mức độ viêm sưng và xơ hóa của tế bào gan chuột đã được tiêm carbon
tetrachlorid [39].
Dịch chiết phân đoạn từ quả loài A. brevipedunculata (Maxim.) Trautv.
có khả năng gây ức chế sự hình thành các sợi collagen trong tế bào M của gan
chuột. Đồng thời dịch chiết này không làm giảm sự tổng hợp protein không
chứa collagen và không ảnh hưởng đến sự hình thành các tế bào không chứa
collagen [38].
6
1.3. Những nghiên cứu về cây Dâu dây Ampelopsis heterophylla Sieb. et.
Zucc. var. hancei Planch.
1.3.1. Đặc điểm thực vật: Hình 1.1. Ảnh cây Dâu dây (Nguồn internet, www.plant.ac.cn)Cây Dâu dây (hay cây nho rừng, nho dại) là dạng cây leo, thân cành hình
trụ, đôi khi có cạnh, khi non có lông rải rác rất nhỏ. Tua cuốn phân nhánh, đối
diện với lá. Lá mọc so le, hình tim, hơi chia thùy, dài và rộng gần bằng nhau, gốc
hình tim, đầu nhọn dài, mép khía răng thô, 5 gân chính tỏa từ gốc thành hình chân
vịt, hai mặt có lông mịn. Cụm hoa mọc thành ngù, đối diện với lá, ngắn hơn lá;
hoa màu vàng nhạt; đài hình chén, có lông, 5 răng nhỏ; tràng có 5 cánh tù, 5 nhị,
chỉ nhị rất mảnh, bao phấn gần tròn, bầu 2 ô. Quả mọng, màu xanh lơ hay tím
nhạt, có 3-4 hạt nhỏ. Mùa hoa quả: tháng 7-12. [1], [2], [10], [12].
W.T. Wang [23].
Oshima và cộng sự cũng đã phân lập và xác định cấu trúc của các
oligostilben là ampelopsin A (3), ampelopsin B (4), ampelopsin C (5),
ampelopsin D (6), ampelopsin E, cis-ampelopsin E, ampelopsin F (7),
8
ampelopsin G (8) và ampelopsin H. Đây là các hợp chất chính có trong loài
A.brevipedunculata var. hancei [31], [32], [33].
(3)
(4)
(5)(6) (7) (8)
9
1.3.5. Tác dụng dược lý:
Dịch chiết cao cồn và dịch chiết nước thân, cành, lá và rễ của loài A.
brevipedunculata var. hancei có tác dụng ức chế quá trình tổng hợp collagen
của tế bào gan và làm giảm lượng mỡ trong gan [31].
Dịch chiết methanol của A. brevipedunculata var. hancei cũng có tác
- Cành tươi mang hoa, lá để làm tiêu bản vi học.
- Cành, lá phơi khô, thái nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô
ráo, thoáng mát làm mẫu nghiên cứu thành phần hóa học.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất :
- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam III, IV.
- Dung môi phân tích, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích.
- SKLM: Dùng bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F
254
, RP
18
F
254s
(Merck).
- Sắc ký cột: Chất nhồi cột là Silica gel GF
254
, cỡ hạt 60-200 µm
(Merck), Silica gel Merck LiChroprep® RP-18, Sephadex LH-20.
- Các thuốc thử: Dragendorff, Mayer, Baljet, Diazo…
2.2.2. Phương tiện và máy móc
- Kính hiển vi: Zeiss Axioskop 40.
- Kính soi nổi: Krussoptroni.
- Cân kỹ thuật Precisa.
- Tủ sấy Memmert.
- Máy xác định độ ẩm Satorius.
- Máy cắt vi phẫu cầm tay
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon.
11
2.3.2. Về hóa học
2.3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa
học.
12
Phần trên mặt đất (lá và thân cây) được đem sấy khô trong tủ sấy ở
nhiệt độ 60
0
C. Đem ra tán nhỏ lá và thân bằng thuyền tán thành bột thô, bảo
quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo để làm các phản ứng
hóa học định tính đối
với bột dược liệu và làm sắc ký lớp mỏng theo tài
liệu [6], [7].
2.3.2.2. Chiết xuất
* Xác định độ ẩm của dược liệu [5], [16], [17]:
Lấy 2 g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh
nhiệt độ 110°C. Để dược liệu lên đĩa cân và trải đều trên mặt đĩa, đậy đĩa cân
và cho máy tự hoạt động, đợi khoảng 10 phút máy sẽ tự động hiện kết quả.
Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
*Định lượng các cắn [16], [17]:
Cân chính xác khoảng 100g dược liệu (phần trên mặt đất của cây Dâu
dây) đã xác định độ ẩm. Ngâm lạnh bằng MeOH trong bình chiết. Thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao MeOH toàn phần. Hòa tan cao
MeOH toàn phần vào một lượng nước vừa đủ, thu được dịch chiết nước. Đem
dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-
hexan, ethylacetat và n-butanol, với mỗi loại dung môi lắc kỹ đến khi nào
dung môi trong suốt thu được 4 phân đoạn dịch chiết. Các dịch chiết được cất
thu hồi dung môi ở 60
o
+ Ống 1: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Mayer
+ Ống 2: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Bouchardat.
+ Ống 3: 1ml dịch chiết + 2 giọt tt Dragendorff.
Định tính glycosid tim:
Cho 20g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn
25
o
, lắc đều, ngâm trong 24 giờ. Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất
nhựa) bằng chì acetat 30% để dư. Để lắng, lọc. Loại chì acetat thừa bằng dung
dịch Na
2
SO
4
bão hòa đến khi không còn tủa với Na
2
SO
4
nữa. Lọc lấy dịch lọc
vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp chloroform : ethanol (4:1), mỗi lần
20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông. Chia đều
dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến khô. Cắn
thu được để làm phản ứng định tính.
14
+ Phản ứng Liberman:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan
hết cắn. Nghiêng ống 45
o
. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H
2
+ Phản ứng Salkowski:
Cho vào bình nón 2g dược liệu, thêm 20ml ethanol 90%, đun sôi cách
thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm
45
o
, cho từ từ vào thành ống nghiệm 1-2 giọt acid H
2
SO
4
đặc.
15
Định tính anthranoid:
+ Phản ứng Borntraeger:
Lấy 3g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml
dung dịch H
2
SO
4
10%. Đun cách thủy sôi trong 15 phút. Lọc nóng vào bình
gạn. Để nguội rồi lắc với 5ml chloroform. Gạn lớp chloroform để làm phản
ứng.
Cho vào 2 ống nghiệm:
Ống 1: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NH
4
OH 10%.
Ống 2: 1ml dịch chiết chloroform + 1ml dung dịch NaOH 10%.
Lắc nhẹ.
+ Vi thăng hoa:
Đặt khoảng 3g bột dược liệu trong một đĩa nhôm. Hơ nhẹ trên bếp điện
Định tính coumarin:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml ethanol
90%. Đun cách thủy sôi trong 5 phút. Lọc nóng. Dịch lọc thu được để làm
phản ứng.
+ Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết.
Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2: Để yên.
Đun sôi cả 2 ống nghiệm, để nguội. Quan sát thấy:
Ống 1: Dung dịch có tủa vàng.
Ống 2: Trong
Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, thấy:
Ống 1: Dung dịch vẫn đục
Ống 2: Trong
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc.
+ Phản ứng Diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào đó 2ml dung dịch
NaOH 10%. Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử
Diazo mới pha.
+ Quan sát huỳnh quang:
Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho
khô. Nhỏ tiếp lên đó một giọt NaOH 5%, hơ cho khô. Bịt một nửa phần giấy
Copyright: Tài liệu đại học ©