ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VÕ THỊ NGỌC MỸ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI NẤM NỘI
SINH CÓ KHẢ NĂNG TẠO HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH
SINH HỌC TỪ CÂY THUỘC HỌ CAM (RUTACEAE) VÀ
HỌ GỪNG (ZINGIBERACEAE)

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01

TOÙM TAÉT LUAÄN AÙN TIEÁN SÓ SINH HỌC

Tp.HCM, năm 2016


Công trình được hoàn thành tại: Bộ Môn Vi Sinh – Kí Sinh Trùng, Khoa
Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp.HCM
Người hướng dẫn khoa học:
Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng
Phản biện 2: TS. Phạm Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện 3: TS. Đinh Minh Hiệp
Phản biện độc lập 1: TS. Phạm Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện độc lập 2: TS. Đinh Minh Hiệp

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
.................................................................................................................
.................................................................................................................

trong đó cam, chanh, quýt, bưởi...là những cây trồng phổ biến, có nhiều ứng
dụng trong dược phẩm, thực phẩm… Từ những đặc tính trên cho thấy, tiềm
năng đây là những họ chứa hệ vi nấm nội sinh phong phú, sinh nhiều chất
biến dưỡng và có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh...Tuy vậy, cho đến nay, ở
Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung vẫn chưa có nhiều nghiên cứu
về vi nấm nội sinh trên các loài cây thuộc hai họ thực vật này. Do đó, việc
nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo ra các chất
biến dưỡng có lợi và có khả năng sinh các hoạt chất sinh học với hy vọng
dùng để điều trị bệnh cho người là một công việc hết sức thú vị và được
nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Từ đó chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên
cứu phân lập các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo hợp chất có hoạt
tính sinh học từ cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)”
với mục tiêu chính là tìm ra được các chủng vi nấm nội sinh có khả năng
sinh các hoạt chất sinh học cao từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ
Gừng (Zingiberaceae).
2. Tính cấp thiết của đề tài: Hiện nay, thực vật và các hoạt chất chiết từ
thực vật đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiều loại bệnh. Theo
Balick và cộng sự năm 1996, trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại
có nguồn gốc từ thực vật, đây là các hợp chất đang được sử dụng ở nhiều
quốc gia. Trước thực tế này, một vấn đề được đặt ra là các hoạt chất sinh học
quí giá trong cây là do chính cây sinh ra hay là do mối liên hệ tương sinh với
các vi nấm nội sinh có ích trong mô thực vật. Trên thế giới có nhiều nghiên
cứu về các hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm được sinh từ vi nấm nội sinh,
và chúng chủ yếu thuộc về nhiều nhóm, bao gồm: alkaloid, peptid, steroid,
terpenoid, phenol, quinine và flavonoid… Điều này mang lại nhiều hứa hẹn
giải quyết được vấn đề kháng thuốc ở vi khuẩn vì các chất kháng sinh này là
các hợp chất mới và có hoạt tính cao.
1




CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi nấm nội sinh: Khái niệm vi sinh vật nội sinh, vi
nấm nội sinh, đặc điểm vi nấm nội sinh, trình bày quan hệ giữa vi nấm nội
sinh và thực vật, nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh,
sự đa dạng của vi nấm nội sinh, một số vi nấm nội sinh sinh hoạt chất sinh
học.
1.2. Tổng quan về Aspergillus: Trình bày vị trí phân loại, đặc điểm hình
thể, đặc điểm sinh thái và phân bố của Aspergillus. Phân loại và mô tả đặc
điểm hình thể, đặc điểm sinh thái và phân bố của A. terreus, các điều kiện
2


ảnh hưởng đến sự sinh hoạt chất sinh học và một số hoạt chất sinh học do A.
terreus sản sinh.
1.3. Hệ thống phân loại Aspergillus: Định danh Aspergillus theo
phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử.
1.4..Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Trình bày các nghiên
cứu ở ngoài nước và trong nước.
1.5. Tổng quan về các phương pháp chiết và phân tách hoạt chất sinh
học
- Các phương pháp chiết, tách phân đoạn: Khái niệm về các phương
pháp chiết như chiết lỏng – lỏng, chiết lỏng rắn, chiết pha rắn. Các phương
pháp sắc ký như phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc kí cột cổ
điển.
- Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học như phương pháp
khuếch tán, tự sinh đồ hay phương pháp pha loãng.
- Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất: Phổ hồng
ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng
từ hạt nhân (NMR).

trường PDB với pH môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 4, 5, 6, 7,
8.
2.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh hoạt chất
kháng khuẩn của A. terreus R-TN3: Chủng vi nấm nội sinh được nuôi
trong môi trường PDB ở 37 oC và nhiệt độ phòng (25 – 30 oC).
2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen, độ thông khí
lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn: Thiết kế mô hình thực nghiệm D –
Optimal bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6 với các thành phần môi trường
và điều kiện nuôi cấy (xi) được xác định dựa vào đường kính vòng ức chế
trên MRSA, S.aureus.
2.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của dầu lên sự sinh hoạt chất kháng
khuẩn của A. terreus R-TN3: Nuôi cấy A. terreus R-TN3 trên môi trường
đã được bổ sung 1 % dầu mè, dầu hướng dương, dầu đậu nành, dầu bắp, dầu
olive.
2.2.10. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu: Thiết kế mô hình thực
nghiệm bằng phần mềm Design - Expert 6.0.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi
cấy bằng phần mềm BC Pharsoft và nuôi cấy 3 lô kiểm chứng.
2.2.11. Nuôi cấy chủng A. terreus R-TN3 trong môi trường tối ưu: A.
terreus R-TN3 được nuôi cấy trên môi trường tối ưu đã khảo sát ở điều kiện
nuôi cấy tĩnh, nhiệt độ phòng (25 – 30 oC).
2.2.12. Chiết hoạt chất kháng khuẩn từ dịch nuôi cấy A. terreus RTN3: Sử dụng các phương pháp để chiết hoạt chất sinh học của cao chiết thô
như: Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy; Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
của chất chiết thô; Phương pháp tự sinh đồ và phương pháp vi pha loãng.
2.2.13. Tách các phân đoạn cho hoạt tính sinh học từ chất chiết thô
2.2.13.1. Sắc ký lớp mỏng: Chất chiết thô từ môi trường nuôi A. terreus
R-TN3 được hòa trong MeOH với nồng độ 8 mg/ml, chấm dung dịch chất
thử lên bản mỏng và phát hiện kết quả bằng phương pháp soi dưới đèn
UV254, UV365, thuốc thử VS.
2.2.13.2. Sắc kí cột cổ điển: Hệ dung môi được dùng để triển khai cột là
chloroform - methanol với tỷ lệ thay đổi theo hướng methanol tăng dần.

các chủng xạ khuẩn nội sinh này có khả năng sản sinh các hoạt chất sinh học
nên chúng tôi tiến hành thu nhận và định danh. Kết quả định danh được
16/32 chủng có khả năng sinh hoạt chất từ trung bình đến mạnh và thu được
kết quả sau:
3.1.4. Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao: Tiến hành
khảo sát khả năng phát triển và sinh hoạt chất sinh học của các chủng A.
terreus.
3.1.4.1. Khảo sát khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn của các chủng
A. terreus: Tiến hành nuôi các chủng A. terreus trên môi trường PDA, thử
hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm trên 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm là S.
aureus, S. feacalis, Pseudomonas, E. coli, MRSA và 1 chủng vi nấm C.
albicans vào ngày thứ 7 nuôi cấy.
Bảng 3.7. Tác động kháng khuẩn của các chủng A. terreus
STT

Chủng

1

T2– CL1

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
10,33 ± 1,33d
12,0 ± 1,54c

5



4

Chủng
T2 – CL1
Q – TL3
R – TN3
N – GL1

Kết quả chống OXH
++
++
+++
++

Chú thích: (+): có hoạt tính chống oxy hóa yếu; (++): có hoạt tính chống
oxy hóa trung bình; (+++): có hoạt tính chống oxy hóa mạnh.
Dựa vào kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy trong 4 chủng A. terreus nghiên
cứu, chủng R – TN3 sinh hoạt chất chống oxy hóa mạnh nhất, ba chủng còn
lại gồm T2 – CL1, Q – TL3, N – GL1 sinh hoạt chất chống oxy hóa ở mức
trung bình (Phụ lục 3).
3.1.4.3. Khảo sát đặc tính cao chiết
 Khảo sát hệ dung môi tối ưu: Chạy sắc ký với 8 hệ dung môi khảo
sát thu được kết quả hệ dung môi CHCl3:CH3COOH với tỷ lệ 9:1 phân tách
nhiều hoạt chất nhất ở cả 4 chủng A. terreus.
 Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy: Các cao chiết thô sau khi
được hòa tan bằng dung môi với nồng độ thích hợp được tẩm lên đĩa giấy đặt
lên môi trường đã trải dịch khuẩn thử nghiệm.
Bảng 3.10. Tác động kháng khuẩn của cao chiết thô các chủng A. terreus.
Vi khuẩn
S. aureus

PĐ
PĐ 6
PĐ 12
T2-CL1 PĐ 13
PĐ 15
PĐ 6
PĐ 9
Q-TL3 PĐ 10
PĐ 12
PĐ 15
Chủng

MRSA
9,33±1,44b
11,67±1,44a
11,33±1,44a
12,67±1,44a
0,0c
9,33±0,81b
13,67±0,81a
0,0c
9,33±0,81b

S.aureus
0,00c
11,67±1,22b
0,00c
13,33±1,22a
14,33±1,24b
9,33±1,24d

3.1.5. Khảo sát điều kiện nuôi cấy của chủng A. terreus R-TN3
3.1.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy với chủng A.
terreus R-TN3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy lên sự sinh
hoạt chất kháng khuẩn của chủng A. terreus R-TN3.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau đối với sự sinh hoạt
chất kháng khuẩn của A. terreus R-TN3
pH môi trường
4
5
6
7
8

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
11,67 ± 1,41d
9,67 ± 1,24d
14,0 ± 1,41c
15,0 ± 1,24b
a
20,67 ± 1,31
21,33 ± 1,85a
b
15,67 ± 1,41
15,67 ± 1,24b
c
14,0 ± 1,41
13,67 ± 1,24c


Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và độ thông khí lên sự
sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A. terreus R-TN3. Lượng bào tử đầu
vào là 104 CFU/ml, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Thành phần môi
trường và điều kiện nuôi cấy được xác định dựa vào đường kính vòng ức chế
của MRSA và S. aureus vào các thời điểm 5, 7, 9, 12 ngày.
Bảng 3.15. Các mức khảo sát của biến độc lập
Mức khảo sát
1
2
3
4

x1
Glucose 2 %
Saccharose 1 %
Tinh bột gạo 2 %
Rỉ đường 2,7 %

x2
Khoai tây 20 %
Cao thịt 1 %
Cao nấm men 1 %
Dịch đậu nành 10 %

x3
Lắc
Tĩnh

Từ 23 môi trường có thành phần và điều kiện thông khí khác nhau, ở môi
trường có hàm lượng khoai tây 20 %, rỉ đường 2,7 % hoặc saccharose 1 %,

20,33 ± 1,03a
14,67 ± 1,03c
15,33 ± 1,03d
c
14,67 ± 1,03
16,33 ± 1,03c
b
16,67 ± 1,03
18,0 ± 1,03b
b
17,33 ± 1,03
17,33 ± 1,03bc
b
16,33 ± 1,03
15,33 ± 1,03d

a,b,c,d,bc: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau
ở mức 0,05.
3.1.6. Thiết kế và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
3.1.6.1. Thiết kế mô hình thực nghiệm
Mô hình thực nghiệm được thiết kế bằng phần mềm Design-Expert 6.0.6
gồm 26 môi trường. Dữ liệu môi trường, đường kính vòng ức chế và sinh
khối được trình bày trong Bảng 3.17.
Bảng 3.18. Môi trường nuôi cấy A. terreus R-TN3 được thiết kế bằng
phần mềm Design Expert 6.0.6
STT
1
2
3
4

10
20
20
10
30
10
20
30
30
20

x2 (%)
2
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
0,5
0,5
0,5
0.5
0.5

0,1
0,2
0,05
0,2
0,05
0,1
0,2
0,1
0,05
0,2
0,1
0,2
0,05
0,1
0,2
0,1
0,1
0,2
0,05

y1
22
22
22
23
21
24
24
21
20

0,0561
0,0543
0,1124
0,1397
0,1409

9


22
23
24
25
26

10
10
30
10
20

1
2
2
2
2

Saccharose
Saccharose
Saccharose

x2
3,28
x3
Rỉ đường
x4
0,1

Tính chất sản phẩm
yi
Giá trị dự đoán
y1
22,03
y2
0,17

Thành phần môi trường tối ưu dự đoán gồm khoai tây 30 %; rỉ đường
3,28 %; lượng nấm đầu vào có OD530 = 0,1; sử dụng 1 ml dịch nấm cho 100
ml môi trường nuôi cấy.
Kiểm chứng công thức tối ưu bằng thực nghiệm,so sánh với kết quả dự
đoán: Tiến hành nuôi cấy 3 lô với các điều kiện tối ưu trong cùng một điều
kiện và xác định các thông số yi. Kết quả phân tích phương sai 2 yếu tố
không lặp những số liệu trong bảng cho thấy: Quy trình nuôi cấy có tính lặp
lại, tính chất sản phẩm giữa 3 lô khác nhau không có ý nghĩa thống kê
(p=0,87 > 0,05). Kết quả dự đoán của phần mềm khác nhau không có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05). Do đó, phần mềm BC Pharsoft đã dự đoán đúng
điều kiện nuôi cấy tối ưu cũng như tính chất của dịch nuôi cấy.
3.1.7. Khảo sát dung môi chiết tối ưu: Nuôi cấy chủng A. terreus RTN3 trên môi trường tối ưu, sau đó tiến hành chiết 2 lần (1:1) với dung môi.
Bảng 3.27. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết
Dịch chiết
Methanol

Bảng 3.28. Tác động kháng khuẩn của các chất chiết của A. terreus R-TN3.
Chất thử
Chiết từ dịch nuôi cấy
Chiết từ sinh khối

Đường kính vòng ức chế (mm)
S. aureus
MRSA
17,33 ± 0,93a
17,33 ± 0,93a
0,0b
0,0b

a,b: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở mức
0,05. Chất chiết từ môi trường nuôi nấm A. terreus R-TN3 có tác động
kháng khuẩn đối với S.aureus và MRSA. Chất chiết từ sinh khối nấm A.
terreus R-TN3 không có tác động kháng khuẩn đối với S.aureus và MRSA.
3.1.9. Nuôi cấy và chiết hoạt chất kháng khuẩn từ A. terreus R-TN3:
Dịch nuôi cấy sau 7 ngày có màu nâu xám được chiết với EtOAc để cho
chất chiết thô – EtOAc (chất CT – EtOAc). Chất CT – EtOAc đã hút ẩm đến
khối lượng không đổi: Màu nâu đen, có mùi thơm, thể chất dẻo. Kết quả
nuôi cấy từ 1 lít môi trường nuôi cấy tối ưu, thu được khoảng 415 mg cao
thô. Để có đủ lượng cao thô để có thể cô lập được hợp chất tinh khiết cho
việc chạy phổ xác định cấu trúc, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trên 50 lít
môi trường.
3.1.10. Xác định hoạt tính sinh học của cao chiết thô
3.1.10.1. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thô
Cao chiết thô sau khi được hòa tan bằng dung môi với nồng độ thích hợp
được tẩm lên đĩa giấy đặt lên môi trường đã trải dịch khuẩn thử nghiệm bằng
phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy. Kết quả cho thấy cao chiết thô có tác

15,33 ± 1,15
15,33 ± 1,15a

a,b,c: Trong cùng 1 cột các số có cùng mẫu tự không khác biệt nhau ở
mức 0,05.
3.1.12. Sắc ký cột cổ điển
Tổng khối lượng cao cả 9 phân đoạn thu được qua quá trình sắc ký cột là
10,592 g. Từ phân đoạn 1 tinh sạch được hợp chất X1 màu vàng nhạt, dạng
vô định hình, có Rf là 0,692. Tiến hành định tính khả năng chống oxy hóa
của hợp chất X1 bằng DPPH, kết quả cho thấy hợp chất X1 có hoạt tính
chống oxy hóa mạnh. Từ phân 3 gam phân đoạn 1 trên (sau khi đã tách
hợp chất X1), nhồi chạy cột nhỏ với hệ dung môi n-hexan : chloroform
(9:1).
Bảng 3.35. Kết quả chạy cột của phân đoạn 1
PĐ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

6:4
6:4
6:4
6:4
5:5
5:5
5:5

Vết
4
0
0
3
2
2
3
3
0
4
2
4
3
2
1

Ghi chú
Tạp

Chất Y


µg/ml thì cho hoạt tính kháng với chủng S. aureus và MRSA ở mức trung
bình. Bằng phương pháp SKLM và tự sinh đồ, đã chiết được hợp chất Y
chứa hai hợp chất khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn và xác định được giá
trị MIC của hợp chất Y là 25 µg/ml.
3.1.13.2. Kết quả thử độc tế bào của hợp chất Y
Thử độc tế bào trên tế bào ung thư vú MCF-7: Hợp chất Y được xác
định khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7.
Bảng 3.38. Kết quả thử độc tế bào vú MCF-7 của hợp chất Y
Nồng độ
(μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
76,90
87,02
89,23 84,38 6,57
70,09
71,58
69,51 70,39 1,07
43,75
48,09
45,21 45,69 2,21


Lần 1
64,36
52,14
50,31
29,12
20,16
9,37
39,86

Lần 2
65,59
52,83
51,42
21,05
19,03
10,32
39,53

Lần 3
61,56
60,75
53,23
24,73
16,40
8,60
38,87

TB
63,83

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
78,25
75,00
70,07 74,44 4,12
61,63
58,86
56,58 59,02 2,53
46,83
41,34
35,36 41,18 5,73
26,89
29,13
23,85 26,62 2,65
-1,27
-3,56
-2,27
-2,37
1,15
52,38
56,45
63,80 57,54 5,79

Khả năng ức chế tế bào ung thư Hep G2 của hợp chất Y gia tăng tuyến
tính theo nồng độ. Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 59 % tế bào Hep G2 và
khi tăng lên ở nồng độ 100 µg/ml gây chết hơn 74 % tế bào Hep G2.
Thử độc tế bào trên tế bào ung thư phổi NCI-H460: Hợp chất Y được
xác định khả năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460.

-6,90
7,94
71,07
68,79
66,56 68,81 2,26

14


Khả năng ức chế tế bào ung thư NCI-H460 của hợp chất Y gia tăng tuyến
tính theo nồng độ. Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 61 % tế bào NCI-H460
và khi tăng lên ở nồng độ 100 µg/ml gây chết hơn 80 % tế bào NCI-H460.
3.1.15. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân tách
3.1.15.1. Hợp chất X1: Hợp chất X1 thu được từ sắc ký cột cổ điển, được
xác định cấu trúc dựa vào các kỹ thuật phổ như phổ H, C13, phổ HRMS và
phổ 2 chiều để xác định cấu trúc (Phụ lục 4). Kết quả cho thấy hợp chất X1
có công thức cấu tạo như sau:

Hình 3.18. Các tương tác HMBC chính và CTCT của X1
Chất X1 có tên gọi: Methyl 2-acetyl-5-methoxy-4-oxo-4H-chromen-7carboxylat. Đây là hợp chất mới, chưa được công bố ở công trình nào trong
nước và trên thế giới.
3.1.15.2. Hợp chất X2: Hợp chất X2 thu được từ sắc ký cột cổ điển, được
xác định cấu trúc dựa vào các kỹ thuật phổ như phổ H, C13, phổ HRMS và
phổ 2 chiều để xác định cấu trúc (Phụ lục 5). Dung môi hòa tan mẫu:
DMSO. Kết quả cho thấy hợp chất X2 có công thức cấu tạo như sau:

Hình 3.19. Các tương tác HMBC và CTCT của X2
Chất X2 có tên gọi: Methyl 2-((4-amino-2-bromo-3-methyl-5thioxocyclopenta-1,3-dien-1-yl) oxy)-4-hydroxy-6-methoxybenzoat. Đây là
hợp chất mới và chưa được công bố ở bất cứ công trình nào trên thế giới.
3.1.16. Kết quả thử hoạt tính sinh học của hợp chất X1

28,88

Lần 2
81,27
73,61
65,20
31,40
11,29
4,12
30,04

Lần 3
79,87
78,34
71,28
34,50
8,05
-3,09
27,90

TB
80,65
75,67
68,47
33,01
9,96
0,06
28,94

ĐLC

84,20
64,11
59,27
25,00
2,82
45,39

Lần 3
81,10
66,51
60,14
23,92
0,91
45,59

TB
85,36
65,37
59,33
23,35
-0,01
45,75

ĐLC
4,94
1,20
0,78
2,00
3,39
0,46

Lần 3
77,23
74,58
64,26
32,26
14,58
37,35

TB
79,62
75,41
65,68
33,79
13,94
36,03

ĐLC
2,31
0,72
1,52
2,19
1,54
1,63

16


Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 75 % tế bào NCI-H460 và tăng lên gây
chết gần 80 % tế bào ung thư gan Hep G2 ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào NCI-H460: Các hợp chất phân lập được xác định khả

31,09
20,08
29,74

TB
78,34
71,75
62,87
30,68
19,88
30,90

ĐLC
2,06
2,90
2,24
1,48
3,19
1,19

Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết hơn 70 % tế bào NCI-H460 và tăng lên gần
80 % tế bào NCI-H460 ở nồng độ 100 µg/ml. Kết quả cho thấy hợp chất X1
có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, thông qua khả
năng ức chế 4 dòng tế bào thử nghiệm: ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử
cung Hela, ung thư gan Hep G2 và ung thư phổi NCI-H460.
3.1.17. Kết quả thử hoạt tính sinh học của hợp chất X2
3.1.17.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm
DPPH của hợp chất X2: Hợp chất X2 được xác định khả năng chống oxy
hóa bằng thử nghiệm DPPH. Kết quả cho thấy chất X2 có hoạt tính chống
oxy hóa khá cao, khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH gia tăng tuyến tính theo

19,34
27,95
27,62 24,97 4,88
-9,67
-7,38
-8,32
-8,45
1,15
44,45
41,20
41,14 42,26 1,89

17


Khả năng ức chế tế bào của hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ.
Ở nồng độ 75 µg/ml gây chết hơn 74 % tế bào ung thư vú MCF-7 và tăng lên
gây chết gần 80 % tế bào MCF-7 ở nồng độ 100 µg/ml.
Thử độc tế bào ung thư cổ tử cung Hela: Hợp chất X2 được xác định
khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung Hela.
Bảng 3.54. Kết quả thử độc tế bào Hela của chất X2
Nồng độ (μg/ml)
75
50
40
30
20
10
IC50


52,13
24,93
7,14
-4,19
39,21

ĐLC
3,22
2,42
1,01
2,10
1,19
4,04
0,41

Khả năng ức chế tế bào của hợp chất X2 gia tăng tuyến tính theo nồng độ.
Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết hơn 58 % tế bào ung thư Hela và tăng lên gây
chết hơn 65 % tế bào Hela ở nồng độ 75 µg/ml.
Thử độc tế bào Hep G2: Hợp chất X2 được xác định khả năng ức chế tế
bào ung thư gan Hep G2.
Bảng 3.55. Kết quả thử độc tế bào ung thư gan Hep G2 của chất X2
Nồng độ
(μg/ml)
100
75
50
25
10
IC50


Thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460: Hợp chất X2 được xác định
khả năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460.
Khả năng ức chế tế bào ung thư phổi NCI-H460 của hợp chất X2 gia tăng
tuyến tính theo nồng độ. Ở nồng độ 50 µg/ml gây chết gần 50 % tế bào ung
thư phổi NCI-H460 và tăng lên gây chết hơn 70 % tế bào NCI-H460 ở nồng
độ 75 µg/ml. Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào hợp chất X1 và X2 cho thấy
chất X1 có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư in vitro tốt hơn X2. Do
đó, chúng tôi bước đầu tìm hiểu cơ chế tác động của X1 thông qua khả năng
cảm ứng apoptosis (Bảng 3.55).
18


Bảng 3.56. Kết quả thử độc tế bào ung thư phổi NCI-H460 của chất X2
Nồng độ
(μg/ml)
75
50
40
30
20
IC50

Phần trăm ức chế tế bào (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3
TB
ĐLC
72,77
74,02
67,47 71,42 3,47
46,88

kiện khảo sát.
Hình 3.20. Kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh; M:
thang chuẩn 100 bp
1. Tế bào NCI-H460 được xử lý với X1 ở nồng độ 100
µg/ml trong 48 giờ
2. Tế bào NCI-H460 đối chứng (không xử lý)
3. Tế bào NCI-H460 được xử lý với X1 ở nồng độ 100
µg/ml trong 69 giờ

3.1.18.2. Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép
AO/EB
Chúng tôi tiến hành nhuộm các tế bào NCI-H460 đối chứng (tế bào
không được xử lý) và tế bào ủ với X1 ở nồng độ 100 µg/ml, trong 36, 48 và
60 giờ với dung dịch nhuộm AO:EB.
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy sự thay đổi
trong hình thái của tế bào được ủ với X1 so với tế bào đối chứng. Mẫu tế bào
NCI-H460 được xử lý với chất chuẩn Camptothecin (CPT) ở nồng độ 0,01
µg/ml trong 36 giờ là chứng dương của quy trình (Hình 3.21).
19


Hình 3.21. Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép
AO/EB
3.1.18.3. Thử nghiệm Caspase-3
Chúng tôi tiến hành xử lý tế bào NCI-H460 với X1 ở nồng độ 100 µg/ml
trong 36, 48 và 60 giờ để khảo sát khả năng hoạt hóa caspase-3 của X1 trong
quá trình apoptosis (Biểu đồ 3.15).
Kết quả cho thấy hoạt tính caspase-3 tăng có ý nghĩa thống kê sau 36 giờ
xử lý với X1 ở nồng độ 100 µg/ml, tiếp tục tăng và đạt mức tối ưu ở 48 giờ,
và sau đó giảm mạnh khi thời gian xử lý kéo dài 60 giờ (hình dưới). Mẫu tế

sinh.
3.2.2. Sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học
Đa số các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae)
được phân lập đều có sự hiện diện của vi nấm nội sinh tuy nhiên không phải
toàn bộ vi nấm nội sinh đều có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng
nấm và chống oxy hóa. Trong nghiên cứu này chỉ có 21/146 chủng được
phân lập cho hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và 18/146 chủng có hoạt
tính chống oxy hóa. Định danh được 16/32 chủng vi nấm nội sinh trong đó
có 4 chủng A. terreus có khả năng sinh hoạt chất sinh học cao.
3.2.3. Định danh chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao
Về mặt hình thái học, các chủng A. terreus thể hiện đầy đủ các đặc điểm
của chủng khi nuôi cấy đó là nấm phát triển tương đối nhanh, khuẩn lạc tròn,
dạng bột, mịn như nhung, có màu vàng nâu đến màu nâu sậm ở giữa, vòng
ngoài có màu trắng dần chuyển sang nâu, mặt trái có màu vàng sẫm; cho sắc
tố màu nâu đến nâu đen lan ra môi trường; có xuất hiện giọt tiết ở ngày thứ
10 nuôi cấy. Khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm không có vách ngăn
không màu, tồn tại bào tử đính bên - một loại bào tử đính hay hạt đính; phần
đỉnh to ra thành bọng hình chùy, bọng mang các thể bình, bào tử đính ngắn,
trơn.; các thể bình song song hoặc hợp thành cụm ở đỉnh bọng, thể bình có
hai tầng; đầu dạng hình tia tỏa tròn phù hợp với khóa phân loại của Raper
KB năm 1965 [61], các tài liệu liên quan [61], [78] và đúng với chủng Bộ
môn đã mô tả. Định danh các chủng A. terreus bằng phương pháp giải trình
tự gen vùng ITS và tra cứu trên BLAST SEARCH cho kết quả tương tự như
21


phương pháp hình thái, góp phần khẳng định các chủng có khả năng sinh
chất có hoạt tính sinh học cao mà đề tài phân lập được chính là A. terreus.
3.2.4. Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao
Qua quá trình sàng lọc và phân lập đã chọn được 4 chủng A. terreus có

nấm men. Ở nghiên cứu của chúng tôi, chủng A. terreus R-TN3 không sinh
hoạt chất kháng khuẩn khi môi trường có nguồn nitrogen là cao nấm men.
Sự khác biệt này có thể liên quan đến yếu tố chủng.
Trên các môi trường có nguồn carbon khác như glucose, saccharose, rỉ
đường và tinh bột tan, A. terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu ở
các môi trường có nguồn carbon là rỉ đường hoặc saccharose. Tinh bột tan
22


và glucose không thích hợp cho quá trình sinh hoạt chất kháng khuẩn của A.
terreus R-TN3. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Mathan S và cộng
sự năm 2013 trên chủng A. terreus KC 582297 (nguồn carbon tối ưu là
saccharose, kém nhất là tinh bột).
Với nguồn nitrogen là khoai tây, nguồn carbon là saccharose hoặc rỉ
đường, mật độ tế bào nấm đầu vào là 104 tế bào/ml, được xác định bằng
quang phổ kế với OD530 nm = 0,1 (1 ml dịch nấm cho 100 ml môi trường). Sử
dụng phần mềm BC Pharsoft đã dự đoán thành phần môi trường tối ưu để A.
terreus R-TN3 sinh hoạt chất kháng khuẩn tối ưu là: khoai tây 30 %; Rỉ
đường 3,28 %; Lượng nấm đầu vào: 104 tế bào/ml; Ủ ở điều kiện tĩnh trong
7 ngày. Xác định hiệu quả kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán cho
thấy kết quả thực nghiệm phù hợp với dự đoán của phần mềm.
3.2.6. Chủng A. terreus R-TN3 và các chất có hoạt tính sinh học
Quần thể vi nấm nội sinh thuộc chi Aspergillus đã được phân lập từ nhiều
thực vật và được chứng minh là có khả năng sinh chất có nhiều hoạt tính
sinh học bao gồm hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng tế bào ung
thư,... Trong nghiên cứu này A. terreus R-TN3 được phân lập từ thân non
của cây Riềng (Alpinia chinensis Rosc.) và từ các cây khác cho chất có hoạt
tính kháng khuẩn và chống oxy hóa cao. Đặc điểm kháng MRSA và S.
aureus cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu đã công bố, một số chủng
A.terreus phân lập từ đất hoặc từ thực vật cũng cho phổ kháng trên một số vi