TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
********
PHẠM NGỌC ANH
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP LƢU TRỮ VÀ
BẢO QUẢN IN VITRO GIỐNG KHOAI MÔN –SỌ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Kỹ thuật Nông nghiệp
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS.Vũ Ngọc lan
HÀ NỘI, 2014
Phạm Ngọc Anh
K36C – Sinh KTNN
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
TS. Vũ Ngọc Lan giảng viên trƣờng Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận
tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho tôi các phƣơng pháp nghiên cứu khoa học
và những kinh nghiệm học thật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận.
Đồng thời, tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo trong khoa
Sinh – KTNN Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2, đã tạo điều kiện cho tôi
đƣợc tiếp thu những kiến thức chuyên môn về chuyên ngành Kĩ thuật Nông
nghiệp
Nhân dịp này, cũng cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng biết ơn tới những
ngƣời thân trong gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi
Hà Nội, Ngày 06 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Phạm Ngọc Anh
Phạm Ngọc Anh
K36C – Sinh KTNN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D
: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
BA
: 6-Benzyladenine
BAP
: N6-Benzyl aminopurine
CT
: Công thức
DC
: Đối chứng
: Daminozide
Phạm Ngọc Anh
K36C – Sinh KTNN
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................... 1
2. Mục đích và mục tiêu ............................................................................. 2
2.1. Mục đích.......................................................................................... 2
2.2. Yêu cầu........................................................................................... 3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài................................................. 3
3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................. 3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................. 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về cây khoai môn – sọ (Colocasia esculenta) ........... 4
1.1.1. Nguồn gốc .................................................................................... 4
1.1.3. Phân bố ........................................................................................ 5
1.2. Các phƣơng pháp bảo tồn .................................................................... 7
1.3. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ...................................... 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ trên thế giới ........... 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ tại Việt Nam ........ 11
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ ............................................... 13
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 13
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................ 13
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................... 13
2.2.1. Địa điểm ..................................................................................... 13
Phạm Ngọc Anh
K36C – Sinh KTNN
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân bố khoai môn – sọ trên thế giới trong những năm gần đây ..... 6
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng ................... 20
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các nền môi trƣờng đến thời gian cấy chuyển cây
khoai môn – sọ in vitro ................................................................................. 22
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển cây
khoai môn – sọ in vitro ................................................................................. 24
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến thời gian cấy
khoai môn – sọ in vitro ............................................................................... 26
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng đến khả năng hình thành củ trên
giống TH1 .................................................................................................... 27
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng hình thành củ
trên giống TH1 ............................................................................................. 29
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của chất kìm hãm sinh trƣởng đến sự hình thành củ
trên giống TH1 ............................................................................................ 30
Phạm Ngọc Anh
K36C – Sinh KTNN
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Khoai môn, khoai sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) thuộc họ Ráy
K36C – Sinh KTNN
các vùng khác nhau, của nƣớc ta với các nƣớc khác. Việc mô tả và đánh giá đa
dạng di truyền quỹ gen cây khoai môn – sọ sẽ cung cấp một số thông tin cần
thiết về sự biến dị di truyền có ở các vât liệu nghiên cứu. Những thông tin thu
đƣợc sẽ đƣợc sử dụng hữu ích trong công tác chọn tạo giống khoai môn – sọ
mới.
Tại Việt Nam những nghiên cứu về sử dụng chỉ thị phân tử (RAPD và
SSR) để đánh giá đa dạng di truyền các giống khoai môn – sọ còn khiêm tốn,
mới chỉ có một dự án hợp tác của Trung tâm Tài nguyên thực vật đƣợc tiến
hành. Ứng dụng Công nghệ Sinh học, cụ thể sử dụng phƣơng pháp RAPD
trong phân tích các mẫu giống còn ít, hơn nữa việc ứng dụng phƣơng pháp
SSRs trong các thí nghiệm hầu nhƣ chƣa thực hiện. Việc nuôi cấy và giữ cây
khoai môn – sọ in vitro cũng đã gặp không ít những khó khăn, thời gian giữ
giống thấp nên tốn công sức cấy chuyển. Khi số lần cấy chuyển tăng lên
thƣờng rất dễ xảy ra các biến dị soma ảnh hƣởng không tốt cho việc bảo quản
giống. Ngoài ra kích thƣớc cây khoai môn – sọ in vitro khá lớn cũng đã gây ra
những khó khăn nhất định khi cấy chuyển chúng. Việc bảo tồn và lƣu giữ
nguồn gen trong nuôi cấy in vitro ngày càng đƣợc quan tâm.
Khoai môn – sọ là cây cho thu củ, củ là thực phẩm cũng là nguyên liệu
cung cấp cho ngành dƣợc đồng thời củ cũng là hình thức để giống phổ biến,
chính vì vậy củ thuộc loại giàu dinh dƣỡng, nên rất khó lƣu giữ, nhất là trong
bảo quản củ làm giống. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên chúng tôi tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu ph
ng ph p
u gi v
Phạm Ngọc Anh
3
K36C – Sinh KTNN
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây khoai môn – sọ (Colocasia esculenta)
1.1.1. Nguồn gốc
Cây khoai môn – sọ (Colocasia esculenta) là cây Một lá mầm thuộc chi
Colocasia, họ Araceae (họ Ráy).
Các bằng chứng phân loại thực vật cho thấy rằng khoai môn – sọ có
nguồn gốc ở Nam Trung Á, có lẽ ở Ấn Độ hoặc bán đảo Mã Lai. Dạng hoang
dại phát sinh ở các vùng khác nhau của Đông Nam Á (Purseglove, 1972). Gần
đây nhiều tác giả đều thống nhất rằng rất nhiều dạng hoang dại và dạng trồng
của cây khoai môn – sọ có nguồn gốc tại các dải đất kéo dài từ Đông Nam Ấn
Độ và Đông Nam Á tới Papua New Guuinea và Melanesia (Kuruvilla và Singh,
1981; Matthew, 1995; Lebot, 1999). Từ châu Á, khoai môn sọ lan rộng về phía
tây tới Ả Rập Saudi và vùng Địa Trung Hải.
1.1.2. Phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vât, loài khoai môn – sọ có vị trí phân loại sau :
Giới
:
Thực vât (Plantae)
Ngành
:
Aroideae
Chi
:
Khoai môn (Colocasia)
Loài
:
Colocasia esculenta
Phạm Ngọc Anh
4
K36C – Sinh KTNN
Cây khoai môn – sọ thuộc chi Colocasia là một trong những chi quan
trọng nhất trong họ ráy (Araceae). Do có lịch sử dài lâu nhân giống vô tính nên
hiện nay vấn đề phân loại thực vật, còn có nhiều điểm chƣa rõ ràng.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều các giống môn – sọ với nhiều biến
dạng thực vật, tuy nhiên hầu hết các giống đều thuộc hai nhóm chính:
• Colocasia esculenta (L.) Schott var. esculenta đƣợc mô tả là cây có
một củ cái chính to hình trụ và rất ít củ con thƣờng đƣợc gọi là dạng dasheen.
Toàn
Châu
Năm thế
Phi
giới
Bắc +
Trung
Mỹ
Châu
Á
Châu
Đại
Dƣơng
1998 0,381 0,207 0,0016 0,00076 0,131
0,042
Diện tích
1999 1,421 1,247 0,0018 0,00076 0,130
0,041
(triệu ha)
2000 1,450 1,276 0,0018 0,00076 0,129
5,9
Năng suất 1999
(tấn/ha) 2000
6,23
5,35
10,12
5,4
14,5
6,4
6,12
5,22
10,23
5,4
14,9
6,3
môn –
1,928
0,265
2001 8,974 6,756 0,0183 0,0041
1,923
0,273
1998 8,706 6,538 0,0161
trồng
khoai
Nguồn FAO 2001
Cũng theo số liệu của FAO tính đến năm 2004 nƣớc có diện tích trồng
khoai môn - sọ lớn nhất là Trung Quốc: 86,881ha, tiếp đến là Nigeria:
59,400ha. Về năng suất, Châu Á có năng suất bình quân cao nhất là
15,1tấn/ha, còn Châu Phi có năng suất thấp nhất 5,23 tấn/ha. Quốc gia trồng
khoai môn - sọ có năng suất cao nhất là Cyprus đạt tới 27,4 tấn/ha, nƣớc trồng
có năng suất thấp nhất là Togo chỉ đạt 1,2 tấn/ha.
Năm 2005, tổng sản lƣợng khoai môn – sọ trên thế giới đạt 9,2 triệu
tấn. Trong đó, nƣớc có sản lƣợng khoai môn – sọ lớn nhất là Nigeria với
sản lƣợng đạt 4,0 triệu tấn. Tiếp sau đó là Ghana 1,8 triệu tấn, China 1,6
triêu tấn (FAO, 2005).
Phạm Ngọc Anh
6
với chế độ chiếu sáng 12 giờ trong 1 ngày đêm, nhiệt độ đƣợc duy trì 280C vào
ban ngày và 240C vào ban đêm, đã nuôi cấy rất thành công mô phân sinh của
Phạm Ngọc Anh
7
K36C – Sinh KTNN
cây khoai môn – sọ và các cây khác trong các chi khác thuộc họ ráy (Araceae)
nhƣ Xanthoxoma, Alocasia… (Strauss and Arditti, 1980; Krikorian, 1994). Ở
Hawai và Samoa, ngƣời ta dùng cả chồi đỉnh và chồi bên của giống khoai
thuộc nhóm C. esculenta var. esculenta để nuôi cấy và nhân giống trên môi
trƣờng nƣớc dừa và MS đƣợc bổ sung Adenine hoặc BAP và 2IP [1].
Một số tác giả đã đề cập đến tận dụng khả năng ra hoa, kết hạt để có thể
làm giàu nguồn gen và có hạt giống tiến tới bảo quản trong ngân hàng gen hạt
(Hirai, 1989).
Từ năm 2001, Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật bắt đầu nghiên
cứu bảo tồn Insitu cho nguồn gen cây có củ này. Nguồn gen khoai môn – sọ
đƣợc bảo tồn khá tốt trong các vƣờn gia đình và tại một số vùng có truyền
thống sản xuất khoai môn – sọ nhƣ huyện Yên Thuỷ và Đà Bắc tỉnh Hoà Bình,
huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình, huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La, huyện Tràng
Định tỉnh Lạng Sơn và huyện Thạch An tỉnh Cao Bằng…[5].
1.3. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ
1.3.1. Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ trên thế giới
Để tiến hành nuôi cấy khoai môn – sọ, ngƣời ta thƣờng sử dụng củ khoai
môn – sọ để làm mẫu. Củ khoai môn – sọ là bộ phận sử dụng chủ yếu, chúng
nằm trong đất nên thƣờng dễ bị nấm bệnh tấn công. Cũng chính vì vậy việc vào
mẫu nuôi cấy cũng đã gặp không ít khó khăn. S. Seetohul và D. Puchooa đã
mẫu ở các nồng độ từ 0,13 – 1,13 mg/l. Trong đó công thức thí nghiệm với BA
hệ số nhân cao nhất ở nồng độ 1,13 mg/l. Sau 12 tuần nuôi cấy hệ số nhân cao
nhất thu đƣợc ở thí nghiệm với BA và TDZ đều là ở nồng độ 1,13 mg/l. Sau
khi tổng kết thí nghiệm tác giả đã tìm ra môi trƣờng nhân nhanh thích hợp là:
MS + 1 mg/l BA với hệ số nhân là 4,5 lần
MS + 1 mg/l TDZ với hệ số nhân là 25 lần sau 20 tuần nuôi cấy
Theo tác giả thì khi nuôi cấy trên môi trƣờng TDZ tuy hệ số nhân cao hơn
trên môi trƣờng BA nhƣng chồi nhỏ và yếu hơn[13].
Trong trƣờng hợp protocol (Deo et al. (2009)) tạo từ lát củ nuôi cấy
in vitro trên môi trƣờng MS có 2,0 mg/l 2,4-D trong khoảng 20 ngày ở điều
kiện tối, sau đó cấy chuyển sang môi trƣờng MS với 1,0 mg/l TDZ đặt ở trong
tối. Chồi callus hình thành sau 75 ngày và tiếp tục nuôi cấy đến 100 ngày. Sử
dụng môi trƣờng có 1 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l TDZ đã hình thành chồi callus
nhƣng tần số thấp hơn so với môi trƣờng chứa 2 mg/l 2,4-D và 1 mg/l TDZ.
Phạm Ngọc Anh
9
K36C – Sinh KTNN
Nồng độ các chất trên có thể khác nhau giữa các loại khoai môn – sọ. Chồi
Callus đƣợc hình thành trong môi trƣờng MS có cả 2 loại hormone: 0,5 mg/l
2,4-D, 1 mg/l TDZ, 800 mg/l glutamine rồi chuyển tới môi trƣờng nửa MS, nó
phân hóa tạo phôi [12].
Năm 2010, Deo Pradeep C và cộng sự đã nghiên cứu và đƣa ra kết luận
rằng: Việc tạo phôi vô tính từ callus đƣợc cảm ứng bằng cách nuôi cấy lát cắt
mỏng của củ Khoai môn - sọ trong môi trƣờng MS rắn hoặc bán rắn có chứa 2
mg/l 2,4-D trong 20 ngày rồi chuyển sang môi trƣờng chứa 1 mg/l TDZ.
những năm gần đây do nhận thấy giá trị của cây khoai môn – sọ mà vấn đề
nghiên cứu nhân nhanh đang nhận đƣợc sự quan tâm rất lớn. Đã có nhiều các
công trình nghiên cứu với các kết quả công bố về bƣớc đầu trong nhân giống
khoai môn – sọ bằng nuôi cấy mô tế bào: Công trình nghiên cứu của Phân Viện
sinh học Đà Lạt (2003)…
Để phục tráng giống và làm sạch bệnh của các dòng, giống
khoai môn – sọ bị thoái hóa hoặc bị nhiễm bệnh, Nguyễn Thị Ngọc Huệ và
Đinh Thế Lộc đã sử dụng phƣơng pháp nhân giống in vitro [4]. Các mô phân
sinh từ chồi bên của củ cái sau khi đƣợc khử trùng bằng thủy ngân (HgCl2)
đƣợc đƣa vào môi trƣờng MS có bổ sung 10mg/l IAA. Sau khi mô phân sinh
tạo chồi, chúng đƣợc cây chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l αNAA để
tạo rễ. Cá cây này đƣợc đem trồng vào khay 1 tháng trƣớc khi đem ra trồng
trên đồng ruộng.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của việc bổ sung các chất điều tiết sinh trƣởng và
hiệu quả khi kết hợp chúng với nhau, tại Phân Viện Sinh học Đà Lạt, Dƣơng
Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã tìm ra môi trƣờng nhân nhanh thích hợp nhất là
môi trƣờng MS + 2mg/l BA + 0/5mg/l IAA + 3% saccaroza. Môi trƣờng ra rễ
thích hợp nhất là MS + 0/1mg/l BA + 1% saccaroza [11].
Để mở rộng diện tích trồng khoai môn – sọ thì việc cung cấp đủ lƣợng
giống là điều cần thiết. Do đó quá trình nhân giống khoai môn – sọ in vitro cần
có đƣợc môi trƣờng nhân nhân nhanh tối ƣu làm tăng hệ số nhân của
khoai môn – sọ. Năm 2008, Nguyễn Thị Loan đã nghiên cứu ảnh hƣởng của
nồng độ TDZ đến hệ số nhân của khoai môn – sọ. Mẫu đƣợc cấy trong môi
trƣờng MS có bổ sung TDZ với các nồng độ khác nhau: 0,5mg/l, 1mg/l,
1,5mg/l, 2mg/l. Tác giả đi đến kết luận: TDZ là chất điều tiết sinh trƣởng cho
Phạm Ngọc Anh
11
- Tủ sấy: Để khô các dụng cụ.
- Cân phân tích: Để cân các loại hóa chất.
- Cân kỹ thuật: Cân agar, đƣờng.
- Tủ lạnh: Bảo quản các hóa chất và môi trƣờng.
- Bếp gas: Đun hóa chất.
- Máy đo pH.
- Các loại hóa chất, vật tƣ sử dụng trong nuôi cấy mô.
* Phòng cấy:
- Tủ cấy vô trùng.
- Đèn cực tím.
- Các dụng cụ cấy nhƣ: dao, kéo, panh, đèn cồn...
- Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy.
* Phòng nuôi cây:
Phạm Ngọc Anh
13
K36C – Sinh KTNN
- Máy điều hòa nhiệt độ, nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C.
- Nhiệt kế đo nhiệt độ phòng nuôi.
- Ẩm kế đo độ ẩm phòng nuôi.
- Gía lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m.
2.3.2. Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm
Môi trƣờng MS (Murashige and Skoog) gồm các thành phần sau:
Hóa chất
Khối lƣợng
- H3BO3
620,00
mg/l
- ZnSO4.7H2O
860,00
mg/l
- MnSO4.4H2O
2230,00
mg/l
- KI
83,00
mg/l
- Na2MoO4.2H2O
25,00
mg/l
- Glicine
100,00
mg/l
- FeSO4.7H2O
5,56
g/l
- Na2EDTA.2H2O
7,46
g/l
* Nguyên tố đa lƣợng : - MgSO4.7H2O
* Nguyên tố vi lƣợng:
* Vitamin:
* FeEDTA
Phạm Ngọc Anh
14
- MgSO4.7H2O
737,00
mg/l
- KCl
65,00
mg/l
- NaH2PO4
16,50
mg/l
- Na2SO4
200,00
mg/l
- H3BO3
1,50
mg/l
- Fe2(SO4)3
2,50
mg/l
- Thiamine (B1)
0,10
mg/l
- Pyridoxine (B6)
0,10
mg/l
- Nicotinic acid (B5)
0,50
mg/l
- Glicine
3,00
mg/l
- MgSO4.7H2O
250,00
mg/l
- NaH2PO4
130,50
mg/l
- CaCl2
150,00
mg/l
- H3BO3
3,00
mg/l
- ZnSO4.7H2O
2,00
mg/l
- Na2EDTA.2H2O
37,30
mg/l
- FeSO4.7H2O
27,80
mg/l
- Thiamine (B1)
10,00
mg/l
- Pyridoxine HCl
0,10
mg/l
- Nicotinic acid (B5)
1,00
mg/l
sung + 20g/l Saccaroza + 6g/l agar với các công thức nhƣ sau:
CT1: MS.
CT2: B5.
CT3: White.
Mỗi công thức thí nghiệm đƣợc tiến hành làm với 3 lần nhắc lại, mỗi
lần 10 bình mỗi bình 1 cây.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza đến thời
gian cấy chuyển cây khoai môn – sọ in vitro.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên giống TH1 với các loại nền môi
trƣờng đƣợc bổ sung 20g/l saccaroza + 6g/l agar với các công thức nhƣ sau:
CT1: MS+ 20g/l saccaroza.
CT2: MS+ 30g/l saccaroza.
CT3: MS+ 40g/l saccaroza.
Mỗi công thức thí nghiệm đƣợc tiến hành làm với 3 lần nhắc lại, mỗi
lần 10 bình mỗi bình 1 cây.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến thời gian
cấy chuyển cây khoai môn – sọ in vitro.
Với mục đích bảo quản nguồn giống khoai môn – sọ bằng phƣơng pháp
duy trì sinh trƣởng chậm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung NaCl vào
Phạm Ngọc Anh
17
K36C – Sinh KTNN
môi trƣờng nuôi cấy nhằm hạn chế sự tăng trƣởng của cây và xác định nồng
độ NaCl thích hợp trên giống TH1, với nền môi trƣờng là công thức MS +
20g/l Saccaroza + 6g/l agar theo các công thức nhƣ sau:
K36C – Sinh KTNN
Copyright: Tài liệu đại học ©