Bộ giáo dục và đào tạo
Trờng đại học nông nghiệp I
-------

-------

lơng xuân thế

Khảo sát các chỉ tiêu an toàn và hiệu
lực của vacxin phòng bệnh xuất
huyết truyền nhiễm thỏ

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.62.50

Ngời hớng dẫn khoa học: TS. Trần thị liên

Hà nội - 2007


Lời cam đoan

- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
này là trung thực và cha từng đợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào
- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này
đ đợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đ đợc chỉ rõ
về nguồn gốc.

Tác giả luận văn


Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

ii


Mục lục

1. Mở đầu

i

2. Tổng quan tài liệu

3

2.1 Lịch sử về bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ (RHD)

3

2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh RHD trong và ngoài nớc.

5

2.3 Sơ lợc về tình hình chăn nuôi thỏ ở Việt Nam

7

2.4 Virus học bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ


3. Nội dung, nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu

45

3.1 Quy trình sản xuất vacxin

45

3.2 Nội dung nghiên cứu

46

3.3 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

46

3.4 Phơng pháp nghiên cứu

47

4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

52

4.1 Kết quả nghiên cứu về quy trình sản xuất vacxin

52

4.2 Phần kết quả nghiên cứu về kiểm nghiệm vacxin


4.2.7 Kết quả kiểm tra diễn biến hiệu giá kháng thể kháng virus RHD trong huyết
thanh thỏ bố mẹ đ đợc tiêm vacxin RHD

75

5. Kết luận

79

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

iv


Danh mục các chữ viết tắt
AND

: Acid Deoxyribonucleic

ARN

: Acid Ribonucleic

CADN

: Complementary AND
(Phân tử AND bổ sung)

EBHS


: Rabbit haemorrhagic Disease
(Bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ)

RHDV

: Rabbit haemorrhagic Disease Virus
(Virus gây bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ)

RT-PCR

: Reserse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction
(Phản ứng chuỗi polymerase phiên m ngợc)

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

v


Danh mục bảng
Bảng 2.1 Hệ thống phân loại virus

17

Bảng 2.2 Các đặc điểm quyết định tính sinh miễn dịch

21

Bảng 4.1 Thời gian chết của thỏ thí nghiệm bị gây nhiễm virus RHD ở
các độ pha lo ng virus khác nhau

Bảng 4.8 Kết quả bệnh tích thỏ đối chứng chết sau khi công cờng
độc virus RHD

60

Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể thụ động kháng RHDV
trong huyết thanh của 3 nhóm thỏ con

61

Bảng 4.10 Diễn biến hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của thỏ (2
tháng tuổi) sau khi tiêm vacxin RHD ở các liều tiêm khác nhau

64

Bảng 4.11 Kết quả xác định đờng tiêm phòng có hiệu quả của vacxin
RHD ( dới da cổ hoặc bắp đùi )

67

Bảng 4.12 Kết quả khảo sát diễn biến hiệu giá kháng thể ở thỏ thịt ( 2
tháng tuổi )sau khi tiêm vacxin RHD

70

Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra diễn biến hiệu giá kháng thể kháng virus
trong huyết thanh của thỏ bố mẹ ( 7,5 tháng tuổi ) đợc tiêm
vacxin RHD

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------


69

Hình 4.4 Diễn biến hiệu giá kháng thể trung bình của thỏ thịt đợc
tiêm vacxin RHD đầu tiên lúc 2 tháng tuổi .

74

Hình 4.5 Diễn biến hiệu giá kháng thể trung bình của thỏ bố mẹ đợc
tiêm vacxin RHD

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

78

vii


1. Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ (Rabbit Haemorrhagic Disease
RHD) là một bệnh gây chết cấp tính và truyền nhiễm cao ở thỏ nuôi cũng nh
thỏ hoang dại, nguyên nhân gây ra bởi Calicivirus[48]. Bệnh xuất hiện đầu
tiên ở Trung Quốc vào năm 1984[42] và đến nay, bệnh có ở hầu hết các châu
lục ở các nớc có nghề nuôi thỏ phát triển và gây thiệt hại rất lớn. Sự bùng nổ
dịch đ đợc ghi nhận ở Trung Mỹ (Mexico và Cuba), các Tiểu Vơng Quốc
ả Rập và Tây Bắc Phi. Năm 2000 và 2001, ba vụ bùng nổ dịch độc lập đ diễn
ra ở Mỹ[48].

bệnh xuất huyết truyền nhiễm ở thỏ theo công nghệ sản xuất vacxin hiện hành
trên thế giới, là loại vacxin vô hoạt, virus giống độc đợc gây nhiễm cho thỏ
sau đó chọn thời điểm thích hợp giết thỏ, thu hoạch tổ chức gan, thận để sản
xuất vacxin[11].
Đây là loại vacxin đợc sản xuất và đ bớc đầu sử dụng để tiêm phòng
cho thỏ nuôi tập trung ở các địa phơng có hiệu quả tốt.
Vacxin xuất huyết truyền nhiễm thỏ là loại vacxin mới đợc nghiên cứu
sản xuất ở trong nớc trong một thời gian tơng đối ngắn cho nên có một số
vấn đề về sử dụng vacxin cha đợc hoàn thiện vì vậy chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: Khảo sát các chỉ tiêu an toàn v hiệu lực của vacxin phòng
bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Khảo sát lại chất lợng vacxin thông qua các chỉ tiêu vô trùng, an toàn,
hiệu lực, trong đó tập trung vào việc xác định độ dài miễn dịch trên cơ sở
xác định hiệu giá kháng thể của thỏ sau khi đợc tiêm phòng vacxin.
Xây dựng lịch tiêm phòng thích hợp cho thỏ các đối tợng.

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

2


2. tổng quan tàI liệu

2.1 lịch sử về bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ (RHD)

Bệnh xuất huyết truyền nhiễm thỏ (gọi tắt là RHD) đợc nhắc đến đầu
tiên ở Trung Quốc năm 1984[42]. Tuy nhiên, bệnh này đợc phát hiện từ một
lô thỏ nhập khẩu vào Trung Quốc từ Châu Âu và đến giờ ngời ta vẫn cho

* ở Châu Phi và ấn độ Dơng: Cameroon, Hy Lạp, Libya, Reunion
Island, Tunisia, Zaire.
* Ngoài ra, bệnh đ từng xuất hiện ở Mỹ, Mexico, Cuba và ở Bolivia
ngời ta nghi ngờ là đ có bệnh nhng cha đợc xác nhận chắc chắn[29].
RHD cũng có thể có ở nhiều nớc khác nơi mà các thông tin chính thức
về nó cha đợc công bố cho các tổ chức quốc tế nh OIE.
Bệnh RHD lan truyền nhanh trên một diện rộng ở hầu khắp các nớc và
hậu quả của bệnh này đối với loài thỏ trở nên rất nghiêm trọng và tàn khốc.
RHD đ giết hại đến 95% số thỏ ở các nớc có bệnh, điển hình nhất là ở
Australia.
ở Châu Âu, bệnh thờng xuất hiện với chu kỳ 2 năm một lần. Lớp thỏ
non từ 5 đến 8 tuần tuổi đ nhiễm virus thờng không chết bởi bệnh này,
ngợc lại, trong chúng xuất hiện kháng thể do đó, chúng có khả năng miễn
dịch với bệnh này. Những con thỏ này sống sót và trở thành thế hệ thỏ bố mẹ
trong vòng một năm tiếp theo đó. Kháng thể từ thỏ bố mẹ có thể truyền sang
cho thế hệ thỏ con. Tuy nhiên, miễn dịch này thờng không kéo dài trong
vòng 12 tuần sau đó. Vì vậy, thế hệ thỏ con tiếp theo trở nên dễ nhiễm bệnh và
dịch RHD lại tái bùng phát[29].
* Tình trạng suy giảm về số lợng thỏ trên thế giới.
Tuy thỏ có số lợng lớn nhất ở Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha nhng số
lợng thỏ cũng giảm mạnh vào thế kỷ 20. Ước tính chung số lợng thỏ ở
Ibeian Peninsula hiện nay giảm đi 5% so với số lợng thỏ 50 năm về trớc.

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

4


Tơng tự nh vậy, ngời ta ớc tính rằng chỉ trong vòng 30 năm trở lại đây số
lợng thỏ đ giảm mạnh, đặc biệt ở Tây Ban Nha số lợng thỏ giảm tới 80%.


chống Calicivirus ở thỏ. Một năm sau đó, CONCOM đ gây qũy cho các nhà
virus học của AAHL để nghiên cứu vacxin chống bệnh này ở Châu Âu. Kết
quả là các nhà khoa học của tổ chức kiểm soát cây trồng và động vật đến từ
miền Nam Australia cũng đ

bắt tay vào nghiên cứu về bản chất của

Calicivirus ở thỏ.
Các nghiên cứu ban đầu này đ là nền tảng cho nghiên cứu tổng thể về
Calicivirus ở thỏ của AAHL. Dự án nghiên cứu này đợc chính thức thực hiện từ
tháng 7 năm 1991 và kéo dài trong vòng 3 năm với tổng ngân sách cho dự án là
khoảng 750.000 USD. Giống Calicivirus ở thỏ đợc nhập về AAHL từ Cộng hoà
Xéc vào năm 1991. Trớc khi đợc đa vào nghiên cứu, các nguyên liệu nhập
khẩu đ đợc kiểm tra kỹ lỡng và đảm bảo trong chúng không chứa bất kỳ một
tác nhân gây hại nào khác để có thể đem lại kết quả nghiên cứu chính xác[29].
Calicivirus dùng trong nghiên cứu đợc lấy từ gan của những con thỏ
nhiễm bệnh. Nghiên cứu này đợc tiến hành với một nhóm thỏ đ phát bệnh
tại AAHL. Mục tiêu chính của dự án này là nhằm phát triển các thí nghiệm để
giải đáp các vấn đề sau:
- Mức độ ảnh hởng của virus đến thỏ ở các lứa tuổi khác nhau nh thế
nào?
- Liệu các thỏ ở Australia và NewZealand đ từng bị nhiễm các loại
virus tơng tự cha và cơ thể chúng đ có kháng thể với các loại virus đó
cha?
- Thỏ nhà hay thỏ hoang d dễ cảm nhiễm với RHD hơn.
Nghiên cứu này đ đa ra các kết luận sau:
- Thỏ ở độ tuổi 5-8 tuần tuổi ít nhiễm virus hơn thỏ trởng thành, tuy
nhiên số virus đ nhiễm vào thỏ ở lứa tuổi này cũng đủ để giết chết thỏ khi thỏ
trởng thành.

làm nái nền lai với giống thỏ ngoại, nâng cao năng suất thịt, lông, da và dễ
nuôi[14].

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

7


2.3.1.2 Giống thỏ ngoại
- Thỏ NewZealand White: Giống thỏ này có nguồn gốc từ New
Zealand, đợc nuôi phổ biến ở Châu Âu, Châu Mỹ, đợc nhập vào Việt Nam
từ Hungary năm 1978 và 2000, thuộc giống thỏ tầm trung, mắn đẻ, sinh
trởng nhanh, thành thục sớm, nhiều thịt, lông dày, trắng tuyền, mắt hồng,
khối lợng trởng thành từ 5-5,5kg/con. Giống thỏ này thích ứng tốt với điều
kiện chăn nuôi gia đình ở Việt Nam.
- Thỏ Panon: Nhập vào Việt nam năm 2000 từ Hungary, là một dòng
của giống NewZealand, đợc chọn lọc theo tăng trọng lợng và khối lợng
trởng thành. Vì vậy, ngoại hình giống NewZealand nhng tăng trọng và khối
lợng trởng thành cao 5,5-6,2 kg/con.
- Thỏ California: Nguồn gốc từ Mỹ, đợc tạo thành do lai giữa thỏ
Chinchila, thỏ Nga và New Zealand, nhập vào Việt Nam năm 1978 và năm
2000, là giống thỏ cho thịt, khối lợng trung bình 4,5 5 kg, chân ngắn hơn
thỏ New Zealand, lông trắng nhng tai, mũi, bốn chân và đuôi có điểm màu
đen, vào mùa đông lớp lông đen sẫm hơn và nhạt dần vào mùa hè. Giống thỏ
này có khả năng sinh sản tơng tự thỏ New Zealand, giống này cũng đợc
nuôi nhiều ở Việt Nam[3].
- Thỏ lai: Cho thỏ đực ngoại New Zealand, Panon và California lai với
thỏ cái Đen, Xám và thỏ cỏ cho con lai F1, F2 sức tăng trọng cao hơn thỏ nội
25 30% và sinh sản cao hơn 15-20%. Con lai thích ứng rất tốt với điều kiện
chăn nuôi gia đình.

vật chất khô) khoảng 50-55%, chất xơ trong khẩu phần 12-14%. Trong chăn
nuôi gia đình, tỷ lệ này còn cao hơn nhiều tới 65-80%. Chăn nuôi thỏ vốn đầu
t ban đầu thấp, chuồng trại có thể tận dụng các vật liệu sẵn có, rẻ tiền để làm.
Chi phí để mua con giống ban đầu ít hơn nhiều so với các gia súc khác, phù
hợp với khả năng của nhiều gia đình.

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

9


Ngoài ra, chăn nuôi thỏ không mất nhiều thời gian, chủ yếu tận dụng
lao động phụ (cụ già, cháu nhỏ,...) góp phần giải quyết công ăn việc làm, tăng
thu nhập trong gia đình.
Thỏ sinh sản và phát triển nhanh, vòng đời sản xuất của thỏ ngắn (nuôi
3-3,5 tháng là giết thịt; 5-6 tháng bắt đầu sinh sản) nên thu hồi vốn nhanh thịt
và da thỏ có giá trị trong tiêu dùng và xuất khẩu. Chăn nuôi thỏ có tác dụng
tốt trong việc thực hiện mô hình VAC trong kinh tế hộ gia đình. Thịt thỏ
cân đối và giàu chất dinh dỡng hơn các loại thịt gia súc khác. Hàm lợng
đạm cao 21% (thịt bò 17%, thịt lợn 15%, thịt gà 21%), mỡ thấp: 10% (gà:
17%, bò: 25%, lợn: 29,5%), giàu chất khoáng: 1,2% (thịt bò: 0,8%, thịt lợn:
0,6%), hàm lợng Cholesteron rất thấp nên thịt thỏ là loại thực phẩm điều
dỡng đợc bệnh tim mạch, đặc biệt không có bệnh truyền nhiễm nào của
thỏ lây sang ngời.
ở Việt nam hiện nay do số lợng thỏ có hạn nên thịt thỏ mới chỉ để tiêu
dùng trong nớc nhng trong tơng lai chúng ta có thể chăn nuôi thỏ để xuất
khẩu vì thị trờng tiêu thụ là rất lớn.
Ngoài ra thỏ là một loại gia súc rất mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh
nên nó đợc dùng nhiều làm động vật thí nghiệm, động vật kiểm nghiệm
thuốc và chế vacxin trong y học, thú y[3].

chất, virus phải kí sinh nội tế bào rồi sử dụng nguyên liệu và các cơ quan tử
của tế bào ký chủ để thực hiện quá trình sinh sản. Từ một virus ban đầu xâm

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

11


nhập vào tế bào, sau một thời gian ngắn có hàng tỷ hạt virus mới đợc sinh
ra. Trong quá trình này, virus tổng hợp các thành phần của chúng. ở một số
nơi trong tế bào, sau đó lắp ráp thành các hạt mới. Vì quá trình sinh sản
nhanh và theo lối công nghiệp hoá nh vậy nên ngời ta gọi quá trình này là
sự nhân lên của virus.
Quá trình nhân lên bắt đầu từ lúc hấp thụ lên bề mặt tế bào cho đến lúc
virus thành thục chui ra khỏi tế bào.
Toàn bộ thời gian này chia làm 5 giai đoạn:
2.4.2.1 Giai đoạn hấp thụ lên tế bào
Sau khi xâm nhập vào cơ thể kí chủ, virus theo máu hoặc dịch tiết đi
lang thang khắp cơ thể đến các gian chất xung quanh tế bào, do kích thớc
nhỏ nên chúng luôn chuyển động Brown và va chạm vào mặt tế bào. Nếu gặp
những tế bào mà chúng thích ứng, trên bề mặt tế bào có những receptor phù
hợp, virus sẽ hấp thụ lên tế bào đây là quá trình tơng tác đặc hiệu giữa thụ
thể của virus và thụ thể của tế bào thích ứng (nh âm bản với dơng bản).
Điều này giải thích tại sao mỗi loại virus chỉ thích ứng với một lọai tế bào
nhất định.
2.4.2.2 Giai đoạn xâm nhập vào tế bào
Tuỳ theo loại virus mà có những cơ chế xâm nhập khác nhau. Các virus
gây bệnh ở động vật, sau khi virus hấp thụ lên bề mặt của tế bào, tế bào mọc
chân giả bao vây virus rồi đa virus vào trong tế bào hoặc ẩn bào.
Sau khi vào tế bào, virus không tự lột đợc vỏ capxit nhng tế bào lại

* Giai đoạn tổng hợp protein sớm.
Thông tin di truyền từ axit nucleic virus đợc ARNtt chuyển sang
riboxom có trong nguyên sinh chất của tế bào, quá trình sinh tổng hợp protein

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

13


diễn ra tại đây và sinh ra 2 loại protein sớm, gọi là sớm bởi vì nó xuất hiện đầu
tiên trong quá trình tái tạo virus gồm:
- Protein ức chế: Làm nhiệm vụ kìm h m và đình chỉ mọi quá trình tổng
hợp của tế bào chủ.
- Protein hoạt hoá: đó là enzimn ARN polymeraza có tác dụng xúc tác
trong quá trình tổng hợp axit nucleic virus.
* Giai đoạn tổng hợp axit nucleic nhân virus.
Virus chứa ARN quá trình này diễn ra trong nhân nguyên sinh chất tế
bào chủ.
Sự tổng hợp ARN dới xúc tác của ARN polymeraza, ARN của virus
đợc làm khuôn để tổng hợp lên sợi mới. Sợi này đợc gọi là sợi âm còn sợi
cũ là sợi dơng, 2 sợi này xoắn lại gọi là ARN dạng tái tạo.
Từ ARN tái tạo, các sợi ARN dơng mới đợc tạo thành.
Những sợi ARN dơng này đợc gọi là ARN dạng trung gian, nó có
nhiệm vụ :
- Làm nhiệm vụ thông tin để tổng hợp lên protein cấu trúc.
- Làm khuôn để tổng hợp các ARN mới.
- Đó chính là nhân của virus mới.
* Giai đoạn tổng hợp protein cấu trúc (protein muộn).
Gọi là protein muộn vì đây là bớc cuối cùng của quá trình tổng hợp
các thành phần của virus, protein cấu trúc đợc sinh tổng hợp sau khi đ tổng

Nói chung các virus cờng độc gây bệnh đều chui ra khỏi tế bào theo
phơng thức này. Điều này giải thích tại sao bệnh do virus gây ra thờng phá
hủy các tổ chức nó thích ứng rất nhanh chóng.
- Cơ chế từ từ: Virus tiết enzim chọc thủng một lỗ ở màng tế bào rồi
theo đó từ từ chui ra. Theo cơ chế này, tế bào nhiễm virus chỉ bị thơng nhẹ,
các chức năng cơ bản của tế bào vẫn còn.

Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc nụng nghip -------------------------

15


Các virus nhợc độc thờng ra khỏi tế bào theo phơng thức này.
Ngoài hai cơ chế trên, một số loại virus có thể truyền từ tế bào những
con bị nhiễm sang tế bào lành mà không cần chui ra bên ngoài do tế bào
nhiễm và tế bào lành hình thành cầu nối nguyên sinh chất. Cầu nối nh một
ống dẫn và virus theo đó truyền qua[8].
Tóm lại virus nhân lên trong tế bào chất. Bên trong tế bào bị cảm nhiễm
thờng thấy ít nhất hai loại ARN một sợi đặc hiệu của virus. ARN có kích
thớc genome có cơ năng mRNA của protein phi cấu trúc, còn ARN nhỏ, kích
thớc dới genome là mRNA của protein capsid.
Trong tế bào nhận thấy có 2 loại ARN 2 sợi và các ARN có những bộ
phận đề kháng với enzym phân giải ARN (có lẽ là các thể trung gian đang tái
sản). Ngoài ra còn có hai loại ARN một sợi có kích thớc trung gian (4,8-4,2
kb) tồn tại nhng cơ năng của chúng còn cha rõ. Tất cả các ARN virus này
đều có chuỗi poly-A. Polypeptid của capsid là protein chủ yếu đợc tổng hợp,
tiếp theo là một số polypeptid nào đó đợc tổng hợp nhng mối quan hệ giữa
các tiền chất này với sản phẩm cuối cùng thì cha đợc rõ[17].
Virion thành thục trong tế bào chất ký chủ. Virus trởng thành đợc
giải phóng sau khi làm tan tế bào [26].


San Miguel sea lion
virus virus s tử biển

Bệnh

12

tử biển, hải
cẩu...), lợn, cá

San Miguel

Hình thành bọng
nớc, sảy thai.
Viêm đờng hô

Feline calicivirus
Calicivirus mèo

hấp dới, loét
1

Chó, mèo

trong khoang
miệng, viêm lỡi,
tiêu chảy.
Hình thành bọng