BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY LÁ DỨA
(Pandanus amaryllifolius. Roxb)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG

NGUYỄN TƯỜNG QUYÊN

BỘ MÔN SINH – KHOA KHTN

MSSV: 3092367
SINH HỌC K.35

Cần Thơ, 2012


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Ts. Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý

Người hướng dẫn khoa học

Tác giả luận văn

Ts. Đái Thị Xuân Trang

Nguyễn Tường Quyên

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................i
LỜI BẢN QUYỀN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC HÌNH..........................................................................................................v
MỤC LỤC BẢNG........................................................................................................vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
TÓM TẮT .................................................................................................................. viii
PHẦN 1. GIỚI THIỆU ................................................................................................1
PHẦN 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1. Sơ lược về chất chống oxy hóa ...........................................................................3
2.1.1. Stress oxy hóa ...............................................................................................3
2.1.2. Khái niệm về chất chống oxy hóa................................................................4
2.2. Đại cương về cây Lá Dứa....................................................................................7
2.2.1. Khóa phân loại ..............................................................................................7
2.2.2. Mô tả cây.......................................................................................................7
2.2.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây .......................................................8
2.3. Các nghiên cứu về cây Lá Dứa ...........................................................................8
2.4. Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa .................................10
2.4.1. Bệnh tiểu đường..........................................................................................10

4.3.3. Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết ethyl acetate lá.....................22
4.3.4. Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết n-butanol lá..........................22
4.3.5. Đánh giá hàm lượng chất chống oxy hóa có trong cao petroleum ether,
ethyl acetate và n-butanol.............................................................................................23
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................27
5.1. Kết luận ..............................................................................................................27
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................27

iv


MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1

Cây Lá Dứa.....................................................................................7

Hình 3.1

Quy trình chiết các cao thô ..........................................................17

Hình 4.1

Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số
in vitro của Trolox........................................................................20

Hình 4.2

Phần trăm lượng ROS còn lại sau phản ứng với chất chống oxy
hóa có trong các cao chiết lá cây Lá Dứa ...................................25

PKC: Protein kinase C
AR: Aldose reductase
EDTA: Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate
HA: Huyết áp
OD: Mật độ quang phổ
ROS: Reactive Oxygen Species
TAS: Total Antioxidant Status
TBA: Acid thiobarbituric
TBA-RS: Thiobarbituric acid reactive substances
Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

vii


TÓM TẮT
Stress oxy hóa là nguyên nhân và tham gia vào sự phát triển của nhiều bệnh nguy
hiểm như tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa. Các dược liệu dân gian được
nghiên cứu khả năng chống oxy hóa để tìm ra một phương pháp chữa bệnh an toàn,
hiệu quả và chi phí thấp. Đề tài “ Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá
cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius. Roxb)” được thực hiện nhằn đánh giá khả năng
chống oxy hóa của cây Lá Dứa. Khảo sát khả năng chống oxy hóa được thực hiện
bằng phương pháp TAS (Total Antioxidant Status). Cao petroleum ether lá , cao etyl
acetate lá và cao n-butanol lá được tách từ cao ethanol lá. Sự làm sach gốc tự do của
các cao chiết được khảo sát ở các nồng độ 2 mg/ml; 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25
mg/ml; 0,125 mg/ml; 0 mg/ml và kết quả thu được sau khi đo ở bước sóng 532 nm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao petroleum ether, cao etyl acetate và cao n-butanol
đều có khả năng chống oxy hóa cao hơn cao ethanol. Khả năng chống oxy hóa của
ba loại cao lá giảm dần theo thứ tự cao n-butanol – cao petroleum ether – cao etyl
acetate.


cứu cho thấy tăng cường khả năng chống oxy hóa tự nhiên trong cơ thể hay bổ sung
chất chống oxy hóa qua chế độ ăn uống có thể làm giảm nguy cơ của các bệnh mãn
tính và ngăn chặn tiến triển của bệnh (Pal et al., 2011). Hợp chất phenol và
polyphenol có nguồn gốc thực vật, chẳng hạn như flavonoid đã được chứng minh
làm sạch các gốc oxy hóa. Tuy nhiên, hàm lượng các hợp chất polyphenol trong rễ
và vỏ của hệ thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới chưa được nghiên cứu nhiều (Pal et
al., 2011).

x


Ở nước ta, cây Lá Dứa là một loại cây được trồng hoặc mọc hoang dại có
sinh khối rất lớn. Tuy nhiên, cây Lá Dứa chỉ được ứng dụng chủ yếu trong lĩnh vực
thực phẩm như tạo hương, tạo màu … Ngoài ra, trong dân gian còn dùng lá dứa nấu
nước uống như một vị thuốc nam để chữa trị các bệnh như lợi tiểu, hạ đường
huyết… Tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học nào chứng minh những tác dụng
chữa bệnh của cây Lá Dứa. Do đó, đề tài được thực hiện nhằm khai thác tiềm năng
chữa bệnh của cây Lá Dứa và quan trọng hơn góp phần tìm ra cách thức ức chế
nguyên nhân của một số bệnh như tiểu đường, tim mạch … những bệnh đang phát
triển với tốc độ cao trong xã hội hiện đại.
Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá
Dứa. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết Lá Dứa được đánh giá in vitro bằng
phương pháp TAS (Total Antioxidant Status).
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm
- Trích các chất bằng dung môi ethanol 99% từ cây Lá Dứa.
- Tách cao petroleum ether, ethyl acetate và n-butanol từ cao ethanol.
- Sử dụng phương pháp TAS để xác định khả năng chống oxy hóa của cây Lá
Dứa in vitro.

xi



Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây nhiều tổn hại cho cơ thể nhất
là ROS. Oxy là nguyên tố không thể thiếu để đảm bảo sự sống, mọi tế bào đều cần
oxy để chuyển hóa chất dinh dưỡng thành năng lượng. Oxy mà con người hít thở
hằng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng là trở thành gốc tự do. ROS luôn
được sinh ra trong cơ thể và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể. ROS có vai trò
trong biểu hiện gen và vận chuyển ion. Tuy vậy, gốc tự do cũng ảnh hưởng xấu đến
cơ thể khi số lượng tăng lên quá nhiều.
Chúng ta có thể thấy rõ tác hại này qua sự gỉ sét hay còn gọi là sự oxy hóa.
Những quá trình tương tự như vậy cũng đang xảy ra trong co thể, nó luôn tạo ra gốc
tự do. Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu trong cơ
thể tiêu diệt hay là hiện tượng hô hấp trong tế bào hoặc hiện tượng giải độc ở gan
đều là các hoạt động sinh ra gốc tự do. Các loại phản ứng oxy hóa như superoxide
(O2), hydroxyl radical (HO). Các gốc tự do được hình thành bởi quá trình giảm
electron của phân tử oxy.
ROS có thể được phát sinh trong quá trình chiếu xạ ánh sáng tia cực tím, tia
X và tia gamma, trong các phản ứng xúc tác kim loại, các chất ô nhiễm trong không
khí, được sản xuất bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào trong quá trình viêm
nhiễm và là sản phẩm của ty thể xúc tác phản ứng vận chuyển điện tử, là sản phẩm
của những căng thẳng mệt mỏi, thuốc lá, dược phẩm, những thói quen ăn uống
không khoa học , thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine
(Candenas, 1989; Halliwell, 1991; Armstrong, 2002 ).
Trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không đủ để gây hại.
Vì bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa vô hiệu hóa các
gốc tự do có hại.
2.1.2. Khái niệm về chất chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản
hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể
(Jovanovic and Simic, 2000; Lachman et al, 2000; Singh and Rajini, 2004). Dựa

và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde diamutase, glutathion peroxydase). Các

xiv


chất chống oxy hóa ngoại sinh là các phân tử nhỏ được đưa vào cơ thể, bao gồm
vitamin E, Vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki et al., 1995;
Pincemail et al., 1998; Lachman et al., 2000; Vanaant et al., 2004).
Hợp chất chống oxy hóa trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng như một
yếu tố bảo vệ sức khỏe. Bằng chứng khoa học cho thấy chất chống oxy hóa làm
giảm nguy cơ các bệnh mãn tính như ung thư và bệnh tim (Prakash et al, 2000;
Deshmukh, 2009), viêm và lão hóa (Uttara et al, 2009). Nguồn chính của chất chống
oxy hóa tự nhiên là ngũ cốc, trái cây và rau quả. Thực phẩm chống oxy hóa có
nguồn gốc thực vật như vitamin C, vitamin E, caroten, axit phenolic, phytate và
estrogen thực vật đã được chứng minh có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh
(Prakash et al., 2000).
Đặc điểm chính của chất chống oxy hóa là khả năng phục hồi các gốc tự do.
Có một số nghiên cứu cho thấy rằng các chất chống oxy hóa trong trái cây, chè, rau
quả và rượu vang làm giảm tỉ lệ mắc các bệnh mãn tính như bệnh tim và một số
bệnh ung thư (Prakash et al, 2000). Thực vật là nguồn chống oxy hóa tiềm năng của
tự nhiên. Thực vật có thể chống lại ROS nhờ tạo thành các hợp chất chống oxy hóa.
Như vậy, chất chống oxy hóa không chỉ bảo vệ thực phẩm mà còn bảo vệ các tế bào
chống lại thiệt hại do oxy hóa (Zin et al., 2002).
Ngày nay các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên được quan tâm sử dụng rộng
rãi trên thế giới vì tính hiệu quả, an toàn và ít bị ô nhiễm hơn các sản phẩm nhân tạo.
Vì vậy, việc điều tra và xác định các chất chống oxy hóa tự nhiên từ thực vật là quan
trọng và cần thiết (Zin et al., 2002).

xv


2.4. Các nghiên cứu về cây Lá Dứa
Hiện nay trong công nghiệp thực phẩm lá dứa thơm được dùng để tạo mùi
thơm cho gạo, tạo hương thơm nếp cho các loại bánh kẹo và các loại nước uống giải
khát... (Buttery et al., 1983). Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hàm
lượng acid amin có trong lá dứa như 2-acetyl-1-pyrrolin gồm có proline và ornithine
được sử dụng trong thực phẩm để làm các loại bánh (Weenen et al., 1997).
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trên rễ cây Lá Dứa (Heimsch et al.,
2008). Những nghiên cứu đã chứng minh rằng gốc rễ và thân rễ của cây Lá Dứa có
hiệu quả trong điều trị bệnh tiểu đường trên chuột (Phongboonrod et al., 1976).
Theo sách y học của Philippine, rễ cây Lá Dứa được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu
đường (Michael, 1980).
Một số nghiên cứu đã chứng minh được hợp chất 4-hydroxybenzoic acid có
tác dụng làm hạ đường huyết trên chuột (Peungvicha et al., 1998). Hợp chất này chủ
yếu tập trung ở rễ cây Lá Dứa.
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khảo sát các thành phần hóa học khác có trong lá
dứa như hợp chất alkaloids, thành phần có trong hợp chất này là
pandamarilactonine-A, pandanmarilactone-1, pandanamine, pandamarilactonineB,norpandamarilactonine A và norpandamarilactonine-B (Takayama et al., 2001).
Từ rễ của cây Lá Dứa hợp chất alkaloids mới tiếp tục nghiên cứu và đặt tên
pandamarilactonine-H (Mario et al., 2010). Nhiều hợp chất khác có trong lá dứa
được nghiên cứu như 2-acetyl-1-pyrroline (Buttery et al., 1983; Kantilal et al.,

xvii


2009), phenol, sterol và terpenoit (Mohsin et al., 2008), palmitic acid, linoleic acid,
steric acid (Chong et al., 2010).
Rễ cây Lá Dứa chứa các hợp chất phân cực, tan đều trong nước có khả năng
làm giảm đường huyết. Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết
insulin từ tuyến tụy (Peungvicha et al., 1996; Limviwakill et al., 2001).
Dịch chiết lá dứa có khả năng ức chế khối u (Meyer et al., 1982). Theo y học

gian của các tế bào β tại các tiểu đảo ở tuyến tụy (đảo tụy), dẫn đến tình trạng thiếu
insulin tuyệt đối (Zimmet et al., 2001). Những người bị tiểu đường tuýp 1 phải sử
dụng insulin ngoại sinh để ngăn chặn sự phát triển của các thể keto (ketoacidosis)
(Zimmet., 2001). Bệnh tiểu đường tuýp 1 chiếm tỉ lệ khoảng 5- 10% trong tổng số
người mắc bệnh tiểu đường. Bệnh tiểu đường tuýp 1 thường được phát hiện trước 40
tuổi . Đa số các trường hợp được chẩn đoán bệnh tiểu đường tuýp 1 thường là người
có thể trạng gầy. Người bị bệnh tiểu đường sẽ có đời sống phụ thuộc insulin hoàn
toàn (Nguyễn Thị Bay, 2007).
Bệnh tiểu đường tuýp 2 được đặc trưng bởi sự kháng insulin (Zimmet et al.,
2001) nghĩa là đối với tiểu đường tuýp 2 insulin vẫn tiết bình thường nhưng cơ thể
không sử dụng được. Những người bị bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin
ngoại sinh (Zimmet et al., 2001). Phần lớn người bị bệnh tiểu đường thuộc tuýp 2
chiếm khoảng 90% trong tổng số người mắc bệnh (Zimmet et al., 2001) và thường
được phát hiện sau 40 tuổi.
2.5.1.2 Biến chứng bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường thường có những biến chứng sau: biến chứng tim, hoại tử do
bệnh tiểu đường, hôn mê, biến chứng thần kinh, biến chứng mắt, biến chứng thận,
biến chứng răng, biến chứng ngoài da….

xix


2.5.1.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tiểu đường
Stress oxy hóa được xem là nguyên nhân chính của bệnh tiểu đường. Tăng
đường huyết có thể gây ra stress oxy hóa thông qua hình thành AVEs (Advanced
Glycation End product- AGEs), gia tăng sự hoạt hóa protein kinase C (PKC) và gia
tăng sự vận chuyển các dẫn xuất axit amin của đường hexose (Tripathi and Chandra,
2009).
Khi đường huyết tăng các gốc superoxide trong chuỗi dẫn truyền điện tử ở ty
thể tăng là nguyên nhân gây ra stress oxy hóa. Sự hình thành superoxide và tiếp theo

mức huyết áp tối ưu dù nhỏ thì cũng làm gia tăng biến cố tim mạch (Chobanian et
al, 2003; Mancia et al., 2007). Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác hại của tăng
huyết áp trên các hệ thống tim mạch, thận, não. Cao huyết áp là yếu tố nguy cơ
chính gây bệnh tim và đột quỵ và nguy cơ tim mạch tăng gấp đôi với mỗi độ tăng
huyết áp 20/10mmHg HA tâm thu và tâm trương (Lewington et al, 2002).
2.5.2.2 Biến chứng của bệnh tăng huyết áp
Bệnh cao huyết áp thường dẫn đến các biến chứng về tim mạch như cơ tim
phì đại, tai biến mạch máu não, nhũn não, thiếu máu não, hẹp động mạch. Ngoài ra
còn dẫn đến biến chứng về thận như hư màng lọc của các tế bào thận, hẹp động
mạch thận, suy thận…
2.5.2.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp
Nghiên cứu cho thấy, stress oxy hóa là nguyên nhân của bệnh tăng huyết
áp, một yếu tố nguy cơ chính cho tỷ lệ tử vong bệnh tim mạch (Rodrigo et al.,
2007). ROS có ảnh hưởng đến mạch máu và sự phát triển của tăng huyết áp
(Lassègue, Griendling, 2004; Touyz, Schiffrin, 2004).
Stress oxy hoá có thể làm rối loạn chức năng nội mô và là hậu quả của tăng
huyết áp (John, Schmieder, 2003). Nghiên cứu cho thấy, ROS làm tăng huyết áp và
hình thành superoxide trong mạch máu được cải thiện nhờ chất chống oxy hóa ngoại
sinh được nghiên cứu trên mô hình động vật (Chen et al., 2001; Hoagland et al.,
2003) và tăng huyết áp trên người (Duffy et al, 2001; Boshtam M et al., 2002). Một
số nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa và ROS là nguồn gốc của tăng huyết

xxi


áp.Nghiên cứu cho thấy tăng huyết áp thúc đẩy sản xuất của ROS trong não, thận,
mạch máu (Harrison, 2009).

xxii


Vật liệu thí nghiệm là 3 kg lá của cây Lá Dứa được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây
Lá Dứa in vitro
3.2.1.1 Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm lá của cây Lá Dứa
(Pandanus amaryllifolius. Roxb) được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long. Mẫu sau khi thu
dựa vào các đặc điểm hình thái của thực vật như rễ, lá,… và tham khảo tài liệu từ bộ
sách cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2003) để định danh. Mẫu lá của cây Lá
Dứa, chỉ lấy những lá màu xanh bóng, không sử dụng những lá quá non hay quá già.
Mẫu được rửa sạch bằng nước với trọng lượng mẫu tươi là 3 kg. Mẫu cây
được cắt nhỏ, phơi khô cho đến khi trọng lượng không đổi và cân lại lần nữa để xác
định trọng lượng mẫu khô. Độ ẩm của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng
tươi và trọng lượng khô và được tính theo công thức sau:

Trọng lượng tươi – Trọng lượng khô
 100 %
Trọng lượng tươi

Mẫu sau khi phơi cho vào túi nylon sạch, ghi nhãn, bảo quản ở nhiệt độ
phòng để sử dụng cho nghiên cứu.
Lá của cây Lá Dứa khô (250g) được ngâm trong dung môi ethanol 99% trong
7 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 7 ngày phần nước ngâm mẫu được lọc và cô cạn bằng
hệ thống máy cô quay để loại bỏ dung môi ethanol.
Quy trình chiết cao được trình bày như trong Hình 3.1.

xxiv