BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
PHẠM THỊ LAN HƯƠNG ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN) TRONG MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI
ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ
KHĨA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. BS. ĐỖ QUANG MINH
III.3.2. Ion 13
III.3.3. Carbohydrate 13
III.3.4. Amino acid 14
III.3.5. Chất bắt giữ kim loại nặng 15
III.3.6. Chất chống oxi hóa 15
III.3.7. Kháng sinh 16
III.3.8. Protein/Các đại phân tử 16
III.3.9. Ammonium 17
IV. THỂ TÍCH Ủ 17
V. KHÔNG KHÍ 18
VI. ALBUMIN HUYẾT THANH BÒ……… 18
VI.1. BSA 18
VI.2. BSA và sự tổng hợp BSA trong cơ thể động vật có vú 19
VI.3. Thành phần amino acid trong BSA 19
VI.4. Đặc tính chức năng của BSA 20
VI.4.1. Tạo bọt 20
VI.4.2. Khả năng đông đặc của BSA 20
VI.4.3. Phối tử kết nối 21
VI.5. Những nghiên cứu về vai trò của BSA trong …. 21
VII. ỨNG DỤNG THỰC TIỄN 23
Vật liệu – Phương pháp
I. ĐỐI TƯNG NGHIÊN CỨU 25
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
III. DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HOÁ CHẤT 25
IV.1. Dụng cụ 25
IV.2. Thiết bò 26
IV.3. Hoá chất 26
IV. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 27
IV.1. Ổn đònh chuột – kích thích buồng trứng – phối 29
IV.2. Mổ chuột – thu nhận phôi 2 tế bào 31
Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, một trong những trung tâm đào tạo và
nghiên cứu hàng đầu trong nước, năm 2003 với đề tài nghiên cứu của Phạm Ngọc Thụy
Vi, đã bước đầu thành công trong nuôi cấy phôi chuột 2 tế bào lên phôi nang tuy nhiên
kết quả vẫn còn thấp và chưa ổn đò 1nh. Kết quả này có thể do rất nhiều nguyên
nhân: điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, chủng chuột …
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng không có môi trường nuôi cấy tối ưu
chung và những phòng thí nghiệm khác nhau có những công thức môi trường khác nhau
để có thể đạt được kết quả nuôi cấy gần với sự phát triển trong cơ thể. Vì vậy với khảo
sát đánh giá trên những thí nghiệm vừa qua cho thấy yếu tố có khả năng ảnh hưởng
cao nhất tới kết quả nuôi cấy là môi trường không phù hợp.
Vì vậy đề tài này được tiến hành với mục tiêu xác đònh nồng độ BSA tối ưu
trong môi trường nuôi cấy phôi chuột từ giai đoạn 2 tế bào lên phôi nang.
Bên cạnh đó, trong thí nghiệm này còn tiến hành khảo sát ảnh hưởng của số
lượng phôi chuột trong một thể tích môi trường nuôi cấy cố đònh lên khả năng phát
triển của phôi chuột 2 tế bào thành phôi nang, và khảo sát điều kiện ổn đònh chuột,
nguồn chuột cũng như vai trò của việc kiểm tra nút nhầy âm đạo trong đánh giá kết
quả thụ tinh.
III. SINH SẢN TRÊN CHUỘT
III.1. Nội tiết sinh sản
Hormone kích thích nang trứng phát triển FSH (follicle stimulating hormone) do
tuyến yên tiết ra kích thích nhóm nang trứng tiếp tục tăng trưởng.
Hormone kích thích rụng trứng LH (Luteinizing hormone) được tuyến yên tiết
ra, phá vỡ sự kiềm hãm phân bào giảm nhiễm, bắt đầu sự phân bào giảm nhiễm đầu
tiên tạo ra thể cực thứ I, sau đó trứng trưởng thành và được phóng thích.
Mặc dù về cơ chế sự rụng trứng vẫn chưa được hiểu rõ, việc trứng được phóng
thích ra khỏi nang trứng là nhờ vào sự tăng kích thích của LH.
III.2.
Sự phát triển và trưởng thành của trứng
[5]
Ở chuột cái 5 ngày tuổi, tất cả trứng ở giai đoạn diplotene (DNA đã nhân đôi)
[13]
Hình 1: Sơ đồ sự phát triển ban đầu của phôi
Thụ tinh: là sự kết hợp của giao tử đực và giao tử cái tạo thành hợp tử và cũng
là mốc bắt đầu sự phát triển của hợp tử.
Sự phân chia: là chuỗi phân bào nguyên nhiễm nhờ đó một tế bào ban đầu
(hợp tử) phân chia thành nhiều tế bào (phôi bào- blastomeres).
Các đặc điểm của sự phát triển phôi ban đầu ở động vật có vú:
− Sự thụ tinh và phân chia sớm xảy ra ở 2 nhánh vòi trứng
− Sự phân chia xảy ra chậm từ 12 – 24 giờ.
− Sự phân chia ban đầu không đồng bộ.
− Bộ gen được hoạt hóa khi hợp tử bắt đầu phân chia. Trứng
Thụ tinh
Hợp tử
Phân chia
Phôi bào
Tinh trùng
Hình 2: Sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh. A: trứng đã thụ tinh B: phôi 2 tế bào
C: phôi dâu -phôi 8 tế bào D: phôi 16 tế bào E: phôi nang
Khó khăn của việc nghiên cứu ở những loài động vật có vú:
Thể cực
Tiền nhân đực và cáiMàng pellucida
Trứng đã được
D
E
− Trứng của chúng nhỏ nhất trong giới động vật (hợp tử của người có kích
thước là 120µm, của chuột khoảng 80µm).
− Số lượng trứng của động vật có vú được tạo ra ít.
− Phôi của động vật có vú phát triển bên trong thay vì bên ngoài cơ thể.
III.6. Các giai đoạn phát triển chính của phôi chuột
[5,8,9]
Giai đoạn tế bào rời (Cleavage): số lượng tế bào trong phôi có thể đếm được dễ
dàng cho tới lúc xảy ra sự kết khối ở giai đoạn 8 tế bào, làm hình dạng tế bào trở nên
mờ nhạt.
Giai đoạn kết khối (Compaction): xảy ra vào 3,5 – 7,5 giờ sau khi bắt đầu chu
kì tế bào thứ 4, tức ở giai đoạn phôi 8 tế bào.
Phân chia tới giai đoạn 16 tế bào: kết thúc chu kì tế bào thứ 4 và bắt đầu chu kì
tế bào thứ 5, diễn ra sự phân bào nguyên nhiễm sau tách khối và kết khối trở lại sau
khi phân bào nguyên nhiễm kết thúc.
Hình thành khoang phôi (Blastocoel): chu kì tế bào thứ 6, biểu thò sớm nhất của
sự chuyên chở chất dòch xảy ra khi phôi tiến gần tới số lượng 32 tế bào và hình thành
không bào chứa đầy dòch lỏng (hoặc 2 không bào phồng to ra và sau đó hợp nhất lại).
IV. QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TRONG ỐNG
NGHIỆM
IV.1. Quy trình giao phối tự nhiên
Chuột cái được ổn đònh theo chu kì sáng tối thường rụng trứng theo chu kì 3-4
ngày, 3-4 giờ sau khi bắt đầu chu kì tối. Chuột đực được ổn đònh trong cùng điều kiện
sẽ giao phối với con cái vào chu kì động dục khoảng giữa chu kì tối. A
B
tức nút nhầy âm đạo. Nút nhầy gồm protein bò đông lại từ dòch tinh trùng của con đực
và có thể được nhìn thấy dễ dàng trong hầu hết các chủng chuột. Nút nhầy âm đạo
thường tan rã khoảng 12-14 giờ sau khi xảy ra sự giao phối. Thông thường, 50% chuột
cái được chọn sẽ phối.
II.1.1. Sự thụ tinh trong cơ thể (in vivo)
Để sự thụ tinh và sự phát triển tiếp theo sau được đồng bộ, thời gian tiêm
hormone cần đảm bảo cho sự thụ tinh xảy ra trước khi rụng trứng- nghóa là trứng vừa
rụng được thụ tinh ngay lập tức, không trùng lấp với thời gian LH nội sinh. Nếu có sự
khác nhau trong tuổi phát triển của phôi là do sự lệch chế độ tiêm thuốc làm kéo dài
thời gian rụng trứng và thời gian giao phối dẫn đến sự không đồng bộ ở phôi thu nhận.
Trứng đã thụ tinh có thể phân biệt với trứng chưa thụ tinh bằng cách quan sát sự xuất
hiện thể cực thứ 2.
Nên tránh sự thụ tinh với trứng đã rụng quá 12 giờ vì sẽ làm tăng hiện tượng tự
phát hoạt tính sinh sản đơn tính của trứng (tức trứng sẽ phân chia giả và sẽ thoái hóa
dần sau đó). Chuột giao phối hiệu quả nếu sử dụng cân đối và không quá thường
xuyên.
II.1.2. Sự thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro)
Phương pháp này có 2 lợi điểm:
Đồng bộ hơn sự thụ tinh trong cơ thể do sự thụ tinh có thể được thiết lập thời
gian chính xác.
Tiến trình có thể tách khỏi chu kì ngày đêm thông thường, vì vậy cho phép sự
thụ tinh của trứng diễn ra theo thời gian thí nghiệm cho phép.
IV.2. Kích thích buồng trứng (superovulation)
Đối với những thí nghiệm cần nhiều phôi giai đoạn trước làm tổ thì phải tiêm
kích dục tố cho chuột cái trước khi cho phối để tăng số lượng trứng rụng.
Hormone kích thích nang trứng phát triển - FSH được thay thế bằng kích dục tố
thu từ huyết thanh ngựa cái mang thai - PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin).
Hormone kích thích rụng trứng - LH được thay bằng kích dục tố màng đệm ở
người - hCG (human chorionic gonadotropin).
Hiệu quả của việc sử dụng kích dục tố gây kích thích buồng trứng ở chuột tuỳ
Hình 4: Sự phát triển và di chuyển của phôi trong vòi trứng
III.4.1. Block (sự kìm hãm) ở giai đoạn 2 tế bào
Đối với phần lớn các chủng chuột, trứng và phôi khi nuôi cấy ở bất cứ giai đoạn
nào trước giai đoạn 2 tế bào thường bò kiềm hãm sự phát triển ở pha G
2
của chu kì tế
bào thứ 2 – điều này được cho là sự block ở giai đoạn phôi 2 tế bào. Dù vậy, vẫn có
một vài chủng chuột có trứng và phôi không bò block ở giai đoạn 2 tế bào. (Trong thí
nghiệm so sánh giữa chủng chuột bò block và không bò block cho thấy khả năng phôi
ngừng phát triển ở giai đoạn 2 tế bào được xác đònh chỉ bởi kiểu gen của giao tử cái và
không liên quan đến kiểu gen của giao tử đực.)
Nếu việc thu nhận phôi từ vòi trứng được trì hoãn cho tới giai đoạn phôi 2 tế
bào muộn (khoảng 48 giờ sau khi tiêm hCG) thì sự phát triển trong ống nghiệm với môi
trường thí nghiệm không bò cản trở. Việc thu nhận phôi ở giai đoạn 2 tế bào muộn rất
quan trọng để có thể có được sự phát triển bình thường của chúng lên phôi nang trong
nuôi cấy. Điều này có thể thực hiện bằng cách thu nhận phôi từ 36 – 40 giờ sau khi
tiêm hCG.
III.4.2. Phôi dâu
Phôi dâu là sự kết hợp thành khối của phôi bào, điều này chỉ mang tính chất mô
tả, có thể bao quát tất cả các giai đoạn trong quá trình phát triển từ khối 8 tế bào tới
giai đoạn 16 hoặc 32 tế bào trước khi tiến lên giai đoạn hình thành khoang phôi. Bằng
cách quan sát sự phát triển của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm suốt thời gian này
người ta có thể phân chia giai đoạn phát triển của chúng từ khi thành phần phôi bào bắt
đầu kết khối ở giai đoạn phôi 8 tế bào, tách khối suốt sự gián phân đến giai đoạn 16 tế
bào và sau đó thì kết khối trở lại. Giai đoạn phôi dâu muộn được quan tâm khi phôi 16
tế bào tới 32 tế bào, khi vẫn chưa tạo khoang hổng (khoảng 84 giờ sau khi tiêm hCG)
và chúng di chuyển xuống ống tử cung chỗ nối liền vòi trứng với tử cung. Khi thu nhận
B
C
D
F
E
phôi và cho những thí nghiệm mà phôi được thao tác trong một thời gian dài bên ngoài
tủ CO
2
.
Gần 20 năm phát triển, đã có một vài thay đổi trong điều kiện nuôi cấy phôi
chuột, sự phát triển môi trường nuôi cấy phôi chuột thế hệ thứ 2 được tiến hành dựa
trên những hiểu biết tốt hơn về yếu tố sinh lý học căn bản, sự trao đổi chất, và cũng đã
có nhiều cải tiến trong kó thuật nuôi cấy phôi.
III.5.2. Các loại môi trường nuôi cấy phôi động vật có vú
Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy phôi động vật có vú thường thuộc 1 trong
3 loại.
Dung dòch muối đơn giản được bổ sung những chất nền năng lượng (KSOM,
Earle’s, CZB, M16, T6).
Môi trường này được hình thành đầu tiên để cung cấp sự phát triển giao tử
những chủng chuột lai nào đó với chủng lai F1 của chúng. Từ những loại môi trường
này người ta đã tạo ra môi trường dòch ống dẫn trứng ở người (HTF). Sau hơn 30 năm
phát triển, việc tạo ra những loại môi trường này có một số thay đổi: môi trường muối
đơn giản thường được bổ sung thêm huyết thanh hoặc với albumin huyết thanh.
Môi trường nuôi cấy mô phức tạp (Ham’s F-10).
Môi trường này có giá trò về mặt thương mại và được thiết kế cho nuôi cấy tế
bào sinh dưỡng (somatic cell). Loại môi trường này phức tạp hơn nhiều, có chứa amino
acid, vitamin, tiền thân nucleic acid, kim loại chuyển tiếp, thường được bổ sung 5-20%
huyết thanh. Tuy nhiên cần chú ý: nó không được thiết kế cho mục đích nuôi cấy phôi.
Môi trường liên tục.
Môi trường này được phát triển gần đây, dựa trên những thay đổi sinh lý của
giai đoạn phôi nang. Những nghiên cứu về việc hấp thu chất dinh dưỡng trong nuôi cấy
phôi sớm cho thấy rõ ràng pyruvate là nguồn năng lượng chính.
Đối với phôi chuột, lactate có thể được sử dụng như nguồn năng lượng ở giai
đoạn 2 tế bào và hoạt động hiệp lực với pyruvate. Đã có những nghiên cứu đối lập với
nhau về nồng độ tối ưu của lactate trong môi trường nuôi cấy phôi chuột phát triển tới
giai đoạn phôi nang. Cross và Brinster cho nồng độ tối ưu là 30mM cho sự phát triển từ
giao tử tới phôi nang. Trong khi có những nghiên cứu khác cho rằng nồng độ tối ưu là
10mM. Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy rằng phôi chuột từ giao tử tới giai đoạn 8
tế bào cần nồng độ lactate cao (20mM), nhưng khi thời gian nuôi cấy kéo dài tới phôi
dâu thì môi trường tối ưu lại có nồng độ lactate thấp hơn.
Điều quan trọng là hầu hết lactate trong môi trường nuôi cấy phôi trộn lẫn
50:50 giữa D- và L-isomer trong dòch sodium lactate. Trong đó chỉ có L-lactate có hoạt
tính sinh học, vì vậy nồng độ lactate trong môi trường chỉ là ½ lượng được cho vào môi
trường. Lactate là một acid yếu có thể vào phôi và gây sụt giảm pH nội bào vì vậy
sodium lactate được sử dụng trong môi trường nuôi cấy phải tránh sự có mặt của D-
isomer, mặc dù nó không có hoạt tính sinh học nhưng nó vẫn có thể gây ra sự sụt giảm
pH và làm ảnh hưởng tới sinh lý tế bào.
Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh, glucose hiện diện đồng thời với
phosphate trong môi trường nuôi cấy làm chậm hoặc hãm lại sự phát triển, phân chia
của phôi ở giai đoạn 4 tế bào muộn và 8 tế bào sớm trong nuôi cấy. Tuy nhiên, sự ức
chế của glucose có thể được giảm bớt bởi amino acid và vitamin.
Tóm lại, phôi trong giai đoạn trước làm tổ trải qua sự thay đổi đột ngột trong
việc sử dụng carbohyrate khi phát triển. Pyruvate/lactate lúc đầu là những chất dinh
dưỡng ưu tiên và việc sử dụng glucose tăng rõ rệt vào giai đoạn sau kết khối.
II.3.4. Amino acid
Dòch ống dẫn trứng và tử cung có chứa một lượng đáng kể amino acid tự do
được phôi sử dụng và tổng hợp. Điều này cho thấy amino acid có vai trò sinh lý trước
và trong quá trình làm tổ của phôi động vật có vú.
Những nghiên cứu cho thấy, amino acid trong môi trường nuôi cấy làm tăng sự
phát triển của phôi đến giai đoạn phôi nang. Đối với sự phát triển của phôi chuột,
block 2 tế bào. Người ta cho rằng transferrin làm tăng sự phát triển của phôi bằng cách
bắt giữ những ion sắt, tuy nhiên lại ngăn chặn triệt để oxy tự do trong môi trường nuôi
cấy là nguyên nhân gây ra stress oxi hoá đối với phôi.
Người ta đã chứng minh với môi trường có chứa EDTA, những amino acid
không thiết yếu và glutamine, việc có thêm transferrin không làm tăng sự phát triển
của phôi chuột lên giai đoạn phôi nang. Vì vậy, khi môi trường đã có EDTA và amino
acid thì transferrin là không cần thiết.
II.3.6. Chất chống oxi hóa
Người ta đã chứng minh rằng một trong những nguyên nhân làm chậm lại sự
phát triển của phôi ở giai đoạn trước làm tổ trong nuôi cấy so với sự phát triển trong cơ
thể là do stress oxi hóa. Nguyên nhân do nồng độ oxy cao, sự phơi bày ra ánh sáng và
sự có mặt của những kim loại chuyển tiếp trong môi trường nuôi cấy. Vì vậy, một vài
nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của nhữmg chất chống oxi hóa lên sự phát triển
của phôi giai đoạn trước làm tổ, tuy nhiên tới nay vẫn còn rất nhiều tranh cãi.
II.3.7. Kháng sinh
Những kháng sinh như penicillin, streptomycin hoặc gentamycin thường có
trong môi trường nuôi cấy phôi. Khi rửa phôi trong môi trường có chứa kháng sinh có
thể tránh được sự nhiễm khuẩn.
II.3.8. Các đại phân tử
Đại phân tử được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường là albumin huyết
thanh. Bổ sung vào môi trường lượng lớn albumin huyết thanh làm tăng tính căng bề
mặt, giảm xu hướng trôi lơ lửng hoặc dính chặt vào thuỷ tinh hay plastic, giúp cho việc
thao tác với phôi sẽ trở nên dễ dàng hơn.
Albumin huyết thanh có thể hoạt động như chất bắt giữ làm bất hoạt các kim
loại nặng và những độc tố khác.
Albumin huyết thanh là chất đệm làm giảm tối thiểu sự thay đổi pH khi môi
trường được đưa ra khỏi tủ CO
2
.
Tuy nhiên, các đại phân tử xuất phát từ huyết thanh cũng là các nguyên nhân
III.6. Thể tích ủ
Toàn bộ hệ thống nuôi cấy với mọi yếu tố: không khí, thể tích nuôi cấy, số
lượng phôi, việc bổ sung các đại phân tử … đều tác động lẫn nhau và tác động lên sự
phát triển của phôi.
Việc nuôi cấy phôi động vật có vú trong thể tích nhỏ môi trường và (hoặc) trong
nhóm làm tăng rõ rệt sự phát triển lên phôi nang. Hơn thế, đã có những nghiên cứu
chứng minh rằng nuôi cấy phôi trong thể tích nhỏ làm tăng khả năng tồn tại và phát
triển tiếp tục sau khi chuyển. Người ta cho rằng việc tăng sự phát triển của phôi trong
nuôi cấy với một thể tích nhỏ môi trường và (hoặc) trong nhóm là do phôi tạo ra những
nhân tố actocrine/paracrine đặc biệt sẽ kích thích sự phát triển. Nuôi cấy phôi trong
một thể tích lớn sẽ gây ra sự pha loãng làm giảm các nhân tố trên dẫn đến không đem
lại kết quả mong muốn.
80µl môi trường
Hình 6: Sự pha loãng trong nuôi cấy phôi đơn lẻ với một thể tích lớn môi
trường.
III.7. Không khí
Nồng độ oxy trong lumen của vòi fallope thỏ là 2-6%, và 8% trong vòi trứng
của chuột đồng, nồng độ oxy trong tử cung thấp hơn so với trong vòi trứng. Các nghiên
cứu trên những loài động vật có vú khác nhau đã chứng minh rằng nuôi cấy trong nồng
Sau khi loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu thành proalbumin và tiếp tục loại bỏ 6
propeptide còn lại để trở thành albumin.
Hình 8: Sự tổng hợp bovine serum albumin (BSA)
VIII.3. Thành phần amino acid trong BSA
Albumin được cấu tạo bởi lượng thấp tryptophan và methionine; lượng lớn
cystine và những amino acid tích điện, aspartic và glutamic acid, lysine, và arginine.
Glycine và isoleucine trong BSA thấp hơn trong protein chuẩn bình thường.
Ala 48 Cys 35 Asp 41 Glu 58
Phe 30 Gly 17 His 16 Ile 15
Lys 60 Leu 65 Met 5 Asn 14
Pro 28 Gln 21 Arg 26 Ser 32
Thr 34 Val 38 Trp 3 Tyr 21
VIII.4. Đặc tính chức
năng của BSA
VIII.4.1. Tạo bọt
Bảng 2: Các thành phần amino acid trong BSA
Preproalbumin H
2
N-M-K-W-V-T-F-L-L-L-L-F-I-S-G-S-A-F-S-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E-
Proalbumin H
2
N-R-G-V-F-R-R-E-A-H-K-S-E-
chuẩn cao, bước kết khối cần diễn ra chậm hơn với bước phân ly. Nhiệt độ làm biến
tính của BSA ở 62
0
C và 64
0
C. Nhiệt độ làm biến tính BSA tăng khi kết hợp với acid
béo nhưng giảm khi nó phản ứng với clupeine. Vì vậy, những phản ứng của một
polymer sinh học như acid béo với BSA dẫn đến làm ổn đònh phân tử BSA, trong khi
những phân tử khác như clupeine làm khởi động bước phân ly của BSA.
VIII.4.3. Phối tử kết nối
Khả năng quan trọng nhất của albumin là khả năng kết nối thuận nghòch với
nhiều phối tử. BSA là chất vận chuyển những acid béo không tan trong huyết thanh.
Nó cũng thực hiện nhiều chức năng khác như cô lập các gốc oxygen tự do và bất hoạt
các độc tố như bilirubin. Albumin hút mạnh với các acid béo, hematin, bilirubin và thu
hút chính với những hợp chất thơm nhỏ mang điện tích âm. Nó hình thành các nối đồng
hoá trò với pyridoxyl phosphat, cysteine, glutathione, và nhiều kim loại khác nhau như
Cu (II), Ni (II), Hg (II), Ag (II), và Au (I). Như một protein vận chuyển đa chức năng,
albumin là chất vận chuyển chính hoặc nguồn cung cấp oxid nitric.
VIII.5. Những nghiên cứu về vai trò của BSA trong môi trường nuôi cấy
phôi chuột
Trong thành phần hóa học môi trường nuôi cấy phôi giai đoạn trước làm tổ,
huyết thanh hoặc protein có những chức năng vẫn chưa được xác đònh. Mặc dù, BSA
thường có mặt trong tất cả môi trường nuôi cấy phôi chuột giai đoạn trước làm tổ.
Năm 1949, Hammond đã có những nghiên cứu ban đầu về vai trò của các đại
phân tử trong môi trường nuôi cấy, thấy rằng phôi chuột 8 tế bào phát triển lên thành
phôi nang cần sự kết hợp của lòng trắng trứng trong môi trường. Những nghiên cứu tiếp
theo sau của Whitten (năm 1956), cho là những thành phần thiết yếu trong lòng trắng
trứng không thể phân tích được. Vì thế năm 1956 Whitten đã thay thế lòng trắng trứng
bằng BSA kết tinh, từ lúc đó việc sử dụng lòng trắng trứng trong môi trường nuôi cấy
đã giảm xuống thay vào đó là BSA.
. Brinster và Thomson vào năm 1966 đã chứng minh phôi
chuột 8 tế bào lai xa không đòi hỏi nguồn nitrogen hỗn hợp để phát triển lên thành
phôi nang.
Kết quả thí nghiệm của Biggers, Summers, và Ginnis vào năm 1997 cho thấy:
hợp tử CF
1
lai xa phát triển thành phôi nang trong môi trường KSOM được thay thế
BSA bằng PVA (polyvinyl alcohol), dưới điều kiện này nguồn nitrogen chỉ là
glutamine. Kết quả này khác với kết luận của Brinster năm 1965 cho rằng có sự phân
chia của phôi giai đoạn 2 tế bào nhưng không có sự hình thành phôi nang khi glutamine
được bổ sung vào môi trường với PVP thay thế cho BSA. Liệu sự khác biệt này là do
sự khác nhau trong thành phần của 2 loại môi trường vẫn chưa được kết luận.
Kết quả thu được từ thí nghiệm này cũng cho thấy rằng năng suất của phôi nang
nuôi cấy trong môi trường KSOM với PVA thay thế cho BSA thấp hơn rõ ràng so với
môi trường KSOM với BSA. Như thế BSA được bổ sung vào môi trường KSOM làm
tăng sự tác động hình thành phôi nang. KSOM với PVA thay thế cho BSA được bổ
sung amino acid cũng làm tăng sự hình thành phôi nang.
Fissore vào năm 1989 đã chứng minh rằng có thể loại BSA ra khỏi môi trường
nuôi cấy thay vào đó là EDTA. Lý do BSA làm tăng sự phát triển phôi vẫn không được
biết rõ ràng, có thể có ít nhất 3 khả năng:
(1) BSA làm tăng amino acid được bổ sung
(2) BSA cung cấp những phân tử không phải amino acid được kết hợp kích
thích sự phát triển
(3) BSA cung cấp những chức năng bắt giữ.
Năm 1992, Kiernan và Bavister đã chứng minh một số lô BSA kích thích sự
phát triển của phôi chuột 2 tế bào trong nuôi cấy, trong khi một số lô khác lại ức chế.
Những nghiên cứu của Evecen, Alkan năm 2002 thấy rằng trong nuôi cấy phôi
chuột từ phôi chuột 2 tế bào: với môi trường M16 và môi trường Whitten nồng độ BSA
được bổ sung là 1mg/ml và 3 mg/ml là tối ưu cho sự phát triển của phôi chuột 2 tế bào
lên phôi nang và khi nồng độ BSA vượt quá 10 mg/ml ức chế sự phát triển của phôi
VI. ĐỐI TƯNG NGHIÊN CỨU
Gồm 599 phôi chuột giai đoạn 2 tế bào được thu nhận từ chuột nhắt trắng (Mus
musculus var. Albino) khoảng 2-3 tháng tuổi, nặng khoảng 20-30g. Chuột được mua tại
viện Pasteur theo tiêu chuẩn trong lượng, ổn đònh theo điều kiện thí nghiệm một tuần
trước khi tiêm thuốc kích dục tố, và chuột được mua từ viện Pasteur ở dạng chuột ổ (1
- 2 tuần tuổi), ổn đònh theo điều kiện thí nghiệm tới độ tuổi yêu cầu.
VII. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm mô tả: chuột được ổn đònh theo chu kì
sáng – tối, sau đó tiêm kích dục tố, cho phối và thu nhận phôi 2 tế bào, tiến hành nuôi
phôi với các điều kiện thí nghiệm ở 3 nồng độ BSA 0,4%, 0,8%, 1,2% và nuôi phôi với
số lượng phôi khác nhau: 10 phôi và 6 phôi trong 50µl môi trường IVF. Quan sát và ghi
nhận kết quả.
Phương pháp thống kê: Ghi nhận tỉ lệ % sự phát triển lên các giai đoạn phôi 4
tế bào, phôi dâu, phôi nang so với phôi 2 tế bào thu nhận ban đầu. Dùng phần mềm
thống kê Statgraf để xác đònh độ khác biệt ý nghóa và các số trung bình khác.
VIII. DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HÓA CHẤT
IV.1. Dụng cụ
STT Tên Hãng Nước sản xuất
1 Ống tiêm 1ml Vinahankook Medical Supplies Việt Nam
Copyright: Tài liệu đại học ©