BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
............

............

TRẦN ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP CỦA MỘT SỐ LOÀI
VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM NUÔI NƯỚC LỢ
TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC
.

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
............

............



Page i


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo, Phòng Hợp
tác Quốc tế và Đào tạo - Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1, Ban Giám
hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Cơ quan Thú y vùng III đã ủng
hộ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới cô giáo hướng dẫn, TS. Phan
Thị Vân, người đã tận tình định hướng, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận văn.
Qua đây, tôi xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Quan
trắc cảnh báo môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh khu vực phía Bắc – Viện
nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 và các cán bộ thuộc đề tài “Tôm khẩn cấp
năm 2013” đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài.
Lời cảm ơn chân thành xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp,
những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong học tập cũng như trong
cuộc sống.

Hà Nội 20 tháng 11 năm 2014
Tác giả luận văn

Trần Anh Tuấn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


1.1.2

Đặc tính phân bố và nuôi cấy ............................................................ 4

1.1.3

Đặc tính sinh hóa .............................................................................. 5

1.2

Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Vibrio spp trên tôm ............. 8

1.2.1

Trên thế giới ..................................................................................... 8

1.2.2

Ở Việt Nam..................................................................................... 15

1.3

Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ .................. 18

1.3.1

Tình hình hội chứng gan tụy cấp trên thế giới ................................. 18

1.3.2


Bệnh hoại tử gan tụy cấp ................................................................. 23

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27
2.1

Đối tượng và nội dung nghiên cứu .................................................. 27

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 27

2.1.2

Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 27

2.2

Thời gian, địa điểm nghiên cứu ....................................................... 27

2.2.1

Thời gian nghiên cứu ...................................................................... 27

2.2.2

Địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 27

2.3.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................... 27

3.3

Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được ..... 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 51
1.

Kết luận .......................................................................................... 51

2.

Đề xuất ........................................................................................... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iv


DANH MỤC BẢNG
STT

TÊN BẢNG

TRANG

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hoá của một số loài vi khuẩn Vibrio spp là tác
nhân gây bệnh ở động vật thuỷ sản (Buller, 2004) ............................ 7
Bảng 2.1 Cách thực hiện và đọc các phản ứng sinh hóa................................ 32

Hình 2.1: Bố trí thí nghiệm........................................................................... 36
Hình 3.1: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nghệ An ..................................... 38
Hình 3.2: Tỷ lệ phận lập các loài Vibrio ở Nam Định
Hình 3.3: Hình ảnh soi vi khuẩn trên kính hiển vi ........................................ 39
Hình 3.4: Thử sinh hóa V. paraheamolyticus tái phân được ......................... 45
Hình 3.5: Tổ chức mô của tôm bị AHPND ................................................... 46
Hình 3.6: Kháng sinh đồ V.paraheamolyticus (12.020) ................................ 49
Hình 3.7: Kháng sinh đồ V. vulnificus và V.paraheamolyticus (13.014) ....... 49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

AHPND:

Acute Hepatopancreatic Necrosis Dsease

CTVK:

Công thức vi khuẩn

ĐBSCL:

Đồng Bằng Sông Cửu Long

EMS:


PCR:

Polymerase Chain Reaction

Thuốc BVTV:

Thuốc Bảo vệ thực vật

TSV:

Taura Syndrome Virus

Viện NCNTTS: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản
YHV:

Yellow Head Virus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài
Nuôi tôm nước lợ là một hình thức nuôi quan trọng đem lại giá trị kinh
tế cao, chiếm hơn 40% tổng giá trị sản phẩm nuôi trồng thủy sản ở nước ta.
Trong các loài được nuôi ở nước lợ, tôm sú và tôm thẻ chân trắng là những
loài được nuôi phổ biến trên địa bàn cả nước ta với gần 80% tổng diện tích
nuôi trồng nước lợ (FAO, 2012). Hình thức nuôi này đóng một vai trò to lớn

các loài V. parahaemolyticus, V. vulnificus,V. harveyi. Cụ thể là, một nghiên
cứu của giáo sư Lightner và cộng sự (2013) đã chỉ ra một chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus là tác nhân gây ra hội chứng này.
Với mục đích làm rõ sự liên quan của nhóm vi khuẩn Vibrio đến bệnh
hoại tử gan tụy cấp, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng gây
bệnh hoại tử gan tụy cấp của một số loài vi khuẩn vibrio trên tôm nuôi
nước lợ tại một số tỉnh phía Bắc”. Đây là một đề tài nhỏ thuộc đề tàii
“Nghiên cứu nguyên nhân, tác nhân gây hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm sú
và tôm thẻ chân trắng và biện pháp khắc phục” của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn giao cho Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1 chủ trì trong
năm 2013.
2 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các loài vi khuẩn Vibrio độc lực trên tôm sú, tôm thẻ chân
trắng bị AHPND.
3 Nội dung nghiên cứu
- Xác định sự có mặt của vi khuẩn trên tôm bị AHPND
- Xác định các chủng vi khuẩn Vibrio độc lực
- Thử kháng sinh đồ đối với các chủng Vibrio độc lực xác định được

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu
1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái vi khuẩnVibrio
Hệ thống phân loại (Ackermann, 1984):
Ngành Proteobacteria

(Buller, 2004)

1.1.2 Đặc tính phân bố và nuôi cấy
Ngoài tự nhiên vi khuẩn Vibrio phân bố rất phổ biến trong môi trường
nước biển và vùng nước lợ ven biển; có thể tìm thấy chúng trong các tầng
nước, vùi trong trầm tích đáy hoặc bám trên bề mặt của các sinh vật sống
trong vùng nước đó. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm,
phát triển mạnh ở nhiệt độ 20-300C (Bùi Quang Tề và cộng sự, 2004).
Trong môi trường nuôi cấy tất cả các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio
đều cần muối NaCl để phát triển, nồng độ muối cho phép trong môi trường
nuôi cấy thường là 1-2 %.
TCBS là môi trường chọn lọc của các loài vi khuẩn Vibrio, sau 18-24h
nuôi cấy hình thành khuẩn lạc với kích thước khoảng 2–5mm, có màu vàng
(V. cholerae, V. alginolyticus, V. fluvialis) hoặc xanh (V. parahaemolyticus,
V. harveyi, V. vulnificus).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


Hình 1.5: Khuẩn lạc vi khuẩn
V. harveyi (Buller, 2004)

Hình 1.6: Khuẩn lạc vi khuẩn
V. Parahaemolyticus (Buller, 2004)

1.1.3 Đặc tính sinh hóa
Các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều yếm khí tuỳ tiện, hầu hết là
oxy hoá và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh

Phát triển ở 370C
Phát triển ở 0%NaCl
Phát triển ở 3%NaCl
Phát triển ở 7%NaCl
Nhậy cảm 0/129 (10 µg)
Nhậy cảm 0/129(150 µg)
Màu khuẩn lạc trênTCBS
Thử O/F Glucose
β galactosidase
Arginine dihydrolase
Lysine Decarboxylase
Orinithine Decarboxylase
Phản ứng Citrate
Phản ứng Urease
Khử Nitrate NO3→NO2
Indol
Sinh H2S
Methyl red
Voges-Proskauer (V-P)
Dịch hóa Gelatin
Axit hoḠArabinose
Axit hoḠGlucose
Axit hoḠInositol
Axit hoḠMannitol
Axit hoḠSalicin
Axit hoḠSorbitol
Axit hoḠSucrose

1
+

+
-

+
+
+
+
+
+
+
-

3
+
+
+
+
+
R
S
vàng
+/+
+
+
d
+
+
+
+
+

+
+
S
S
xanh
+/+
+
+
+
+
+
+
-

6
+
+
+
+
S
S
+/+
+
D
Page 7


Chú thích:
1 - Vibrio parahaemolyticus


Adam (1991) và nhiều tác giả khác cho rằng: Tôm ấu trùng và hậu ấu trùng
khi bị nhiễm khuẩn nặng có thể gây hiện tượng phát sáng và chết hàng loạt.
Lightner và cộng sự (1996) cũng đã thông báo, trong số các bệnh gây ra ở ấu
trùng tôm, bệnh phát sáng là bệnh nhiễm trùng toàn thân và gây thiệt hại lớn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


nhất, hiện tượng phát sáng trong bóng tối là dấu hiệu đặc thù của bệnh này.
Ngoài ra, theo Tonguthai (1995), ấu trùng tôm bị bệnh phát sáng thì cơ thể trở
nên yếu ớt, chuyển màu trắng nhợt và lắng xuống đáy, tỷ lệ chết có thể lên tới
100% trong 1 đến 2 ngày, khi bệnh phát sáng xuất hiện trong trại sản xuất thì
việc ngăn ngừa giữa các bể ương nuôi là rất khó khăn và có thể đợt sản xuất
đó bị thất bại hoàn toàn. Tiến hành giải phẫu ấu trùng tôm bị nhiễm bệnh phát
sáng và quan sát dưới kính hiển vi cho thấy vi khuẩn nhiễm dày đặc trong
khoang máu của ấu trùng phát quang đã gần chết (Pitogo, 1995).
Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú,
Baticados (1988) và nhiều tác giả khác đều có chung nhận định: V. harveyi
được coi là vi khuẩn chủ yếu gây ra bệnh phát sáng. Tác nhân gây bệnh V.
harveyi tồn tại tự nhiên trong môi trường nước biển, ở đó có thể tìm thấy
chúng trong những thành viên bậc thấp (Ruby and Nealson, 1978). Khi bệnh
phát sáng xảy ra trong bể ương ấu trùng tôm, số lượng vi khuẩn Vibrio tăng
dần theo thời gian. Tuy vậy, Lightner (1996) cho rằng ấu trùng tôm sú có thể
bị phát sáng khi nhiễm ở mật độ cao các loại vi khuẩn V. harveyi, V.
parahaemolyticus và V. vulnificus. Theo Pẽna và cộng sự (2001), vi khuẩn
gây bệnh phát sáng V. harveyi đã gây ra tỉ lệ chết cao trên tôm sú (Penaeus
monodon) nuôi ở Philippin và là loài hiện diện trong ao nuôi với tỷ lệ rất cao,
chiếm 65,5%. Liên quan tới tần số xuất hiện Vibriosis trên tôm nuôi tại một
số trang trại ở Ấn Độ, theo Otta và cộng sự (2000) thì V. alginolyticus chiếm

có thể nhiễm với mật độ 2x109 cfu/g, chiếm từ 63 - 67% và khoảng 16 - 18%
trong tổng số vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh phát sáng (Pitogo, 1998).
Ruangpan (1995) cho rằng, số lượng vi khuẩn Vibrio tồn tại và phát triển
trong bể ấp và ao nuôi phụ thuộc vào mật độ nuôi, ao nuôi tôm mật độ cao thì
số lượng vi khuẩn này luôn cao hơn so với ao nuôi mật độ thấp.
Một số loài vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho tôm
nuôi, chúng là vi khuẩn cơ hội vì bình thường chúng luôn tồn tại trong môi
trường ương nuôi. Khi điều kiện sống có những thay đổi bất lợi như các yếu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


tố về khí hậu, môi trường, dinh dưỡng... hoặc do mắc các bệnh gây trạng thái
“stress” làm giảm sức đề kháng của tôm nuôi, lúc đó chúng mới tấn công gây
nên bệnh. Theo Pitogo (1995), bệnh vi khuẩn ở tôm nuôi luôn xuất hiện cùng
với những quá trình bệnh lý khác hoặc phản ánh hậu quả của việc phá vỡ cân
bằng sinh thái trong bể hoặc ao nuôi. Theo Chanratchakool (1995), tôm nuôi
trước khi cảm nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio đã có sự thay đổi màu sắc tự nhiên
sang màu đỏ, điều đó chứng tỏ là tôm nuôi bị “stress”. Sự suy giảm môi
trường ao nuôi đóng một vai trò quan trọng trong việc gây stress này của tôm,
dẫn đến vi khuẩn Vibrio nhiễm thứ phát.
Để giảm thiểu tác hại của các bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm
nuôi, người ta đã sử dụng một số loại hóa chất và thuốc kháng sinh trong công
tác phòng trị bệnh. Hóa chất thường được sử dụng rộng rãi là Chlorin A, tuy
nhiên chúng luôn có tác dụng hai mặt; theo Pitogo (1995) Chlorin chỉ có tác
dụng kìm hãm vi khuẩn ở nồng độ 15 - 30 ppm và vi khuẩn xuất hiện lại trong
12 giờ sau khi ngừng khử trùng bằng hóa chất này; ngoài ra khi sử dụng
Chlorin còn kích thích sự phát triển của gen kháng kháng sinh ở vi khuẩn và
tiêu diệt tảo (David, 1999)

biển (Sargassum wightii) phối hợp vào thức ăn cho tôm, kết quả cho thấy tôm
có khả năng miễn dịch cao (tỉ lệ sống 83%), đây là nghiên cứu mở đầu để sử
dụng nguồn thực vật tự nhiên dồi dào ở biển thay thế cho một số chất kích
thích miễn dịch được lấy từ động vật. Chen (2008) đã thử nghiệm dùng các
hợp chất chiết xuất từ cây cỏ biển (Chondrus crispus) để tiêm cho tôm chân
trắng (Litopenaeus vannamei), sau đó cảm nhiễm V. alginolyticus lên tôm, kết
quả cho thấy tôm có khả năng miễn dịch với loại vi khuẩn này.
Ngoài ra, người ta cũng đã nghiên cứu các hình thức nuôi ghép để hạn
chế mật độ vi khuẩn Vibrio trong ao nuôi tôm như: Eleonor (2007) nuôi ghép
tôm sú (P. monodon) với vẹm hoặc hầu đã làm giảm mật độ vi khuẩn phát
sáng V. harveyi; thí nghiệm của ông chỉ ra rằng khi nuôi ghép vẹm xanh
(Perna viridis), vẹm nâu (Perna indica) hoặc hàu (Crassostrea sp) với tôm sú
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 13


theo mật độ phù hợp đã làm giảm mật độ vi khuẩn phát sáng trong ao từ 104
cfu/ml xuống còn 101 cfu/ml, ngoài ra động vật thân mềm còn góp phần làm
sạch môi trường ao nuôi.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14


1.2.2 Ở Việt Nam
Tình hình dịch bệnh đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở
Việt Nam, đây là vấn đề đặt ra cho các nhà nghiên cứu khoa học Thuỷ sản.
Để giải quyết vấn đề thực tiễn này đã có nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về

Theo Bùi Quang Tề và cộng sự (2004), tôm nuôi ngoài ao khi bị bệnh do
Vibrio thì có hiện tượng: Nổi lên mặt ao, dạt bờ, kéo đàn bơi lòng vòng. Tôm
ở trạng thái hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Có sự biến đổi màu đỏ hay
màu xanh, vỏ mềm và xuất hiện các vết hoại tử, ăn mòn trên vỏ, các phần phụ
bị mòn gẫy hoặc cụt dần; ông cho rằng tác nhân gây ra là do các loài V.
parahaemolyticus, V. harveyi, V. Vulnificu và V. anguillarum. Còn ở tôm sú
ấu trùng V. alginolyticus gây ra bệnh đỏ thân, với các dấu hiệu xuất hiện các
điểm đỏ ở gốc râu, vùng đầu ngực, thân và các phần phụ của ấu trùng.
Trong các hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể
theo một số con đường bao gồm nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ, tôm
giống và thức ăn tươi sống; hoặc chúng có thể nằm sẵn trên thành bể, dưới
đáy ao. Trong bể ương ấu trùng thì mật độ Vibrio tăng theo thời gian nuôi,
tầng đáy cao hơn tầng mặt, do đó khi xiphông tầng đáy có tác dụng giảm mật
độ Vibrio trong bể ương.
Xác định mức độ nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio trên tôm thông qua
định lượng, Đỗ Thị Hòa và cộng sự (1994) đưa ra các thông số:
Tôm ấu trùng: Tôm khỏe trung bình nhiễm 358 khuẩn lạc/cá thể, tôm
bệnh trung bình nhiễm 3.255 khuẩn lạc/cá thể.
Tôm giống: Tôm khỏe trung bình nhiễm 3.008 khuẩn lạc/cá thể, tôm
bệnh trung bình nhiễm 14.450 khuẩn lạc/cá thể.
Nhằm hạn chế tác hại của bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên tôm nuôi,
các tác giả đã khuyến cáo việc áp dụng các biện pháp phòng trị thích hợp như:
Để phòng bệnh, cần áp dụng biện pháp phòng bệnh tổng hợp như sát trùng ao
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 16