MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Trong xã hội công nghiệp hóa hiện nay, một mặt cuộc sống của con
ngƣời ngày càng đƣợc cải thiện, đời sống đƣợc nâng cao hơn nhƣng công
nghiệp hóa cũng làm nảy sinh nhiều bệnh tật mang tính xã hội nhƣ: tiểu
đƣờng, mỡ máu, béo phì…. Chính vì vậy, các nhà dƣợc học, thực vật học
luôn mong muốn tìm ra các loài thực vật có thể dùng làm thuốc hay làm thức
ăn có thể phòng và chữa trị đƣợc những bệnh này.
Cây Nƣa (Amorphophallus spp.) đƣợc dùng làm thức ăn từ lâu đời ở
Trung Quốc và các nƣớc Đông Nam Á. Ở Trung Quốc và Nhật Bản, bột từ củ
Nƣa đƣợc chế biến thành nhiều loại thức ăn khác nhau nhƣ mì, miến, thạch,
bánh, kẹo... Hơn nữa, trong bột Nƣa có chứa đƣờng glucomannan với hàm
lƣợng khá cao, giúp làm giảm mỡ máu, chống béo phì đƣợc chế biến thành
các viên giảm béo là một loại thực phẩm chức năng phổ biến. Ngoài ra, bột
Nƣa còn đƣợc sử dụng trong mỹ phẩm làm đẹp da.
Theo các nghiên cứu mới đây của viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Việt Nam là nơi phân bố của một số loài Nƣa có hàm lƣợng glucomannan
tƣơng đối cao, Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) là một trong số
đó. Để phát triển nguồn nguyên liệu củ cây Nƣa krausei thu glucomannan cho
công nghiệp chế biến thực phẩm và thực phẩm chức năng thì vấn đề nhân
giống cây Nƣa krausei là rất cần thiết.
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ
thuật rất quan trọng và phổ biến của công nghệ sinh học giúp nhân nhanh
giống cây trồng và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm. Xuất phát từ những lý
do trên tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống loài Nƣa krausei
(Amorphophallus krausei Engl.) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô” để phục
vụ sản xuất.
1


Mục đích nghiên cứu

1.1.1. Trên thế giới
Chi Nƣa (Amorphophallus) là một chi lớn thuộc họ Ráy (Aracae). Trên
thế giới chi Nƣa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới
thuộc Châu Phi và Châu Á. Hiện nay nhiều loài đƣợc nghiên cứu và triển khai
trồng với diện tích lớn ở nhiều nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, New
Zealand, Ấn Độ, Thái Lan, In đô nê xi-a, v.v.
Ở Trung Quốc, chỉ riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn hecta đất đồi núi
đƣợc sử dụng để trồng Nƣa, ngoài ra Nƣa còn đƣợc trồng ở Nam Ninh, Quảng
Đông, Quảng Tây, Trùng Khánh... Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và
Uedama, ngay từ những năm 70 của thế kỷ trƣớc, hàng năm khoảng hơn 15
nghìn ha Nƣa đã đƣợc trồng với sản lƣợng đạt tới hàng nghìn tấn. Do tầm
quan trọng của nguồn lợi từ củ Nƣa, nên cây này đã đƣợc nhập trồng từ Nhật
Bản vào New Zealand từ hàng chục năm trƣớc [23].
Nƣa là cây trồng có thể mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên trong những
năm qua đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng nhƣ kỹ
thuật canh tác cây Nƣa.
Hiroshi Kurihama (1979) đã đƣa ra các định hƣớng và kinh nghiệm
trong trồng trọt Nƣa konjac trên đất bằng và đất dốc tại 2 tỉnh Jinnejo và
Uedama ở Nhật Bản, cũng nhƣ các yếu tố về nhiệt độ, đất, sâu bệnh và thời
vụ [26].
Dhua và cs (1988) đã có nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất hoá học
đến quá trình nảy mầm, phát triển và sản lƣợng của củ Nƣa chuông
(Amorphophallus paeoniifolius Nicols.) [20].
3


Liu & cs (1998) khi nghiên cứu về sinh trƣởng và phát triển của một số
loài Nƣa ở Trung Quốc đã chỉ ra các điều kiện sinh thái của Nƣa. Theo nhóm
nghiên cứu, Nƣa không phải là cây đòi hỏi nhiều nƣớc, có khả năng chịu hạn
tốt nhƣng không chịu đƣợc ngập úng. Về nhiệt độ, Nƣa là cây ƣa ấm, có khả

tại các vƣờn nhà ở Java ngày càng nhiều. Trong các nghiên cứu về sinh
trƣởng và ứng dụng của Nƣa chuông từ 2003 đến 2008 của nhóm tác giả cho
biết chu kỳ tăng tƣởng của Nƣa chuông là khác nhau ở một số nƣớc Nam Á
nhƣ: ở Tây nam Trung Quốc, bắc Mianma, bắc Thái Lan chu kì tăng trƣởng
bắt đầu từ tháng 5, kết thúc vào tháng 10, trong khi đó ở In đô nê xi-a lại bắt
đầu từ tháng 11 và kết thúc vào tháng 5, giai đoạn tăng trƣởng kéo dài 160180 ngày ở tất cả các khu vực [37].
Liu (2004) đã đề cập khá kỹ về nguồn gốc, phân bố của chi Nƣa, phân
loại học, hình thái học, chu trình sinh trƣởng và phát triển, sinh thái, sự
chuyển hóa của glucomannan, trồng trọt, nhân giống và chế biến cũng nhƣ
bảo quản sau thu hoạch… của các loài Nƣa. Theo Liu trên thế giới đã biết
khoảng 173 loài Nƣa, trong đó có trên 20 loài đƣợc phát triển thƣơng mại ở
Trung Quốc, Nhật Bản, Malaisia, Ấn Độ và In đô nê xi-a, hàng năm thế giới
sản xuất khoảng 30 nghìn tấn bột konjac. Sản lƣợng củ Nƣa tƣơi có thể đạt tới
30 - 35 tấn/ha nhƣng chỉ khoảng 2,5 tấn glucomannan đƣợc chiết xuất từ số
lƣợng củ này [28].
Douglas và cs (2005) đã có công trình nghiên cứu về kỹ thuật trồng
Nƣa konjac ở New Zealand và đã thu đƣợc nhiều kết quả về trọng lƣợng, chất
lƣợng củ Nƣa khi trồng dƣới tán rừng và trồng trực tiếp dƣới ánh sáng mặt
trời [22].
Theo Zhang và Liu (2006) Nƣa phát triển theo mùa, chúng thƣờng rụng
lá vào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý của Nƣa kéo dài từ 60 80 ngày và không thể có bất kỳ tác nhân nào có thể phá vỡ trạng thái ngủ để
hình thành chồi trong giai đoạn này. Sau khi ngủ, cây bắt đầu nảy mầm, lá
5


phát triển mạnh để hình thành củ mới, lúc này củ mẹ hết chất dinh dƣỡng và
chết đi. Trong tự nhiên, Nƣa cần ít nhất 3 năm để để phát triển đủ lớn và có
thể ra hoa. Do đó, Nƣa đƣợc đánh giá là cây sinh trƣởng chậm và cho năng
suất thấp [40].
Kết quả nghiên cứu của Nedunchezhiyan và cs (2006) đã giới thiệu khá

đƣợc nghiên cứu ở một số loài nhƣ: A. konjac, A. muelleri, A.bulbifer, A.
paeoniifolius. Các loài Nƣa khác còn ít đƣợc biết đến trong đó có Nƣa
krausei.
1.1.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, chi Nƣa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam
nhƣng hầu hết tập trung ở các tỉnh miền núi, một số tỉnh duyên hải và hải đảo.
Một số loài đã đƣợc các dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không chỉ làm
thực phẩm mà còn là nguồn dƣợc liệu tự nhiên quý giá. Ngƣời dân thƣờng
trồng Nƣa lấy củ làm lƣơng thực, thân và cành lá dùng chăn nuôi, cuống lá
(bèn hay chột) Nƣa dùng nấu canh hoặc muối dƣa ăn. Củ đƣợc dùng làm
thuốc trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa trị đờm tích trong phổi, trúng
phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau nhức, đầy bụng, tức ngực, ăn uống
không tiêu, sốt rét, trục thai chết...[14], [42].
Tài liệu về Nƣa ở Việt Nam chủ yếu là các công trình về phân loại chi
Nƣa. Các loài Nƣa đầu tiên ở Việt Nam đƣợc Gagnepain tổng hợp và mô tả
trong bộ sách Thực vật chí Đại cƣơng Đông dƣơng (1942) với 5 loài. Đó là
Nƣa chuông (A. campanulatus Bl. = A. paeoniifolius Nicolson), Nƣa rex (A.
rex Prain = A. paeoniifolius Nicolson), Nƣa đứt đoạn (A. interruptus Engl.),
Nƣa rivieri (A. rivieri Dur. = A. konjac K. Koch) và Nƣa Bắc Bộ (A.
tonkinensis Engl.) [24].
Phạm Hoàng Hộ (1993) đã thống kê và mô tả 7 loài, từ năm 1994 2000, nhiều loài Nƣa mới đã đƣợc một số nhà thực vật mô tả từ các mẫu thu
7


đƣợc ở Việt Nam. Dựa trên các mô tả đó Phạm Hoàng Hộ (2000) đã thống kê
đƣợc 18 loài Nƣa ở Việt Nam [4], [5], [10].
Cùng với các nhà thực vật nƣớc ngoài, Nguyễn Văn Dƣ (2001 & 2004),
cũng mô tả nhiều loài Nƣa mới cho khoa học và một số loài Nƣa bổ sung cho
hệ thực vật Việt Nam, làm cho số loài của chi này lên tới 25 loài. Trong đó, 4
loài Nƣa phổ biến nhất là: Nƣa chuông (A. paeoniifolius), Nƣa bắc bộ (A.

- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào.
Biệt hoá (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi
cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trƣờng nuôi cấy đều đã biệt hoá về cấu trúc
và chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào
này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá
trình đó gọi là quá trình phản phân hoá.
Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh

Tế bào phân chia

Tế bào chuyên
hóa

Phản phân hóa tế
bào
Hình 1.1. Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản
phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế
bào càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó
xảy ra quá trình phản phân hoá và ngƣợc lại, nhƣ các tế bào mạch dẫn ở thực
vật, tế bào thần kinh ở động vật. Ngƣời ta đã chứng minh rằng: các tế bào

9


càng gần trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành
công càng cao bấy nhiêu [8].

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô
tế bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lƣợng sử dụng là: nhóm đa
lƣợng và nhóm vi lƣợng.
+ Các nguyên tố khoáng đa lượng
Là các nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao
gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca. Các nguyên tố này có chức
năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng nên thành tế
bào. Môi trƣờng nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trƣờng
nhiều kali giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh.
+ Các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lƣợng là các nguyên tố đƣợc sử dụng với nồng độ dƣới
30ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lƣợng nhỏ trong
môi trƣờng nuôi cấy nhƣng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh
trƣởng và phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị
rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhƣng có hiệu
suất tái sinh thấp. Hàm lƣợng các nguyên tố đa lƣợng và các nguyên tố vi
lƣợng phụ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy và các đối tƣợng nuôi cấy [9].
- Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dƣỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là
điều kiện bắt buộc. Trong phần lớn các môi trƣờng nguồn cacbon và năng
lƣợng chủ yếu là saccharose và glucose. Ở một số mô thì có thể dùng
mantose, fructose và galactose.

11


- Vitamin
Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) vẫn có
khả năng tự tổng hợp đƣợc một số vitamin cần thiết nhƣng không đáp ứng đủ

phần khác của môi trƣờng dinh dƣỡng để kích thích sự tăng trƣởng của mô
sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó
đƣợc sử dụng kết hợp với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Aux trong
môi trƣờng nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trƣởng và phát triển cần nghiên
cứu, hàm lƣợng Aux nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa Aux
ngoại sinh và Aux nội sinh [12], [16].
Aux kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng
kích thƣớc của các cơ quan nhƣ tăng diện tích lá, phình to của quả, củ, tăng
đƣờng kính và chiều dài của cành, thân, rễ, tạo quả không hạt, kìm hãm sự
rụng lá, hoa quả...[11].
Aux điều khiển tính hƣớng của cây nhƣ hƣớng sáng, hƣớng đất. Do sự
phân bố không đều của Aux ở hai phía của cơ quan, dẫn đến sự sinh trƣởng
không đều của tế bào trong một cơ quan, gây ra tính hƣớng [11], [12], [16].
Ở cấp độ tế bào, Aux còn ảnh hƣởng lớn đến quá trình trao đổi chất,
các quá trình sinh lý của cây trồng nhƣ: quang hợp, hô hấp, trao đổi nƣớc hay
khoáng, tăng khả năng thẩm thấu của tế bào, tăng quá trình trao đổi acid
nucleic, protein…[11].
Quan trọng nhất là Aux kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất
định trên cành chiết, cành giâm và trên mô nuôi cấy. Vì vậy, trong kỹ thuật
nhân giống vô tính, việc sử dụng Aux để kích thích ra rễ là cực kỳ quan trọng
và bắt buộc [12], [16].
+ Cytokinin
Cytokinin là chất kích thích sinh trƣởng có tác dụng làm tăng sự phân
chia tế bào. Các cytokinin thƣờng gặp là kinetin, BAP. Kinetin là một dẫn
xuất của bazo nito adenine đƣợc Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất
13


nucleic acid. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhƣng có hoạt tính mạnh
hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo

bào, nơi tổng hợp GA mạnh nhất là ở lục lạp.
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh
trƣởng kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lóng cây họ lúa. Hiệu quả này có
đƣợc do ảnh hƣởng kích thích đặc trƣng của GA lên pha giãn của tế bào theo
chiều dọc. Vì vậy, khi xử lý GA làm tăng nhanh sự sinh trƣởng dinh dƣỡng
nên làm tăng sinh khối của chúng [11].
GA ảnh hƣởng rõ rệt lên sinh trƣởng các đột biến lùn. Các nghiên cứu
về trao đổi chất di truyền của GA khẳng định rằng các đột biến lùn của một số
thực vật nhƣ ngô, đậu Hà lan (chiều cao của cây chỉ bằng 20% chiều cao của
cây bình thƣờng) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu những gen
chịu trác nhiệm tổng hợp các enzyme của một số phản ứng trên con đƣờng
tổng hợp GA mà cây không thể hình thành đƣợc GA dù là một lƣợng rất nhỏ.
Với những đột biến này thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho cây sinh
trƣởng bình thƣờng [12], [16].
- Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia hữu cơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm kích
thích sự sinh trƣởng của mô sẹo và các cơ quan nhƣ: nƣớc dừa, dịch chiết
khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nƣớc dừa chứa
các acid amin, acid hữu cơ, đƣờng, Myo-inositol và các chất có hoạt tính
auxin, các gluoxit của cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay đƣợc
sử dụng do trong thành phần của chúng có chứa một số loại vitamin và các
chất kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trƣởng và phát triển của
mẫu cây nuôi cấy.
- Chất giá thể (thạch - Agar)
Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trƣờng nuôi cấy,
hàm lƣợng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối lƣợng.
15


Khi nồng độ agar cao, môi trƣờng trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất

nuôi cấy, bao gồm cƣờng độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng.
Cƣờng độ ánh sáng từ 1000 - 2500lux đƣợc dùng phổ biến trong nuôi
cấy nhiều loại mô. Với cƣờng độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trƣởng của chồi
chậm lại nhƣng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ [9],[17].
1.3.3. Những tồn tại của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào và phương hướng giải
quyết
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có
thể sai khác với cây mẹ ban đầu di hiện tƣợng biến dị tế bào soma. Kết quả là
cây con không giữ đƣợc những đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thƣờng
thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhƣng sau đó chiều hƣớng tăng lên khi nuôi
cấy kéo dài và tăng hàm lƣợng các chất kích thích sinh trƣởng. Một nghiên
cứu cho thấy khi nhân giống dứa in vitro nếu cấy chuyển quá 5 lần sẽ xuất
hiện biến dị soma. Tỷ lệ biến dị tăng dần khi cấy chuyển trên 5 lần và có thể
đạt 5%. Các dạng biến dị của cây dứa nuôi cấy in vitro thƣờng có biểu hiện
hình thái: bạch tạng, lá sọc, sinh trƣởng kém, chậm ra quả [2], [8].
Để hạn chế sự xuất hiện các biến dị không mong muốn, ngƣời ta
thƣờng chọn con đƣờng nhân nhanh qua phát triển chồi nách, nếu kích thƣớc
đoạn chồi đem nhân nhanh càng dài thì khả năng biến dị càng thấp và nhanh
chóng cho chồi non. Tránh cấy chuyển nhiều lần để hạn chế nguy cơ biến dị.
Trong trƣờng hợp tái sinh cây nhất thiết phải thông qua mô sẹo nên sử dụng
mô sẹo ít ngày tuổi, mô sẹo càng ít ngày tuổi thì khả năng phân chia càng
mạnh và nguy cơ biến dị càng thấp [18].
- Tạo các độc tố: Khi nuôi cấy ở một số loài cây thƣờng thấy hiện
tƣợng mô hoá màu nâu hoặc đen thƣờng gặp nhất ở cây thân gỗ. Hiện tƣợng
này là do mô già chứa nhiều tanin, hydroxyphenol... các chất này phát tán ra
môi trƣờng và ức chế sinh trƣởng, phát triển của mô. Để hạn chế hiện tƣợng
17


hoá màu nâu, hoá màu đen, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng than

thái và Tài nguyên sinh vật; Trại Thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 05/2012 đến tháng 05/2013
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei
- Thu thập, nghiên cứu và kế thừa các tài liệu về phân loại và hình thái
học.
19


- Quan sát, ghi chép các đặc điểm của mẫu tƣơi và cây trồng tại trại
thực nghiệm sinh học – Viện công nghệ sinh học.
- So sánh với các tài liệu phân loại và hình thái học trƣớc đây.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu trong điều kiện thí nghiệm
Các bƣớc nghiên cứu đƣợc tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau:
Hạt Nƣa

Khử trùng hạt
Tạo cây con nuôi in vitro

Tạo đa chồi

Tạo mô sẹo

Tái sinh cây

Tạo cây hoàn chỉnh

Trồng cây in vitro trong bầu

agar + 2mg/l 2,4D, trong điều kiện thiếu sáng [21].
Sau 30 ngày, thu mô sẹo và đánh giá khả năng tạo mô sẹo của các bộ
phận của cây qua các chỉ tiêu sau:
+ Tỷ lệ tạo mô sẹo tính theo công thức:
21


Số mẫu tạo mô sẹo
Tỷ lệ tạo mô sẹo =

× 100%
Tổng số mẫu nuôi cấy

+ Màu sắc mô sẹo.
+ Tính chất mô sẹo.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D và BAP đến
khả năng hình thành mô sẹo của củ Nưa krausei.
Mảnh củ Nƣa krausei vô trùng kích thƣớc 0,3cm × 0,3cm vô trùng
đƣợc cấy vào môi trƣờng AMORC (1-4), với thành phần môi trƣờng là:
MS + 30 g/l đƣờng saccharose + 8g/l agar + 2,4D + BAP
Nồng độ 2,4D và BAP thay đổi theo bảng sau:
Bảng 2.1. Nồng độ 2,4D và BAP trong công thức môi trƣờng tạo mô sẹo
CTMT

Nồng độ 2,4D (mg/l)

Nồng độ BAP (mg/l)

ĐC


2,0

2,0

Sau 30 ngày nuôi cấy đánh giá khả năng tạo mô sẹo.
Thí nghiệm 3: Tái sinh cây từ mô sẹo
Mô sẹo tạo ra đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh cây AMORR
(1-4) gồm:
MS + 30g/l đƣờng saccharose + 8g/l agar + NAA + BAP
Trong đó, nồng độ NAA và BAP thay đổi nhƣ bảng sau:

22


Bảng 2.2. Môi trƣờng tái sinh cây từ mô sẹo
CTMT

Nồng độ NAA (mg/l)

Nồng độ BAP (mg/l)

ĐC

0

0

AMORB 1

0,2

Tổng số mẫu tái sinh

2.3.2.4. Tạo đa chồi
Nhân đa chồi là một bƣớc quan trọng trong quá trình nhân nhanh giống
cây trồng. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra cây giống sạch với số lƣợng
lớn, chồi phát triển khoẻ mạnh tạo cơ sở cho việc tạo cây hoàn chỉnh để trồng
ra vƣờn ƣơm. Trong nhân đa chồi, môi trƣờng nuôi cấy thƣờng đƣợc bổ sung
các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin hoặc tổ hợp giữa auxin
và cytokinin [9]. Tuy nhiên, mỗi loài thực vật lại thích hợp với một loại và
nồng độ chất kích thích sinh trƣởng khác nhau. Trong thí nghiệm này tôi thử
nghiệm với BAP ở các nồng độ khác nhau.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng
tạo đa chồi Nưa krausei.

23


Bảng 2.3. Môi trƣờng tạo đa chồi
Nồng độ BAP (mg/l)

CTMT
ĐC

0

AMORM1

0,5

AMORM2

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để
chuyển ra ngoài trồng tự nhiên. Cây con phải khỏe mạnh, sức đề kháng tốt
nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trƣờng bên ngoài. Các chất kích thích sinh
trƣởng có tác dụng tạo đa chồi đƣợc loại bỏ và thay vào đó là chất kích thích
sinh trƣởng tạo rễ nhƣ NAA, IBA, IAA...[1], [3].
Các chồi có kích thƣớc 3 - 4 cm, tách riêng từng chồi, cấy chuyển sang
môi trƣờng tạo rễ: MS + 30g/l đƣờng saccharose + 8g/l agar + NAA trong đó
nồng độ NAA thay đổi nhƣ bảng 2.4.
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ
Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến khả
năng tạo rễ của cây Nƣa krausei.
24


Bảng 2.4. Môi trƣờng ra rễ cây nƣa krausei
Nồng độ NAA (mg/l)

CTMT
ĐC

0

AMORN 1

0,2

AMORN 2

0,4


bất lợi.
Bầu trồng cây là túi nilon màu đen có đục lỗ thoát nƣớc, kích thƣớc
5 x 7 cm. Khi trồng cây Nƣa trong bầu cần chú ý tƣới đủ nƣớc lần đầu, sau đó
tƣới ẩm hàng ngày.
Các bầu Nƣa sau khi trồng đƣợc xếp vào các khay nhựa hoặc khay xốp,
kích thƣớc vừa phải để có thể dễ dàng di chuyển hoặc che đậy, độ sâu 10 - 15
cm, sau đó đƣợc đậy bằng túi nilon trong suốt có đục các lỗ nhỏ để chắn gió,

25