BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Mai Thị Trà Giang

KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC
VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,
KHÁNG NẤM CỦA CÁC DỊCH CHIẾT
TỪ CÂY TRINH NỮ (MIMOSA PUDICA L.)
VÀ QUẢ LỰU (PUNICA GRANATUM L.)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRƯƠNG THỊ ĐẸP
PGS.TS. NGUYỄN ĐINH NGA

Thành phố Hồ Chí Minh - 2014


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố
trong bất kì công trình nào.
Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu
tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định.

TP. Hồ Chí Minh, ngày

tháng



MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI .................................................................................................1
II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................................2
III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................2
IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU .....................................................................................2
V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU .........................................................................................2
VI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN ................................3
Chương 1. TỔNG QUAN ..............................................................................................4
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU .............................................4
1.1.1. Cây Trinh nữ ......................................................................................................4
1.1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................4
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ......................................................................................4
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái ........................................................................................4
1.1.1.4. Bộ phận dùng ..............................................................................................5
1.1.1.5. Thành phần hóa học ....................................................................................5
1.1.1.6. Tính vị, tác dụng .........................................................................................5
1.1.1.7. Công dụng ...................................................................................................5
1.1.2. Cây Lựu .............................................................................................................6
1.1.2.1. Vị trí phân loại ............................................................................................6
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái ......................................................................................6
1.1.2.3. Phân bố, sinh thái ........................................................................................6
1.1.2.4. Bộ phận dùng ..............................................................................................7

1.5.3.3. Nhiệt độ và thời gian ủ ..............................................................................17
1.5.3.4. Điểm dừng đọc kết quả .............................................................................18


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................19
2.1. VẬT LIỆU ..............................................................................................................19
2.1.1. Vật liệu khảo sát về thực vật học .....................................................................19
2.1.2. Vi sinh vật thử nghiệm.....................................................................................19
2.1.3. Môi trường thử nghiệm ....................................................................................19
2.1.4. Nguyên liệu ......................................................................................................21
2.1.5. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................................21
2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM ................................................................22
2.2.1. Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học .....................................................22
2.2.1.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................22
2.2.1.2. Đặc điểm giải phẫu....................................................................................22
2.2.2. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu .............................................................23
2.2.2.1. Chiết xuất cao thô......................................................................................23
2.2.2.2. Thăm dò dung môi chiết xuất ...................................................................23
2.2.3. Phương pháp tinh chế cao toàn phần ...............................................................24
2.2.3.1. Phương pháp tinh chế cao toàn phần 1 .....................................................24
2.2.3.2. Phương pháp tinh chế cao toàn phần 2 .....................................................24
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của cao dược liệu.............25
2.2.4.1. Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm ...............................................................25
2.2.4.2. Phương pháp khuếch tán ...........................................................................27
2.2.4.3. Phương pháp pha loãng .............................................................................28
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................30
3.1. KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC .............................................................30
3.1.1. Cây Trinh nữ ....................................................................................................30
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái ....................................................................................30
3.1.1.2. Đặc điểm giải phẫu....................................................................................31


Dichloromethan

DMSO

Dimethyl sulphoxide

EtOAc

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

MHA

Mueller - Hinton Agar

MHB

Mueller - Hinton Broth

SDA

Sabouraud Dextro Agar



DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu .......................................................... 23
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 1 ................................................... 24
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế cao toàn phần 2 ................................................... 25
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm ........................................ 26
Hình 2.5. Tác động kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán ....................... 28
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình xác định tác động kháng vi sinh vật bằng phương pháp
pha loãng ................................................................................................... 29
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ............................... 33
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ............................... 34
Hình 3.3. Cấu tạo giải phẫu rễ cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ............................. 35
Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu thân cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ......................... 36
Hình 3.5. Cấu tạo giải phẫu lá chét cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ...................... 37
Hình 3.6. Cấu tạo giải phẫu cuống lá Trinh nữ (Mimosa pudica L.) ......................... 38
Hình 3.7. Đặc điểm hình thái quả và hạt Lựu (Punica granatum L.) ........................ 40
Hình 3.8. Cấu tạo giải phẫu vỏ quả Lựu (Punica granatum L.) ................................. 41
Hình 3.9. Cấu tạo giải phẫu hạt Lựu (Punica granatum L.) ...................................... 42
Hình 3.10. Kết quả tác động kháng S. aureus của cao chiết thô từ cây Trinh nữ
và vỏ quả Lựu ........................................................................................44
Hình 3.11. Kết quả kháng S. aureus của cao tinh chế từ cây Trinh nữ bằng cách
tủa qua MeOH ...................................................................................... 46
Hình 3.12. MIC của cao chiết cây Trinh nữ trên S. aureus ........................................ 47
Hình 3.13. Kết quả tác động kháng S. aureus (A) và MRSA (B) của cao chiết
thô từ quả Lựu ....................................................................................... 48
Hình 3.14. Kết quả tác động kháng S. faecalis (A) và E. coli (B) của cao chiết
thô từ vỏ quả Lựu và cây Trinh Nữ .......................................................49
Hình 3.15. Kết quả tác động kháng C. albicans của cao chiết thô từ vỏ quả Lựu

họ Đậu (Fabaceae). Theo y học cổ truyền, lá và rễ có khả năng chống vi khuẩn, trị lậu.
Cây Trinh nữ thường dùng trị suy nhược thần kinh, viêm phế quản, viêm gan, viêm kết
mạc. Cây dùng ngoài có khả năng trị chấn thương, viêm mủ da,... [4], [10].
Cây Lựu có tên khoa học là Punica granatum L., thuộc họ Lựu (Punicaceae).
Các bộ phận của cây Lựu có khả năng chữa nhiều bệnh. Vỏ quả có tác dụng sáp


2

trường chỉ tả, chỉ huyết, khử trùng. Vỏ thân và vỏ rễ có tác dụng khử trùng, trừ sán.
Trái chống nhiều siêu khuẩn,... [9].
Tính tới thời điểm hiện tại, trên thế giới cũng đã có một số công bố về sàng lọc
và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chất chiết từ cây Trinh nữ và
cây Lựu. Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có các công bố nào liên quan đến hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm ở cây Trinh nữ và quả Lựu.
Chính vì vậy, đề tài "Khảo sát về mặt thực vật học và thử hoạt tính kháng
khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết từ cây Trinh nữ (Mimosa pudica L.) và quả
Lựu (Punica granatum L.)" được thực hiện nhằm mô tả đặc điểm thực vật, khảo sát
hoạt tính kháng vi sinh vật của cao chiết của cây Trinh nữ và quả Lựu.
II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Sàng lọc những dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm; góp phần xây
dựng thư viện dữ liệu và nghiên cứu cơ bản về các cao chiết có khả năng kháng vi sinh
vật có nguồn gốc từ thực vật.
III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1. Trinh nữ (Mimosa pudica L.).
2. Quả Lựu (Punica granatum L.).
IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
1. Khảo sát đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Trinh nữ và quả Lựu.
2. Xác định bộ phận sử dụng của cây Trinh nữ và quả Lựu cho hoạt tính kháng vi
sinh vật.

1.1.1. Cây Trinh nữ
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Vị trí phân loại của cây Trinh nữ [7]
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae)
Bộ: Đậu (Fabales)
Họ: Đậu (Fabaceae)
Phân họ: Trinh nữ (Mimosoideae)
Chi: Trinh nữ (Mimosa)
Loài: Mimosa pudica L.
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây nhỏ, phân nhánh nhiều, mọc thành bụi lớn, cao 30 – 40 cm. Thân cành lòa
xòa, uốn éo, có lông và gai hình móc. Lá kép lông chim chẵn hai lần, những cuống phụ
xếp như hình chân vịt, khẽ đụng vào là cụp lại. Mỗi lá mang 15 – 20 đôi lá chét.
Hoa màu tím đỏ, nhỏ, tập hợp thành hình đầu, có cuống chung dài, ở nách lá; đài
nhỏ hình dấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh; bầu 4 noãn. Cụm
quả hình ngôi sao, quả thắt lại giữa các hạt, có nhiều lông cứng. Quả dài 1 – 2 cm,
đốt 2 – 4 [4], [6].
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái
Chi Mimosa L. có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt
đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á. Về nguồn gốc chung của loài Trinh nữ (Mimosa
pudica L.) có xuất xứ từ vùng châu Mỹ nhiệt đới. Ở Việt Nam, Trinh nữ phân bố rải
rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi độ cao dưới 1000 m [4].


5

Trinh nữ thuộc loại cây thảo sống một năm. Ra hoa tháng 6 – 10, có quả từ tháng

1.1.2. Cây Lựu
1.1.2.1. Vị trí phân loại
Vị trí phân loại của cây Lựu [7]
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae)
Bộ: Sim (Myrtales)
Họ: Lựu (Punicaceae)
Chi: Lựu (Punica)
Loài: Punica granatum L.
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
Cây nhỏ hay cây nhỡ, cao tới 5 – 6 m. Thân thường sần sùi, màu xám, có vỏ
mỏng. Rễ trụ khỏe, hóa gỗ, dạng con thoi, màu nâu đỏ ở ngoài, màu vàng nhạt ở trong.
Cành mảnh đôi khi có gai. Lá đơn, nguyên, mọc đối nhưng thường tụ họp thành cụm
nhiều lá, cuống ngắn, hình mác thuôn, dài 5 – 6 cm, rộng 1 – 2 cm, gốc thuôn, đầu tù
hoặc hơi nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng; lá kèm rất nhỏ, hình chỉ [5], [9].
Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp thành cụm 3 – 4 cái ở ngọn cành. Hoa có 5 – 6 lá
đài hợp ở gốc; tràng 5 – 6 cánh màu đỏ hoặc vàng, loại trắng là bạch lựu, nhị rất nhiều;
bầu có 2 tầng, tầng trên 6 – 7 ô, tầng dưới 3 – 4 ô; noãn nhiều [4].
Quả mọng, có vỏ dày, tròn, phía trên có đài tồn tại, khi chín màu vàng đốm đỏ
nâu. Quả có vách ngang chia thành 2 tầng, các tầng này lại chia ra các ô chứa nhiều
hạt; hạt màu hồng có vỏ ngoài mọng nước [4], [10].
1.1.2.3. Phân bố, sinh thái
Lựu gốc ở Tây Á, được trồng nhiều ở Bắc Phi, hiện nay được trồng rộng rãi khắp
các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, đặc biệt ở các nước vùng Nam Á, Đông Nam Á,
Trung Quốc và Nhật Bản. Ở Việt Nam, lựu được trồng nhiều ở các tỉnh phía nam và
một số tỉnh ở đồng bằng trung du Bắc Bộ.
Lựu có biên độ sinh thái rộng, về mùa đông có thể chịu được nhiệt độ -10 0C và ở
nhiệt độ cao đến 40 0C về mùa hè. Nhìn chung, cây thích nghi nhất ở khí hậu nóng và

nhiều siêu khuẩn [4], [9].


8

1.2. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY
TRINH NỮ VÀ CÂY LỰU
1.2.1. Cây Trinh nữ
Rajendran Rekha (2009) đã nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa thực vật và hoạt
tính kháng khuẩn của chất chiết xuất khác nhau (n-hexan, chloroform, ethyl acetate,
methanol và tỉ lệ methanol khác nhau (I đến VIII)) của lá cây Trinh nữ. Hoạt tính
kháng khuẩn được đánh giá theo phương pháp pha loãng trong thạch Mueller Hinton.
Kết quả cho thấy, nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) của các chất chiết xuất trên các
chủng vi sinh vật thử nghiệm (S. aureus, Coagulase Negative Staphylococca, E. coli,
K. pneumoniae, P. aeuroginosa, S. typhi, S. typhi A, S. typhi B, Vibrio, E. cocci và
C. albicans) được xác định là 133,33 µg/ml. Chiết xuất n-hexan và chiết xuất ethyl
acetate có MIC > 133,33 µg/ml. Hỗn hợp dung môi chloroform – methanol (50:50) và
chloroform – ethyl acetate (75:25) có MIC là 33,33 µg/ml.
Trong lá cây Trinh nữ chứa các hợp chất có thể đã góp phần vào tác động chống vi
khuẩn như: alkaloid, carbohydrate, steroid, flavonoid và glycosides [25].
Suriya J. và cộng sự (2012) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất
methanol của lá cây Trinh nữ (Mimosa pudica), Abutilon indicum, Hygrophila spinosa
bằng phương pháp khuếch tán và xác định nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) bằng
phương pháp pha loãng. Tác động kháng khuẩn được thực hiện trên các chủng vi
khuẩn: E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. cereus, P. vulgaris, E. faecalis,
K. pneumoniae, Vibrio cholerae, S. typhi và S. paratyphi. Kết quả nghiên cứu cho
thấy: MIC của các chất thử dao động từ 0,2 đến 0,9 mg/ml tuỳ loài vi khuẩn [27].
Arokiyaraj S. và cộng sự (2012) phân tích thành phần hoá học và nghiên cứu
hoạt tính kháng vi khuẩn của chiết xuất methanol của lá cây Trinh nữ bằng phương
pháp khuếch tán trên hai vi khuẩn Gram dương (S. aureus, B. subtilis) và bốn vi khuẩn

C. albicans và Cryptococcus sp. Phân tích chiết xuất methanol từ lá cho thấy sự hiện
diện của carbohydrate, đường, sterol, glycosides, phenol, tanin, chất flavonoid, protein
và saponin. Tổng số chất tiềm năng chống oxy hóa của các chất chiết xuất methanol và
dung dịch nước tương đương là 2,26 mg và 1,06 mg acid ascorbic [19].
Neveen A. Hassan và cộng sự (2013) đã thử hoạt tính kháng khuẩn của 32 quả
Lựu thu từ bốn vùng khác nhau ở Ai Cập (Assiut, Siwa Oasis, Ismailia and North
Saini). Các chất chiết xuất ethanol được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán, trên
các chủng vi khuẩn: Gram âm (E. coli, P. aeruginosa, X. campestris, E. cartovora),
Gram dương (S. aureus, S. faecalis). Theo khảo sát này, các chất chiết xuất ethanol


10

của quả Lựu có tác dụng ức chế mạnh đối với tất cả các vi sinh vật thử nghiệm. Kết
quả cũng cho thấy, cao chiết của các quả Lựu thu được từ Assuit và Bắc Saini có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh mẽ [24].
Kannaiyan Moorthy và cộng sự (2013) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và
kháng nấm in vitro và phân tích thành phần hoá học của chiết xuất ethanol từ vỏ quả
Lựu. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 21 chủng vi sinh vật (19 loại vi khuẩn và 2
loại nấm) bằng phương pháp khuếch tán, phương pháp pha loãng. Chiết xuất ethanol
của vỏ quả cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể: Y. enterocolitica (25,8 mm),
S. epidermidis (24,6 mm), S. enterica (21,2 mm), B. cepacia (19,4 mm), S. aureus
(19,2 mm), S. paratyphi A (18,8 mm), S. typhimurium (18,6 mm), E. coli (18,4 mm) và
P. aeruginosa (18,2 mm). Dựa vào phương pháp pha loãng, nồng độ tối thiểu ức chế
(MIC) của chiết xuất ethanol từ vỏ quả là 512 µg/ml đối với S. epidermidis và
Y. enterocolitica và 1,024 µg/ml đối với S. aureus, S. mutans, S. paratyphi A,
S. typhimurium, S. Brunei, P. aeruginosa và B. cepacia. Tác dụng ức chế có thể là do
sự hiện diện của một số các chất chuyển hóa thứ cấp như các hợp chất phenolic,
flavonoid, terpenoid, phytosterol, glycosides và tanin phát hiện trong chiết xuất
ethanol của vỏ quả [21].

S. aureus đề kháng methicillin mắc phải từ cộng đồng (CA-MRSA) gần đây đã được
cảnh báo trong cộng đồng có thể gây nhiễm trùng cho trẻ em, những cá thể khỏe mạnh
mà không tiếp xúc bệnh viện.
Nhiễm MRSA gây khó khăn cho điều trị bởi vì MRSA thường kháng các kháng
sinh β-lactam phổ rộng bao gồm methicillin và những kháng sinh khác. MRSA cũng
có nguy cơ kháng vancomycin, là “thuốc của phương sách cuối cùng” cho việc điều trị
những MRSA kháng đa kháng sinh. Hai trường hợp đầu tiên có mức độ cao S. aureus
kháng vancomycin được thông báo từ Mỹ năm 2004 [15].
Tại Việt Nam, việc sử dụng kháng sinh bừa bãi và không hợp lí dẫn đến sự gia
tăng đề kháng ở các chủng S. aureus. Hiện nay, MRSA cũng đang là nguồn lây lan
chính tại các bệnh viện ở Việt Nam.
Theo “Báo cáo hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh
thường gặp ở Việt Nam năm 2004”, tỷ lệ S. aureus đề kháng oxacillin đã khá cao,
vancomycin còn có tác dụng rất tốt, song nó chỉ nên được dùng khi S. aureus kháng
oxacillin.


12

1.3.3. Streptococcus faecalis
S. faecalis là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình cầu hoặc oval kéo dài, đường
kính khoảng 0,6 – 0,8 µm, xếp liên tiếp với nhau thành từng chuỗi dài ngắn khác nhau
và có thể đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám. Chúng không di động, không
sinh bào tử.
S. faecalis là vi khuẩn thường trú ở đường tiêu hoá của người. Ngoài ra, chúng có
thể cư trú trong đường tiêu hoá của gia cầm, gia súc, lợn, chó, ngựa, cừu, dê. Đây là
một trong số các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện như nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm
nội tâm mạc, các nhiễm khuẩn ngoài ổ bụng. Nhiễm khuẩn huyết ít khi xảy ra nhưng
nếu có thường rất nặng, xảy ra sau phẫu thuật hoặc liên quan đến tình trạng miễn dịch,
hầu hết các nhiễm khuẩn huyết là nội sinh hoặc nhiễm khuẩn chéo xảy ra trong bệnh

1.3.6. Candida albicans
C. albicans là nấm men nội hoại sinh ở da và niêm mạc người, thường sinh sản
bằng cách nảy chồi. Hình dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục sang dạng sợi.
C. albicans thường sống vô hại ở màng nhầy (miệng, ruột, âm đạo) của người và
động vật máu nóng. Trong một số điều kiện nhất định, vi nấm chuyển sang trạng thái
kí sinh gây bệnh. Số lượng vi nấm tăng lên đáng kể, có sự thành lập sợi tơ nấm giả.
Sợi nấm giả thường chiếm đa số khi vi nấm kí sinh gây bệnh ở những mô sâu. Ở vết
thương ngoài da, số lượng nấm men nảy chồi chiếm ưu thế hơn sợi tơ nấm giả [12].
C. albicans gây nên các bệnh về da như viêm và được tìm thấy nhiều hơn ở
những bệnh nhân viêm da dị ứng, tuy nhiên C. albicans không phải là tác nhân gây
bệnh. Trên da, nấm thường xuất hiện nhất là ở các kẽ giữa các ngón tay, ngón chân,
đặc biệt là trong môi trường ẩm ướt. Nấm Candida còn thường gặp cả ở trẻ đang bú,
phía ngoài lớp da bị nấm thường bị sần chợt xuất hiện các vết loét tổn thương, ngứa,
đau, rát [12].
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU
1.4.1. Phương pháp chiết lạnh
Dung môi tinh khiết cho vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ
nguyên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm
vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên.
Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định
trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan
thêm được nhiều hơn [13].
Nguyên tắc: chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị phức tạp.
Nhược điểm: Lượng dung môi dùng nhiều, mất thời gian.


14

Ngoài ra, có thể chiết xuất dược liệu bằng phương pháp chiết ngấm kiệt. Đây là


15

dịch nhanh chóng phân thành hai lớp. Cũng có thể phá bọt bằng cách ly tâm
dung dịch [11], [13].
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
1.5.1. Phương pháp khuếch tán
1.5.1.1. Nguyên tắc
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một chất được xác định dựa trên sự
khuếch tán của chất thử thể hiện qua vòng kháng khuẩn hoặc kháng nấm xung quanh
một đĩa giấy đặt trên mặt thạch hoặc một lỗ cắt từ thạch. Đường kính vòng kháng
khuẩn, kháng nấm được dùng để đánh giá hoạt lực của chất thử [17], [20].
Ưu điểm: So với phương pháp pha loãng, phương pháp khuếch tán đơn giản, dễ
thực hiện, giúp phát hiện vi sinh vật kháng thuốc dễ dàng và giá thành rẻ hơn.
Nhược điểm: Phương pháp này đòi hỏi phải tìm được dung dịch đệm và môi
trường để chất thử khuếch tán tốt. Nếu chất thử khó khuếch tán vào trong bản thạch sẽ
làm kết quả không ổn định. Mặt khác chưa có tiêu chuẩn đánh giá thống nhất đường
kính vòng vô khuẩn nên kết quả nhận được chỉ mang tính tương đối [20].
NCCLS đã công bố phương pháp đĩa giấy chuẩn NCCLS M18 dùng cho vi
khuẩn và NCCLS M44 dùng cho nấm men vào năm 2003.
1.5.1.2. Một số phương pháp thường được sử dụng
• Phương pháp đặt đĩa giấy
Dùng đĩa giấy có tẩm chất thử đặt trên bản thạch có tráng sẵn một lớp vi khuẩn
hoặc lớp huyền dịch nấm. Chất thử sẽ khuếch tán vào bản thạch, nếu có hoạt tính
kháng khuẩn hoặc kháng nấm sẽ tạo ra một vòng ức chế sự phát triển của vi khuẩn
hoặc vi nấm này.
• Phương pháp ống trụ
Chất thử được đặt trong ống hình trụ, đặt vào bản thạch có tráng sẵn một lớp vi
khuẩn hoặc lớp huyền dịch nấm, chất thử sẽ khuếch tán vào trong bản thạch. Nếu có
tác dụng sẽ ức chế vùng xung quanh nơi đặt chất thử.