BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH
TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY
TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003-2007
Sinh viên thực hiện: CAO THỊ THANH LOAN
TS. TRẦN THỊ LỆ MINH CAO THỊ THANH LOAN
ThS. NGUYỄN VĂN CƢỜNG
Thành phố Hồ Chí Minh
2007
iii LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực
tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
- TS. Trần Thị Lệ Minh và Th.S Nguyễn Văn Cƣờng đã tận tình hƣớng
dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- TS. Phan Phƣớc Hiền và các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc
Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
- KS. Trần Ngọc Hùng cùng các anh chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh
học Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm phân tích
thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Tp.HCM trên đối tượng cây Trường xuân hoa.
Tiến hành tạo cây Trường xuân hoa in vitro từ chồi cây Trường xuân hoa trồng
trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học.
Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS
có bổ sung NAA được theo dõi ở các giai đoạn 7, 14, 21, 28, 35 ngày. Bên cạnh đó
thay đổi nồng độ NAA, IAA sử dụng nhằm chọn loại chất kích thích tăng trưởng
thích hợp thông qua các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ;
xác định sự tạo thành indol alkaloid trong cây in vitro bằng thuốc thử Wagner qua
hiện tượng tạo kết tủa với thuốc thử. Bằng hệ thống điện di mao quản, thực hiện
phân tích và định lượng các alkaloid đặc trưng của cây Trường xuân hoa in vitro
như catharanthine, vindoline…
Những kết quả thu được:
Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro: sử dụng NAA 0,5
mg/l và IAA 1 mg/l có tác động tốt lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ
của cây.
Định tính indol alkaloid bằng thuốc thử Wagner: các kết quả định tính cho
thấy có sự hiện diện của indol alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân
v
hoa in vitro. Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28
ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l.
Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro
bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây
Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline
của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày
nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA
0,5 mg/l.
Trang tựa ............................................................................................................. i
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt ................................................................................................................. iv
Summary .............................................................................................................. vi
Mục lục ................................................................................................................. vii
Danh sách các bảng ............................................................................................. xi
Danh sách các hình và sơ đồ............................................................................... xiii
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. xv
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây ....................................................................... 3
2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp ......................................................... 3
2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ..................................................................... 4
2.2. Alkaloid ......................................................................................................... 4
2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus ............ 7
2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa ......................................................... 7
2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa ................... 8
2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa .......................................... 9
2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................. 13
2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa............................................... 13
2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh .............. 14
2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp ............................. 15
2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 15
viii
ix
3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự
sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro ................................................. 26
3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 26
3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 26
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 26
3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ............................................................... 26
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 27
3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ......................... 27
3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA
đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .......................................... 27
3.3.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 29
3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng
xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA .......................................................... 29
3.4.1. Vật liệu ....................................................................................................... 29
3.4.1.1. Mẫu kiểm tra ............................................................................................ 29
3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 29
3.4.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 30
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây
Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ................................................ 30
3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây
Trường xuân hoa .................................................................................................. 31
3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây
Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo ................................... 31
3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây
Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE ......................................... 32
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l..................................... 35
Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36
Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 37
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 38
Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa
in vitro bằng thuốc thử Wagner ............................................................................ 41
Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 43
Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 46
Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và
mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE ................................... 50
N2
N3
N1
I2
xii
Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE .................. 53
Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy ........................................... 54
Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo tươi ................................................................................ 49
Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo khô ................................................................................ 50
xiv
Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây
Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. ................................................................... 52
Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây
Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi ..................................................................... 52
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi ................................ 33
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô ................................ 34
Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích
cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 ......................................................... 51
Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa
cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo ......................................................... 53
xv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TDC : Tryptophan decarboxylase
STR : Strictosidine synthase
TIA : Terpenoid indole alkaloid
EOF : electroosmosis flow
CE : Capillary electrophoresis
Thực vật bậc cao được coi là nguồn nguyên liệu quý giá để cung cấp các
hợp chất thứ cấp đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan trọng
đối với ngành công nghiệp dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có
giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Hiện nay,
trên toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang phải sống chung với căn bệnh này và
mỗi năm có thêm khoảng 11 triệu trường hợp mắc bệnh mới. Trong khi đó các loại
thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hướng của
thế giới hiện nay là nghiên cứu nhằm tìm phương pháp gia tăng lượng alkaloid ở
các cây thảo dược để làm hạ giá thành của thuốc.
Cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) là một trong các loại thực vật
có khả năng sản xuất các indol alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo
thuốc chống ung thư như vinblastine và vincristine. Nhưng các chất này lại có hàm
lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật và không thể tổng hợp được bằng con đường
hóa học, do có cấu trúc phức tạp. Vì vậy, phương pháp bán tổng hợp vinblastine từ
sự kết hợp tiền chất vindoline với catharanthine là hết sức hữu hiệu, vì vindoline là
một nguồn dồi dào trong cây Trường xuân hoa và catharanthine có thể đạt nồng độ
cao trong cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô. Điều này có thể thực hiện được thông
qua việc sử dụng các tác nhân kích thích như nấm và chất hóa học. Hiện nay, việc
sản xuất catharanthine nhờ nuôi cấy mô vẫn còn quá thấp để tiến tới sản xuất công
nghiệp. Bên cạnh đó, các alkaloid chỉ được tổng hợp trong những loại tế bào đặc
trưng và vào những giai đoạn phát triển đặc biệt, điều này làm cho việc chiết xuất
chúng gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn lọc các phương pháp và thời gian nuôi
cấy hiệu quả là một trong những con đường quan trọng và thiết thực để gia tăng sức
sản xuất các tiền chất như catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro.
2
Chính vì tầm quan trọng của các indol alkaloid trong việc điều trị bệnh và tính cấp
thiết của việc gia tăng các hợp chất thứ cấp có giá trị này nên chúng tôi thực hiện đề tài
vật. Các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ
cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật [7].
2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp không có chức năng rõ ràng như các hợp chất sơ cấp nhưng
thường có vai trò sinh thái học: góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho
quá trình thụ phấn của cây, giúp cho cây thích nghi được với những điều kiện khắc
nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng, các loại vi sinh vật
và những động vật ăn mồi khác, như là cỏ ba lá hay cỏ đinh lăng có tác dụng như
estrogen làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của động vật ăn cỏ [17]. Thậm chí là
chúng còn ức chế sự phát triển của các thực vật khác bởi vì nhiều hợp chất thứ cấp
có độc tính đối với thực vật. Vì vậy so với các chất sơ cấp, hợp chất thứ cấp được
xem là nguồn nguyên liệu đặc biệt quý giá từ thực vật [14].
Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau: chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị và màu sắc cho các
món ăn, đặc biệt hiện nay vấn đề sức khỏe rất được quan tâm do đó ngày càng nhiều
các chất có nguồn gốc tự nhiên đang có xu hướng thay thế các chất tổng hợp làm
4
phụ gia trong thực phẩm. Bên cạnh đó các tinh dầu thơm của thực vật còn tham gia
vào thành phần quan trọng của nước hoa. Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong
lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật
có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virút…, vì có nguồn gốc từ tự nhiên
nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái. Bởi vì
có hoạt tính sinh học dồi dào, nên các hợp chất thứ cấp từ lâu đã được sử dụng làm
thuốc trong y học cổ truyền, và ngày nay chúng vẫn là nguồn nguyên liệu có giá trị
trong bào chế dược phẩm. Một số chất thứ cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc
có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để bào chế thuốc chống ung thư,
hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin, quinidin được dùng làm thuốc
* Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi
hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong
nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Ở pH thấp alkaloid sẽ
thêm vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ.
Tính tan của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây,
trong phân tích các loại alkaloid, và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng
thuốc phù hợp.
* Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện tử.
Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính
acid yếu. Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối.
Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng:
alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa
với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff (potassium bismuth iodide
solution).
Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền; tuy vậy, một số hợp chất thuộc
loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác nhân
oxi hóa [27].
* Phân loại: do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng
được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi các alkaloid được
chia thành 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (pseudoalkaloid).
Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ,
thường chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ
6
amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối
của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicine, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các
alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của
chúng (ornithine, lysin, phenilalanine, tryptophan, histidine, acid antranilic…) hơn
để tìm ra phƣơng thức tăng cƣờng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp.
TIA gồm có hai thành phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một
nhóm terpenoid có nguồn gốc từ iridoid glucoside secologanin [10]. Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid với sự tham gia
của các enzym TDC: tryptophan decarboxylase, STR: strictosidine synthase [32].
2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus
2.3.1. Nguồn gốc của cây Trƣờng xuân hoa [23, 33]
Nguồn gốc phân loại [33]
Giới : Thực vật
Giới phụ : Tracheobionta
Ngành : Magnoliophyta
Ngành phụ : Spermatophyta
Lớp : Magnoliopsida
Ở Việt Nam, Trường xuân hoa là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên
tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển,
Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa
9
tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng
Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển,
Trường xuân hoa có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao,
trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát
ven biển. Trường xuân hoa còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm
thuốc. Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình,
Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa.
Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Môi trường ven biển cũng là nơi
mọc tập trung của Trường xuân hoa ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin,
Malaysia, Thái Lan. Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây
bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1.500m. Trường xuân hoa là loại cây ưa
sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt (ở Hà Nội -
vườn hoa, nông trường Đồng Gia - Ninh Bình, 1972) và ở Tuy Hòa hiện nay. Cây
sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây
mọc từ thiên nhiên. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả sau
4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe.
Nguồn Trường xuân hoa mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm
1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần
đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng
chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [23].
Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline
như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng
chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005% - 0,015%
trong lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá.
Copyright: Tài liệu đại học ©