TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM


HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THỰC TẬP

MÔN VI SINH ĐẠI CƯƠNG

GV: Lưu Huyền Trang

TP.HỒ CHÍ MINH 12/2015


BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

I.

Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật?

-

Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

-

Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

-

Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt


Máy lắc (trộn đều): lắc ngang ho ặc lắc vòng, để tăng lượng oxy hòa tan hoặc tăng khả

năng vi sinh vật tiếp xúc với cơ chất.
-

Máy đo pH: đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật (đo trước khi cho agar

vào).
-

Cân: vệ sinh cân trước và sau khi dùng, khi cân chú ý đơn vị đo.

-

Máy ly tâm (centrifuge): thu sinh khối vi sinh vật. Các ống ly tâm cần đặt đối xứng và

nhất thiết có khối lượng bằng nhau.
-

Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (flux laminar): có không gian vô trùng được sử dụng để

thao tác với sinh, bao gồm:
o

Đèn UV: khử trùng khí bề mặt trongb tủ
2


o


Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vật trong quá trình

nghiên cứu.
o

Hộp lồng (đĩa petri): dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái , đ ặc điểm nuôi cấy và

phân lập của tế bào vi sinh vật.
o

Que gạt (que trải): là dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa.

o

Que cấy, co 3 loại: que cấy đầu tròn (vi khuẩn, nấm men), que cấy nhọn (cấy sâu trên môi

trường rắn), que cấy móc (khuẩn ty, đoạn tơ nấm).
o

Micro pipette: dùng khi cần hút một lương chính xác môi trường sử dụng trong định

lượng vi sinh vật.
o

Pipette Pasteur:dùng để lấy dung dịch môi trường nuôi cấy

III. Trình bày phương pháp tiêt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?
1. Phương pháp lí học:
-

Phương pháp Pasteur:chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (kí sinh), không diệt bào tử và vi khuẩn

hoại sinh. Phương phấp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi sinh vật
đối kháng mạnh nhất. Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại vi sinh
vật. Phương pháp này thường dùng nhiệt độ 70-75 oC trong thời gian 10-15 phút.


Phương pháp Tyndalll: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-80o C, mỗi lần 30-60

phút và liên tiếp trong 3 ngày liền.


Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Nhiệt độ và thời gian

hấp tùy thuộc vào loại nguyên liệu cần hấp. Thường dùng nhất ở nhiệt độ 121 oC trong
thời gian 15-30 phút.

-

Diệt trùng bức xạ:



Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật.



Tia âm cực:dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử

trùng phải bao gói kín.

4


BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI SINH VẬT
I.

Khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Khái niệm
Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.
Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ
duy trì thế oxy hóa - khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của môi trường
Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
 Phân loại theo nguồn gốc:
-Môi trường tự nhiên: dịch nước thịt, máu động vật, nước chiết khoai tây,..
-Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB,..
-Môi trường bán tự nhiên: PGA, giá đậu đường,..
- Môi trường bán tổng hợp: BPA,...
 Phân loại theo trạng thái vật lý:
-Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay chất làm giá thể khác trong thành phần
môi trường
-Môi trường bán lỏng: có 0.5% agar hay chất làm giá thể
-Môi trường rắn: có chứa 1.5 - 2% agar hay chất làm giá thể
-Môi trường bán rắn: cơm nguội, đậu,..
 Phân loại theo công dụng
-Môi trường tiền tăng sinh
-Môi trường tăng sinh
-Môi trường phân lập
5

Bước 7 :Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đia petri
Bước 8:kiểm tra độ vô trùng và bảo quản
III. Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch
đứng
 Đĩa petri: môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng. Thể tích
môi trường khoảng 12 - 15ml mỗi đĩa và lớp môi trường thạch dày khoảng 2mm.
 Ống nghiệm thạch nghiêng: lượng môi trường phân phối vào chiếm 1/4 thể tích ống
nghiệm. Sau khi phân phối môi trường vào ống nghiệm, ống nghiệm phải được đặt
nghiêng cố định trên giá đỡ. Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy 3 - 5cm. Phần đáy
phải có một phần thạch đứng 0,5-1cm.
 Ống nghiệm thạch đứng: lượng môi trường phân phối vào chiếm 1/3 - 1/2 thể tích
của ống nghiệm. Sau đó để yên trên giá cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.
IV. Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử
trùng?
-

Không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng vì:

+ Chiều cao đĩa rất thấp, khi ta cho môi trường vào rồi tiến hành hấp khử trùng sẽ làm
cho môi trường trong đĩa bị trào ra ngoài, dẫn đến môi trường bị đục và khó quan sát
được vi sinh vật.
+ Môi trường bị trào ra ngoài khi hấp sẽ ảnh hưởng đến chất lượng môi trường. Bên
cạnh đó, môi trường dễ bị nhiễm những vi sinh vật không mong muốn, lượng môi
trường trong đĩa giảm ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy và việc quan sát.
V. Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ng ửa? Tại
sao?
Đĩa petri chứa môi trường trước khi nuôi cấy vi sinh vật nên để ngửa để có thể làm kín
khu vực nuôi cấy, tránh bị vi sinh vật lạ rớt ngoài không khí vào và tránh sự bốc hơi
7




Cấy truyền nấm mốc
8


- Thực hiện các thao tác tương tự giống như cấy truyền vi khuẩn, nấm men chỉ khác
đối với nấm mốc, khi cấy trên ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que móc vô trùng l ấy
bào tử từ ống giống. Cấy truyền bào tử từ ống nghiệm môi trường mới theo hai cách:
+ Cấy điểm: Cắm ngập đầu que cấy thành ba điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch.
+ Cấy gõ: Đưa que que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng
que cấy vào thành ống nghiệp đối diện với mặt thạch để rãi bao tử xuống.

Cấy truyền trên thạch đĩa
-Dùng que cấy đầu tròn , hoặc que trải thủy tinh
-Dùng que cấy tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách
-Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó để cách đền cồn
chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp(phần hơ lửa), sao cho vừa đủ để cho que
cấy vào.
- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy bề mặt thạch theo một trong các kiểu sau:
+ Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch
+ Theo những đường song song
+ Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc
-

Khi dùng que trải, hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên bề mặt

thạch đĩa. Khử trùng que trải thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên ngọn lửa.
Làm nguội que trải và trải đều giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường
thạch đĩa.

-

Hạn chế việc hơi nước đọng trên nắp rơi xuống làm hỏng khuẩn lạc nuôi cấy, làm

nhiễm , hư môi trường.
-

Hạn chế một phần tạp nhiễm trong thời gian nuôi cấy do phần đáy nặng có xu

hướng úp từ trên xuống nên đậy kín đĩa thạch.
-

Dễ dàng cầm nắm, vận chuyển đĩa thạch mà không bị rơi nắp bất ngờ làm môi

trường bị nhiễm.
-

Riêng đối với nấm mốc thì nên để ngửa, tránh bào tử rơi khỏi môi trường(khi để úp

có khả năng bào tử rơi xuống dưới và mộc lum tum, bị nhiễm).
IV. Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, ta phải ria que cấy ngược
từ đáy ống nghiệm lên phía trên.
-

Ria từ dưới lên, que cấy sẽ theo chiều từ dưới đi lên và ra khỏi ống nghiệm mà

không cần di chuyển qua đường đã cấy.(trường hợp cấy từ trên xuống lúc kéo que c ấy ra
dễ rớt vi sinh vật vào lúc vi sinh vật mọc không trên đường cấ khó xác định là bị nhiễm
vi sinh vật lạ hay chính vi sinh vật muốn cấy rớt vào ).
-

-

loại ống đôi và ống đơn. (Bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất ngắn, dùng để
tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát)
Vật kính: là 1 bộ phận của kính hiển vi quay về phía có vật mà người ta muốn

-

quan sát, có 3 độ phóng đại chính của vật kính:x4, x10, x40, x100. (Bản chất là một
thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trò như kính lúp để quan sát ảnh thật).
Hệ thống chiếu sáng gồm:
-

Nguồn sáng (gương hoặc đèn).

-

Màn chắn, được đặt vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi

qua tụ quang.
-

Tụ quang, dùng để tập trung những tia ánh sáng và hướng luồng ánh sáng vào

tiêu bản cần quan sát. Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản. Di
chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng.
Hệ thống điều chỉnh:
-

núm chỉnh tinh (thứ cấp)

có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại tùy thuộc vào tiêu cự, tức bán kính cong của
thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn.
-

Thị kính: gồm 2 thấu kính, một hướng về người xem, một hướng về vất kính. Thị

kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn.

12


-

Năng suất phân li của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để

chọn kính hiển vi. Năng suất phân li của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả năng
phân biệt hai điểm của vật nằm sát nhau. Nếu khoảng cách của hai điểm nằm càng sát
nhau thì năng suất phân ly của kính càng cao.
-

Chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thủy tinh, nên tia sáng khi đi qua tiêu

bảng thủy tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài của tia sáng do bị khúc xạ nên
không thể đi vào vật kính. Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính
càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào rất ít, nên không thể nhìn rõ vật. Để hạn chế nhược điểm
này, người ta dùng dầu soi để cho chiết suất ánh sáng gần bằng với chiết suất thủy
tinh,ánh sáng đị qua không bi khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ
ảnh.
II. Hình vẽ tiêu bản quan sát:


màu
-

Vì trước khi bổ sung thuốc nhuộm safranin hoặc fucshin thì màu tím do Crystal

Violet tạo ra đã bị rửa trôi bởi dung dịch tẩy màu do thành tê bào của G- mỏng và ít lớp
nên mất màu.
III. Hình vẽ vi sinh vật nhuộm cố định và không cố đình:

14


BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT
15


I. Các nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết:
Nguyên tắc:
Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên
trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau
Phương pháp:
 Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời trên đĩa petri vào ống môi trường thạch
nghiên mới
 Nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
 Loại bỏ ống nhiễm, chọn ra các ống có chủng thuần khiết

II. Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy
Trong những trường hợp mẫu vi sinh vật ít thì phải nuôi tích lũy bằng cách ủ giống, bổ
sung một số chất dinh dưỡng và các điều kiện lí hóa hợp lí hoặc bổ sung các chất ứa chế
của các vi sinh vật khác.