BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI BÁO CÁO
CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
NHÓM THỰC HIỆN:
• LÊ THỊ THÚY DUNG
• PHẠM MINH DUY
• DƯƠNG NGỌC KIỀU THI
• HỒ NAM VIỆT
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 05/2008
1
CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ
I. CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ:
1. Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA:
Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ
nóng chảy” (Tm) thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền 2
mạch.
Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao
động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của pjản ứng. Hiện tượng “cộng
hưởng” này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng
nhất định thì hoàn toàn không có tác dụng. Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ
một nút nhỏ thì toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào.
Hình 1_đường cong Tm.
Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông
qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm. (h.1.1). Giá trị
mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có
2
Mạch
đôi

base, các mismatch chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn.
3
d. Ảnh hưởng của môi trường phản ứng:
- Ảnh hưởng của nồng độ muối:
Sự giảm lực ion ( nồng độ muồi) của môi trường sẽ làm giảm rất
mạnh: nhiệt độ nóng chảy” .Tm sẽ giảm khỏang 15
0
C cho mỗi logarithm nồng độ
đối với các ion hóa trị I. Các cation hóa trị II còn có tác động mạnh hơn. Như vậy,
một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA.
- Ảnh hưởng của Formamide:
Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều. Đối với những đoạn
dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo
công thức sau:
∆Tm = - 0,6 x (% formamide)
Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm
làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ thong dụng là 50% tương ứng với việc hạ Tm
xuống 30
0
C.
Trong thực tế, cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán
Tm. Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm:
Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - %mismatch
- 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide).
Công thức này đúng cho những đọan DNA ngắn hơn 100 cặp
nucleotide; trrong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na
+
.
II. KHÁI NIỆM VỀ LAI PHÂN TỬ:
1. Khái niệm về lai phân tử:

Hai thông số nói trên thường được xem xét đồng thời; tích số giữa
nồng độ và thời gian được gọi là Cot (C: concentration_nồng độ; t:
time_thời gian). Cot
1/2
là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai.
b. Nhiệt độ:
Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai
cực đại ở nhiệt đố thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%.
c. Độ dài của các trình tự :
Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ
sung.
d.Lực ion:
Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng
độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng.
 Một vấn đề quan trọng trong lai phân tử là tạo một đầu dò có đánh dấu phóng xạ.
Thông thường người ta sử dụng đầu dò DNA bổ sung (cDNA).
- Sử dụng cDNA tổng hợp từ mRNA có một số ưu điểm:
1. Việc phân lập mẫu mRNA chuẩn dễ dàng hơn so với phân lập mẫu gene
DNA chuẩn cũng như tổng hợp đoạn primer và phân lập cDNA sau khi tổng hợp
dễ hơn.
6
2. cDNA có thể lai với cả RNA và DNA mã hóa nên RNA đó, rất hữu hiệu
trong phát hiện một lượng rất nhỏ RNA đặc hiệu.
Hình 3_các bước chuẩn bị cDNA.
Phương pháp chuẩn bị đoạn cDNA.
 Hầu hết mRNA chứa một chuỗi AAAA ở đuôi 3’, do đó chỉ cần tổng hợp đoạn
primer chứa khoảng 15 T và cho bắt cặp với đầu 3’ của mRNA. Enzyme phiên mã
ngược sau đó sẽ phiên mã một sợi DNA bổ sung từ đoạn primer TTTT này. Đoạn
cDNA có thể được phân lập bằng cách nâng pH của dd, nhờ đó tách mạch lai và
dùng enzyme phân hủy RNA.

acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực
nghiệm. Dung dịch phản ứng lai được trích ra 1 phần, đem xử lý với
Nuclease S1. Các mạch đơn đều sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn
lại tương ứng với các phân tử lai. Chúng được thu nhận qua phương
pháp tủa rồi được đem định lượng.
3. Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite:
Hydroxylapatite là những tinh thể phosphate calci. Ở nồng độ
muối cao, chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn vào giá thể này, phần
nucleic kkhông gắn vào giá thể sẽ được thu nhận. Sau đó, nếu tăng
nồng độ phosphate lên, các nucleic acid đã gắn sẽ tách rời giá thể và
được thu nhận riêng. Số lượng DNA gắn (mạch đôi) và không gắn vào
giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ kế; từ đó tính được
% tỉ lệ phân tử lai.
c. Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng:
8