ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG NGỌC NHUNG

KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG IN VITRO CỦA CÂY
ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.)
Kitagawa) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA
HỌC VÀ VẬT LÝ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – hướng Sinh lý Thực vật
Mã số chuyên ngành: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. NGUYỄN THỊ QUỲNH

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2012


LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
 Cô PGS. TS. Nguyễn Thị Quỳnh, người đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn và
truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và động viên em rất nhiều trong suốt thời
gian học tập và thực hiện luận văn. Đó sẽ mãi là hành trang trên suốt chặng đường
học tập và rèn luyện của em sau này.
 Em xin được bày tỏ lời cảm ơn đến tất cả Thầy Cô Bộ môn Sinh lý Thực vật đã
truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian
học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.
 Các bạn chuyên ngành Sinh lý Thực vật: chị Hồng Anh, chị Linh, chị Diệu, chị
Mỹ, chị Xuân, Trúc mập đã luôn động viên và giúp đỡ Nhung suốt thời gian học
tập.

1.1.3. Phân bố sinh thái ........................................................................................... 4
1.1.4. Thành phần hóa học ...................................................................................... 5
1.1.5. Công dụng dược lý......................................................................................... 6
1.1.6. Trồng và chế biến (Fukuda và cs, 2009) ....................................................... 6
1.2.

Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold

& Zucc.) Kitagawa ..................................................................................................... 8
1.2.1. Trong nước .................................................................................................... 8
1.2.2. Ngoài nước ..................................................................................................... 9
1.3.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................................ 10

1.3.1. Nuôi cấy lớp mỏng tế bào ............................................................................ 10
1.3.2. Vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation) ................. 12
1.3.3. Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) .... 17
1.4.

Những đặc điểm của một số yếu tố hóa học và vật lý in vitro và ảnh hưởng

của chúng đối với sinh trưởng của cây .................................................................... 25
1.4.1. Yếu tố hóa học ............................................................................................. 25


130
ii

1.4.2. Yếu tố vật lý ................................................................................................. 28

2.2.7. Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh .............................. 43
2.2.8. Hàm lượng đường tổng số, hàm lượng tinh bột ......................................... 45
2.2.9. Hiệu suất quang hợp thuần Pn (µmol mol-1 h-1/cây) ................................... 46
2.2.10. Tốc độ tăng trưởng tương đối (Relative growth rate, RGR) (mg mg-1 ngày) và hiệu suất đồng hóa thuần (Net assimilation rate, NAR) (mg cm-2 ngày-2) ..... 47

1


131
5

2.2.11. Chiều dài, chiều rộng và số lượng khí khổng ............................................. 47
2.3.

Phương pháp tính toán số liệu .................................................................... 48

2.3.1. Tỷ lệ (%) cây sống trong giai đoạn ex vitro ................................................ 48
2.3.2. Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) (mg/cây) ........................................... 48
2.3.3. Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) (mg/cây) ........................................... 48
2.3.4. Tỷ lệ trọng lượng thân lá/rễ ........................................................................ 48
2.3.5. Số lá (SL) (lá/cây) ........................................................................................ 48
2.3.6. Chiều cao tán (CCT) (mm/cây) ................................................................... 49
2.3.7. Chiều dài rễ (CDR) (mm/cây) ..................................................................... 49
2.3.8. Phần trăm chất khô (% CK) ....................................................................... 49
2.3.9. Diện tích lá (DTL) (cm2/cây) ....................................................................... 49
2.4.

Phân tích thống kê ....................................................................................... 49

2.5.

Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các

nguồn vật liệu khác nhau ......................................................................................... 95
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi
cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác
động lên cây con ex vitro .......................................................................................... 98
3.2.3. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi
cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng................................. 102
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng ..... 108
4.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................. 115

4.1.

Kết luận...................................................................................................... 115

4.2.

Đề nghị ....................................................................................................... 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 116
Tài liệu tiếng Việt ................................................................................................... 116
Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................... 117
PHỤ LỤC


7133



Gamborg’s B5 (1968)

Enshi:

Enshi-Shoho (1966)

CĐAS:

Cường độ ánh sáng

TGCS:

Thời gian chiếu sáng

GTTLT:

Gia tăng trọng lượng tươi

GTTLK:

Gia tăng trọng lượng khô

% CK:

Phần trăm chất khô

TLT:

Trọng lượng tươi


Chiều dài

CR:

Chiều rộng

SLKK:

Số lượng khí khổng

Chl:

Chlorophyll


134

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm 1 ............................................................................ 36
Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm 2 ............................................................................ 37
Bảng 2.3. Bảng bố trí thí nghiệm 3 ............................................................................ 40
Bảng 2.4. Bảng bố trí thí nghiệm 4 ............................................................................ 41
Bảng 3.1. Sự hình thành chồi đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy ............... 51
Bảng 3.2. Tỷ lệ chồi hình thành theo vị trí lát cắt sau 42 ngày nuôi cấy ..................... 53
Bảng 3.3. GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ và TLK rễ của cây đương quy Nhật Bản in
vitro nuôi cấy trong điều kiện QTD và QDD vào ngày nuôi cấy thứ 42 ...................... 58
Bảng 3.4. CCT, CDR, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều
kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày nuôi cấy ........................................................... 60
Bảng 3.5. Hàm lượng chlorophyll a, b, chlorophyll a + b và tỷ lệ chlorophyll a/b của

Bảng 3.18. Hoạt tính các CĐHSTTV nội sinh trong cây đương quy Nhật Bản sau 42
ngày nuôi cấy ............................................................................................................. 93
Bảng 3.19. Hàm lượng các ion đa lượng và tỷ lệ ion giữa các môi trường................ 106


136
10

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi ........................................................... 3
Hình 1.2. Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản . 5
Hình 1.3. Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung
Quốc (Fukuda và cs, 2009)........................................................................................... 7
Hình 1.4. Các loại nắp hộp nuôi cây làm tăng khả năng trao đổi khí .......................... 19
Hình 1.5. Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng và quang tự
dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a)................................................................................ 22
Hình 2.1. Mẫu ban đầu: (a) phiến lá, (b) cuống lá, (c) chồi ........................................ 35
Hình 2.2. Chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro ....................................................... 37
Hình 2.3. Sơ đồ ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật........................................ 43
Hình 3.1. % mẫu tạo chồi theo thời gian .................................................................... 50
Hình 3.2. Cụm chồi đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 42
...................................................................................................................... 52
Hình 3.3. Sự phát sinh chồi từ lớp mỏng chồi đương quy Nhật Bản........................... 54
Hình 3.4. Sự biến đổi của phiến lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42...................... 55
Hình 3.5. Sự biến đổi hình thái của cuống lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42 ...... 56
Hình 3.6. Cây đương quy Nhật Bản in vitro sau 42 ngày nuôi cấy ............................. 59
Hình 3.7. Nồng độ CO2 bên ngoài (OUT) phòng nuôi cây và bên trong (IN) hộp nuôi
cây ở hai nghiệm thức QTD và QDD theo thời gian ................................................... 61
Hình 3.8. Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy ................ 62
Hình 3.9. Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 150 .......... 64


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A..................... 3
Bảng 1.2. Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng
phòng ngừa virus ..................................................................................... 8
Bảng 1.3. Danh sách các epitope đã được dự đoán bằng phương pháp Tin Sinh học bởi
đề tài KC.04.18/06-10 ..................................................................... 15
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn ......................... 28
Bảng 2.2. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5%........................................ 42
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pVFT-hab .................................................. 53
Bảng 3.2. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng với các nồng độ IPTG khác
nhau....................................................................................................... 61
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB
theo các nồng độ IPTG cảm ứng ........................................................... 62
Bảng 3.4. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau ........ 63
Bảng 3.5. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau .......................................... 63
Bảng 3.6. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau...... 65
Bảng 3.7. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau...................................................... 65
Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp
thu quang phổ ........................................................................................ 68

Trang iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
ANN

artificial neural network

bp


ĐHQG-HCM

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

E. coli

Escherichia coli

EDTA

ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

GST

gluthathione-S-tranferase

HA

hemagglutinin (heamagglutinin)

hab

gen mã hóa cho epitope HAeB

HAeB


Kanr

kanamycin resistance (kháng kanamycin)

kDa

kilo Dalton

LB

môi trường Luria-Bertani

MBP

protein gắn maltose
Trang i


MCS

multiple cloning site

MDP

muramyl dipeptide

MHC

major histocompatibility complex

RNA

ribose nucleic acid

RNase

ribonuclease (enzyme thuỷ giải RNA)

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N, N, N’, N’-tetramethyl-ethane-1,2-diamine

TLR

Toll-like receptor

Trx

thioredoxin

Trang ii


15

MỞ ĐẦU

gia tăng sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản. Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu sinh
lý cũng được nghiên cứu nhằm giúp hiểu rõ hơn sự tăng trưởng của cây trong các điều
kiện in vitro khác nhau.


1.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Giới thiệu sơ lược về cây Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa

1.1.1. Phân loại
Giới (Kingdom):

Plantae

Ngành (Division):

Magnoliophyta

Lớp (Class):

Magnoliopsida

Bộ (Order):

Apiales


New Zealand. Việt Nam đã 3 lần nhập giống cây đương quy Nhật Bản từ Trung Quốc
(khoảng giữa năm 1960), Triều Tiên (1978) và gần đây là từ Nhật Bản (1996). Giống
cây đương quy Nhật Bản nhập từ Trung Quốc hiện không còn, hai giống còn lại vẫn
đang được trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích và cs,
2003). Gần đây, diện tích trồng cây đương quy Nhật Bản được mở rộng từ cao nguyên
đến khu vực sông Hồng (Ninh và cs, 2009).
Cây đương quy Nhật Bản ưa khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặt
đất tàn lụi, phần củ dưới mặt đất chịu đựng được băng tuyết và mọc lại vào mùa xuân
năm sau. Cây đương quy Nhật Bản trồng ở Việt Nam thường cũng phải lựa chọn thời
vụ, sao cho mùa gieo hạt và sinh trưởng của cây trùng với thời gian có nhiệt độ thấp
trong năm. Theo Phạm Văn Ý (2000), thời gian gieo hạt tốt nhất là đầu tháng 10. Việc
gieo hạt vào thời điểm muộn hơn (tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm cũng
như trọng lượng của rễ thu được giảm đáng kể do nhiệt độ giảm mạnh ở thời điểm này.


1.1.4. Thành phần hóa học
Cây đương quy Nhật Bản chứa nhiều các hợp chất hóa học khác nhau trong đó
quan trọng nhất là tinh dầu. Du và cs (2002) đã tiến hành phân tích các hợp chất có
trong tinh dầu cây đương quy Nhật Bản bằng GC-MS (sắc ký khí khối phổ). Kết quả
cho thấy tinh dầu chứa 47 hợp chất khác nhau trong đó ligustilide (22,8%) và
butylidenephthalide (19,5%) là những hợp chất chính.
Theo Đỗ Huy Bích và cs (2003) các hợp chất có trong cây đương quy Nhật Bản
gồm tinh dầu, coumarin, saccharid, acid amin, polyacetylen, sterol. Tinh dầu ở rễ chiếm
0,26%, chứa ligustilid 0,1941%, n-butylphtalid 0,0244%, n-butylidenephtalid
0,1762%, cnidilid, p. cymen. Tinh dầu ở lá chiếm 0,6 – 0,7% (so với khối lượng khô
tuyệt đối), chứa γ-terpinen 36,5%, p. cymen 17,1%, ligustilid 16,1%, myrcen 5,1%, βocimen 3,1%.

Hình 1.2. Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản
Bighelli và các cs (2010) bằng phương pháp GC(RI), GC/MS và 13C-NMR đã
phân tích các thành phần chính có trong tinh dầu của hạt đương quy Nhật Bản là

lỗ trên ngọn thân cây đương quy Nhật Bản để ngăn chặn sự tăng trưởng của cuống hoa.
Cây con sau đó được chuyển sang cánh đồng và trồng nghiêng một góc 35 – 45o (Hình
1.3).

Hình 1.3. Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung
Quốc (Fukuda và cs, 2009)
 Thu hoạch và chế biến
Rễ cây đương quy Nhật Bản được thu hoạch từ giữa đến cuối tháng 12 của năm
thứ hai. Rễ đương quy Nhật Bản sau khi thu hoạch sẽ trải qua 2 lần làm khô. Ở lần làm
khô đầu tiên, rễ được treo trên các kệ để làm khô một cách tự nhiên mà không cần bất
kỳ xử lý nào khác trong khoảng từ 2 – 3 tháng.
Lần làm khô thứ hai được xử lý bằng phương pháp “Yumomi”. Đầu tiên, rễ được
ngâm trong nước nóng (khoảng 55oC) khoảng 45 – 50 phút. Bước thứ hai, rễ được chà


xát một cách cẩn thận trên một bảng đựng nước nóng (nhiệt độ của nước là vào khoảng
45oC) để rửa sạch đất và và các chất bẩn. Bước thứ ba, rễ được xếp cuộn lại. Sau khi
tiến trình Yumomi kết thúc, rễ được phơi khô dưới mặt trời khoảng 3 – 4 ngày. Sau đó,
các chân lá còn lại sẽ được loại bỏ hoàn toàn. Cuối cùng, rễ được xếp cẩn thận thành
từng đống để làm khô cho tới khi rễ trở nên chắc, bền. Lượng nước xấp xỉ 10 - 15% sau
khi làm khô.
1.2.

Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold

& Zucc.) Kitagawa
1.2.1. Trong nước
Cây đương quy Nhật Bản được du nhập vào Việt Nam từ những năm 1990 và từ
đó đến nay đã có nhiều công trình về loài cây này ở Việt Nam được công bố. Nổi bật
nhất trong các nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản tại Việt Nam là các công trình

cấy in vitro bằng cách sử dụng vật liệu là lớp mỏng chồi và phiến lá để tạo chồi và rễ.
1.2.2. Ngoài nước
Cây đương quy Nhật Bản được nghiên cứu ở nhiều nước từ rất sớm, tuy nhiên, đa
phần các nghiên cứu tập trung chứng minh công dụng dược liệu của loài cây này.
Kumazawa và cs (1982) đã tiến hành ly trích polysaccharide có trong dịch trích rễ cây
đương quy Nhật Bản và nhận thấy rằng nó có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch
của cơ thể. Hatano và cs (2004) đã chứng minh rằng dịch trích từ rễ cây đương quy
Nhật Bản tăng cường sự tạo máu bằng cách hoạt hóa các tế bào hồng cầu chưa trưởng
thành của chuột. Thêm vào đó, Yoon và cs (2007) cũng nhận thấy rằng dịch trích từ rễ
cây đương quy Nhật Bản còn có vai trò điều hòa đại thực bào của chuột phản ứng lại
với sự viêm.


Bên cạnh công dụng dược lý, dịch trích từ rễ cây đương quy Nhật Bản còn được
xem như là một loại thuốc trừ sâu tự nhiên. Miyazawa và cs (2004) đã chứng minh khả
năng chống lại ruồi Drosophila melanogaster nhờ vào các hợp chất phthalides và
furanocoumarins có trong dịch trích từ cây đương quy Nhật Bản. Khả năng trừ sâu của
dịch trích cây đương quy Nhật Bản được so sánh với rotenone, một hợp chất hóa học
không mùi được sử dụng rộng rãi trong việc trừ sâu bệnh. Kết quả cho thấy (Z)butylidenephthalide có hoạt tính trừ sâu mạnh hơn cả rotenone. Các tác giả này nhận
định rằng hợp chất này rất có thể là một tác nhân mới trong việc điều khiển sâu bệnh.
Watanabe và cs (1998) đã khảo sát sự tạo cụm chồi từ nuôi cấy chồi ngọn
Angelica acutiloba Kitagawa trên môi trường MS có bổ sung NAA và kinetin để tạo
nguồn vật liệu nghiên cứu nhận dạng hình thái DNA.
Ninh Thị Phíp và cs (2006, 2007) tại đại học Chiba, Nhật Bản, đã nghiên cứu về
sự nảy mầm của hạt và ảnh hưởng của nồng độ dung dịch dinh dưỡng trong hai hệ
thống khí canh và thủy canh lên sự phát triển của cây đương quy Nhật Bản Nhật Bản
ngoài vườn ươm. Hệ thống khí canh giúp cây phát triển tốt hơn, tuy nhiên do các rễ thứ
cấp là nguyên liệu thô dùng làm thuốc tại Việt Nam, hệ thống thủy canh được xem như
là thích hợp hơn vì hệ rễ thứ cấp phát triển trong hệ thống thủy canh tốt hơn.



Diện tích tiếp xúc của lớp mỏng tế bào với môi trường lớn, do đó tế bào dễ
dàng hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường.

-

Dễ định vị vùng cho phản ứng do chỉ có một vài lớp tế bào.

-

Lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) nội sinh trong mẫu
thấp nên các CĐHSTTV ngoại sinh dễ tác động lên mẫu.

-

Mẫu nuôi cấy đồng nhất và đáp ứng nhanh với các cảm ứng.

-

Tạo thực vật hoàn chỉnh ít bị biến dị

-

Giảm sự phân cực tế bào.

-

Tương tác giữa các cơ quan thực vật với toàn bộ cơ thể thực vật được triệt
tiêu.