Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi do mắc các
bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp). Tiêu chảy là bệnh thường gặp
ở mọi lứa tuổi và ở các nước đang phát triển có mật độ dân số cao. Các chuyên gia
về tiêu hóa nhi cảnh báo, Việt Nam là một trong những quốc gia đứng
đầu trong khu vực Đông Nam Á có trẻ em nhập viện vì tiêu chảy cấp
với tỷ lệ 55%. Khảo sát tại các Bệnh Viện nhi cho thấy, trẻ từ 6 đến
24 tháng tuổi nhập viện do tiêu chảy cấp chiếm khoảng 70%. Theo
thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hằng năm trên thế giới có
khoảng 1,3 tỷ đợt trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy, trong đó 1,5 – 2,5
triệu trường hợp tử vong. Bệnh tiêu chảy gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức
khoẻ, tình trạng dinh dưỡng, và làm tổn thất về kinh tế cho gia đình và xã hội.
Trong những vi khuẩn gây tiêu chảy thì Salmonella là vi khuẩn thường gặp có
thể gây hậu quả nghiêm trọng. Bệnh lây qua đường tiêu hóa, có đặc điểm lâm sàng là
sốt kéo dài và gây nhiều biến chứng, và một trong những biến chứng quan trọng là xuất
huyết tiêu hóa và thủng ruột.
Kháng sinh là một vũ khí quan trọng để chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Tuy
nhiên với tình hình sử dụng kháng sinh một cách không kiểm soát như hiện nay đã dẫn
tới một loạt các hệ quả mà ngày nay con người đang phải vất vả khắc phục nó, có thể
thấy ngay đó là vi khuẩn đã trở nên kháng thuốc, làm cho hiệu quả điều trị không cao.
Vì tầm quan trọng và ý nghĩa to lớn của việc sử dụng kháng sinh hợp lý, chúng ta
không nên sử dụng kháng sinh một cách tùy tiện khi có triệu chứng nhiễm khuẩn, mà
cần tới ý kiến của người có chuyên môn.
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. VI KHUẨN SALMONELLA:
1.1.1. Đại cương:
Vi khuẩn salmonella đã được nghiên cứu từ hàng trăm năm nay, tuy nhiên trong
mấy chục năm trở lại đây, chúng được các nhà khoa học quan tâm bởi sự gia tăng các
bệnh tiêu chảy ở người do salmonella gây ra. Vi khuẩn Salmonella phân bố rộng khắp
trong tự nhiên, có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người, các loài động vật, gia súc, gia
cầm. Salmonella có thể tồn tại bên ngoài một tuần cơ thể sống. Bệnh thường gặp nhất
do Salmonella gây ra là gây tiêu chảy, ngoài ra còn có phó thương hàn và thương hàn.
Hằng năm, trên thế giới có khoảng 16 - 33 triệu người mắc bệnh thương hàn,
trong đó 5 - 6 nghìn người tử vong. Vào năm 2005, sốt thương hàn gây ra bởi
Salmonella typhi đã xảy ra ở Congo, khiến 214 người bị thiệt mạng. Theo thống kê,
mỗi năm ở Mỹ có khoảng 40.000 trường hợp nhiễm khuẩn salmonella. Ở Đan Mạch
1995 có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella spp. Trên thế giới, ước tính mỗi năm ngộ
độc thực phẩm mà nguyên nhân là từ salmonella xảy ra ở 1.4 triệu người. Hoa Kỳ,
Salmonella là thủ phạm của 15% các trường hợp ngộ đôc thực phẩm.
1.1.2. Cơ chế gây bệnh:
Sơ đồ 1.1: Đường lây truyền phổ biến gây bệnh tiêu chảy
THỨC ĂN
QUA MIỆNG
Ngô Văn
Quang
VI KHUẨN
SALMONELL
4
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
1.1.4. Nguyên nhân gây bệnh:
Đa số nguyên nhân gây tiêu chảy nhiễm khuẩn salmonella lây qua đường ăn
uống, hay do trẻ mút tay hoặc đồ chơi khi tay hay đồ chơi bị nhiễm bẩn.
Sử dụng các loại thức ăn chưa nấu chín như rau sống, tiết canh, gỏi cá, nem
sống, nem chua, hay ăn kem, thức uống không rõ nguồn gốc. Đây là những thực phẩm
tiềm ẩn nhiều nguy cơ chứa vi khuẩn, … ăn vào với số lượng ít hay nhiều cũng rất dễ
gây bệnh.
Vi khuẩn Salmonella cũng lây qua việc tiếp xúc với thú vật bị nhiễm bệnh, đặc
biệt là gia cầm, lợn, trâu bò, chuột và thú nuôi như loài bò sát, gà con, vịt con, rùa, chó
và mèo.
Sử dụng những nguồn nước bị nhiễm Salmonella mà chưa được xử lý.
1.1.5. Đặc điểm của vi khuẩn Salmonella:
1.1.5.1. Lịch sử và phân loại:
Salmonella do Daniel E. Salmon (1850 – 1914) phát hiện ra năm 1885. Năm 1880
Grafhy đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên
phân lâp được Salmonella typhi vào năm 1884.
Trước năm 1986, dựa vào phản ứng sinh hóa, người ta chia Salmonella làm 3 loại:
S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis.
Năm 1987, theo Miror và cộng sự thuộc trung tâm nghiên cứu Salmonella thế giới
thì Salmonella được chia thành 2 loại chính là: Salmonella enterica (gây bệnh) và
Salmonella bongori (không hay ít gây bệnh). Salmonella bongori rất hiếm chỉ có dưới
10 loại, còn Salmonella enterica có hơn 2500 khác nhau và được chia làm 6 nhóm dưới
-
Loài S.bogori và enterica.
1.1.5.2. Hình thái:
Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.
Salmonella là nhóm trực khuẩn Gram âm (khi nhuộm bằng kỹ thuật Gram thì vi khuẩn
bắt màu đỏ hồng ), hình que, kích thước khoảng 0.5x3µm, hiếu khí và kị khí tùy ý, Có
tiêm mao, có thể di động trừ S.gallinarum, không tạo bào tử.
Hình 1.1: Vi khuẩn salmonella sau nhuộm gram
1.1.5.3. Đặc điểm nuôi cấy:
-
Nuôi cấy được trên môi trường hiếu khí cũng như kị khí, thích hợp ở 37 0C
nhưng có thể phát triển được từ 6- 420C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở
pH từ 6-9.
-
Trên BA không dung huyết.
-
Trên BSA: tạo khóm đen.
-
+ Khúm S: làm đục đều môi trường.
+ Khúm R: mọc thành màng rơi xuống đáy.
1.1.5.4. Tính chất sinh hóa:
-
Lên men glucose, manitol. Không lên men lactose, sucrose.
-
Sinh hơi trừ Salmonella typhi.
-
Indol (-), urease (-) , di động (+), MR (+), VP (-), Citrat (+), OPNG (-). Một số
tính chất khác thay đổi tùy vào một số loài Salmonella.
1.1.5.5. Kháng nguyên và độc tố:
Độc tố có 2 loại độc tố:
+ Nội độc tố: có bản chất là lipopolysacharid có ở vách tế bào vi khuẩn,
được phóng thích khi tế bào bị phá hủy.
+ Ngoại độc tố: tác động lên hệ thần kinh và ruột. Ngoại độc tố có thể
chế thành giải độc tố (Anatoxin). Không bền với nhiệt.
Kháng nguyên gồm 3 loại:
Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O):
Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là
một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài
là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.
một số chủng Salmonella.
1.1.5.6. Tính chất gây bệnh:
Nhiễm khuẩn Salmonella thường có những biểu hiện lâm sàng chính sau:
Sốt thương hàn:
Chủ yếu do S.typhi, S.paratyphi A và S.schottmulleri. Vi khuẩn xâm nhập
đường tiêu hóa vào niêm mạc ruột đến hạch lympho và phát triển tại đây. Đây là thời kì
ủ bệnh.
Sau khi tăng sinh, một số vi khuẩn tự ly giải, phóng thích nội độc tố, một số
theo hệ lympho vào máu gây nhiễm khuẩn huyết. Từ máu, vi khuẩn đi khắp cơ thể gây
ra các ápxe khu trú, thường nhất ở bàng quang hay túi mật rồi vào ống tiêu hóa.
Số lượng vi khuẩn phải đủ nhiều mới gây bệnh thương hàn lớn hơn 10 7 và thời
gian ủ bệnh càng ngắn khi vi khuẩn xâm nhập càng nhiều.
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
8
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Sau 10-14 ngày ủ bệnh, xuất hiện sốt kèm theo lạnh run. Sốt tăng dần trong tuần
đầu, sau đó giữ ở mức 38-39oC trong 2 tuần lễ. Bệnh nhân suy nhược, chán ăn, mệt
mỏi, gan, lách to, xuất hiện ngoài da, bạch cầu giảm.
Trước khi có kháng sinh, biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng
ruột. Biến chứng khác là viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, thận.Biến chứng
xuất hiện muộn như viêm thần kinh ngoại biên, điếc, rụng tóc, thiếu máu tán huyết, đặc
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
9
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Kháng sinh có nhiều nguồn gốc khác nhau:
-
Kháng sinh tự nhiên (natural antibiotic) là kháng sinh do vi sinh vật tiết ra, có
tác dụng gây hại hay giết chết vi sinh vật khác mà không gây hại hay ít gây hại
cho cơ thể con người khi dùng thường xuyên.
-
Kháng sinh tổng hợp (antibiomimetic) là những hóa chất do con người tổng
hợp nên, có tác dụng gây hại hay giết chết vi sinh vật mà không gây hại hay ít
gây hại cho cơ thể con người.
-
Kháng sinh bán tổng hợp (semi-synthenticantibiotic) do vi sinh vật tiết ra
nhưng con người đã làm thay đổi cấu trúc hoa học để có tác dụng diệt khuẩn.
Phân loại:
-
Họ Rifamycin.
-
Một số nhóm khác như: Vancomycin và Ristocetin, Novobiocin, Fusdic acid,
Nitrofurans, Quinolones… và một số thuốc chống lao, chống nấm, chống
virus.
1.2.2. Cơ chế tác động của kháng sinh:
Ức chế sự thành lập vách tế bào:
Kháng sinh thuộc nhóm này: Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine, Penicillin,
Rostocetin, Vancomycin.
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
10
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cùng bên ngoài gọi là vách tế
bào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở
bên trong tế bào. Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của kháng sinh,
các vi khuẩn Gram (+) biến thành dạng hình cầu không có vách (protoplast) và vi
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Ức chế tổng hợp acid nucleic: Kháng sinh tác động vào quá trình sao chép ADN
(nhóm Quionolones), ức chế sao mã ARN (nhóm Rifampicin) và ức chế tổng
hợp các nucleotide (nhóm Sulfamid và Trimethoprim).
1.2.3. Sự kháng thuốc:
Là khả năng đề kháng của vi khuẩn còn sống sót lại kháng sinh đã sử dụng làm
kháng sinh mất dần tác dụng ở những lần điều trị sau này.
Đề kháng kháng sinh bao gồm 2 loại:
-
Đề kháng giả: có biểu hiện nhưng do bản chất của vi khuẩn.
-
Đề kháng thật chia ra 2 nhóm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu nhận:
+ Đề kháng tự nhiên: do bản chất của vi khuẩn và qua trung gian nhiễm sắc thể.
+ Đề kháng thu nhận: do vi khuẩn trước đây nhạy cảm với kháng sinh sau một
thời gian tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh
hoặc do vi khuẩn nhận gen đề kháng kháng sinh từ vi khuẩn khác bằng hình
thức vận chuyển vật liệu di truyền như tải nạp, biến nạp, tiếp hợp.
Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể do một số cơ chế :
-
Thay đổi tính thấm đối với kháng sinh:
Vi khuẩn vượt qua các giai đoạn chuyển hóa bị kháng sinh ức chế, như ở
Enterococci đề kháng Trimerthoprime-Sulfamethoxazone bằng cách sử dụng
acid folic có sẵn mà không cần tổng hợp acid folic.
1.2.4. Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh:
Kháng kháng sinh là tình trạng các vi sinh vật như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký
sinh trùng thay đổi cách thức hoạt động, làm cho các thuốc trị bệnh do chúng gây ra trở
nên vô hiệu. Trên thế giới đã xuất hiện các vi khuẩn kháng hầu hết kháng sinh, còn gọi
là vi khuẩn siêu kháng thuốc. Vấn đề kháng thuốc không phải là mới, nhưng đã trở nên
nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi phải có nỗ lực tổng hợp nhằm giúp nhân loại tránh khỏi
cảnh quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh (năm 1942).
Tỷ lệ phế cầu khuẩn đề kháng với penicillin đang gia tăng nhanh chóng (ví dụ:
Hàn Quốc đến nay đang báo cáo mức độ kháng 70%). Tương tự, vấn đề kháng thuốc
của Shigella và Salmonella spp. đối với cả ba kháng sinh “đầu tay” (Ampicillin,
Trimethoprime-Sulfamethoxazone, Nalidixic acid) đã gia tăng đến mức những tác nhân
này thường không mang lại hiệu quả.
Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam là một trong những nước
đứng đầu thế giới về tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh. Có nhiều loại kháng sinh
mới cũng đã bị kháng với tỉ lệ cao, khiến việc dùng thuốc kém hiệu quả và chi phí chữa
bệnh tăng lên.
Một số vi khuẩn kháng thuốc cao đặc biệt ở nhóm thuốc Cephalosporin thế hệ 3,
4 với tỷ lệ kháng từ 66-83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh Aminosid và
Fluoroquinolon tỷ lệ kháng xấp xỉ trên 60%. Tỷ lệ kháng imipenem năm 2009 là 35%,
tăng gần gấp đôi so với tỷ lệ này năm 2006 (18,4%).
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
Bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân ở các khoa lâm sàng gửi tới khoa Vi sinh tại bệnh
viện nhi đồng 2.
-
Thông tin về độ tuổi, giới tính của bệnh nhân phải được ghi vào phiếu xét
nghiệm.
-
Có sự liên quan chặt chẽ giữa Khoa Điều trị và Phòng Vi sinh để ghi nhận
thông tin đầy đủ chính xác.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:
Thiết bị:
-
Tủ ấm.
-
Tủ lạnh thường.
-
Kính hiển vi.
-
15
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
-
Lam kính hiển vi.
-
Lamelle.
-
Giá ống nghiệm.
-
Bút lông.
-
Găng tay cao su.
-
Kẹp mũi nhọn.
-
KIA, Simon Citrat, Mannitol, LDC, ADH, Ure-Indol…
-
Thuốc thử Kovac.
-
Bộ ngưng kết dùng để định danh Salmonella: polyvalent OMA, polyvalent
OMB, polyvalent OMC…
2.1.5. Đĩa kháng sinh:
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
16
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Nồng độ đĩa kháng
Giới hạn
AM
CXM
Tên kháng sinh
Ký hiệu
1
2
3
4
5
6
7
Ampicillin
Cefuroxime
Ceftriazone
Imipenem
Nalidixic acid
Ciprofloxacin
Chloramphenicol
Trimethoprime-
8
Sulfamethoxazone (Bactrime)
≥16
≤10
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
-
Tăm bông bị khô.
-
Lượng mẫu lấy quá ít.
-
Chứa trong lọ đựng phân không do phòng thí nghiệm cung cấp.
-
Những mẫu phân không ghi các thông tin cần thiết trên nhãn.
2.2.3.2. Cách lấy mẫu phân:
Lấy mẫu phân từ bệnh nhi có nghi ngờ nhiễm khuẩn. Lấy phân tươi, tốt nhất là
vùng có nhiều nhầy máu, sau đó cho phân vào lọ đựng phân của phòng thí nghiệm rồi
đem đến phòng thí nghiệm.
Có thể lấy tăm bông quệt vào phân nhầy máu, cho vào môi trường chuyên chở
đem đến phòng thí nghiệm (có thể giữ hơn 48 tiếng).
Khi mẫu phân được đưa đến phòng thí nghiệm ta tiến hành các bước sau :
• Khảo sát đại thể:
+ Quan sát mẫu phân và ghi vào phiếu xét nghiệm.
+ Trạng thái của phân : phân lỏng, đặc hay sệt.
+ Phân có nhầy máu hay không.
Hình 2.1: kết quả soi tươi mẫu phân
2.2.4. Các phương pháp cấy:
2.2.4.1. Phương pháp cấy tăng sinh:
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
19
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Mục đích: Nhằm tăng sinh số lượng Salmonella có trong mẫu bệnh phẩm.
Ngày thứ nhất:
Sau khi soi kính hiển vi xác định mẫu cần cấy ta tiến hành cấy mẫu bệnh phẩm
vào môi trường Selenit. Ủ ống Selenit đã cấy trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ.
2.2.3.2. Phương pháp cấy phân lập:
Mục đích: Phương pháp cấy phân lập phương pháp cấy 3 chiều dùng để tách rời
từng tế bào vi khuẩn ra khỏi hỗn tạp vi sinh trong mẫu bệnh phẩm trên môi trường nuôi
cấy. Từ một tế bào ban đầu sau một thời gian nuôi cấy sẽ tạo ra một khóm khuẩn lạc.
Ngày thứ hai:
Cấy chuyển vi khuẩn Salmonella từ môi trường tăng sinh Selenit sang môi
trường SS. Ủ môi trường SS đã cấy trong tủ ấm ở 370C trong 24h.
Ngày thứ ba:
Đọc kết quả vi khuẩn mọc trên môi trường SS thấy xuất hiện khuẩn lạc đặc
trưng tròn, tâm đen có vòng trong là Salmonella. Một số trường hợp khuẩn lạc
-
Sinh hơi: môi trường bị nứt hay bị đẩy lên.
-
Sinh H2S môi trường có màu đen.
Hình 2.2: Kết quả thử nghiệm Salmonella trên môi trường KIA
Khả năng lên men đường mannitol và di động:
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
21
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
+ Môi trường mannitol-motility được sử dụng để thử nghiệm đồng thời khả
năng lên men đường mannitol và khả năng di động của vi khuẩn Salmonella, chỉ thị
màu phenol red, môi trường thạch bán lỏng.
• Cách thực hiện và kết quả:
+ Dùng pipet một lượng dịch vi khuẩn, đâm sâu xuống môi trường không nhỏ vi
• Cách thực hiện và kết quả:
+ Dùng pipet hút một lượng dịch vi khuẩn, nhỏ vài giọt vào môi trường LDC và
ADH, sau đó nhỏ dầu parafin tạo điều kiện kỵ khí. Ủ ở 370C trong 24 giờ.
+ Đọc kết quả nếu có vi khuẩn Salmonella thì môi trường có màu tím vàng khác
so với màu tím môi trường ban đầu (+). Nếu môi trường có màu vàng thì là âm tính
(-), vì môi trường không có vi khuẩn Salmonella.
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
23
Báo Cáo Thực Tập Tốt Nghiệp
GVHD: Trần Thị Ngọc Anh
Hình 2.4: Kết quả thử nghiệm Salmonella trên LDC và ADH
Khả năng phân giải urê và khả năng sinh Idol:
+ Sử dụng môi trường kết hợp Urê-Indol, chỉ thị màu là phenol red, thuốc thử
Kovac.
• Cách thực hiện và kết quả:
+ Dùng pipet hút một lượng dịch vi khuẩn, nhỏ vài giọt vào môi trường. Ủ ở
370C trong 24 giờ lấy ra nhỏ thêm vài giọt thuốc thử Kovac rồi đọc kết quả.
+ Nếu trong môi trường không có vi khuẩn Salmonella thì môi trường vẫn giữ
nguyên màu cam không đổi màu là Ure (-). Xuất hiện vòng vàng thì Indol (-).
Lưu giữ vi khuẩn:
+ Idol (-): trên bề mặt môi trường có vòng vàng.
Ngô Văn Quang
MSSV : 30700406
25
Copyright: Tài liệu đại học ©