VẬT TRONG THỰC
PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP PCR
(Polymerase Chain
Reaction)
Khái niệm chung về phương pháp PCR
Phương pháp phát hiện Salmonella bằng
PCR
Phương pháp phát hiện V. cholerae bằng
PCR

1


KHÁI NIỆM PHƯƠNG PHÁP PCR
Khái niệm
 PCR là phương pháp khuếch đại in vitro (trong
ống nghiệm) một trình tự DNA dựa trên một
trình tự DNA đích ban đầu bằng một cặp mồi
(primers) và enzym DNA polymerase
 Khuôn DNA (template)là trình tự DNA đích đặc
trưng cho đối tượng cần phát hiện
 Mồi (pimers): là một trình tự DNA hay RNA
ngắn bắt cặp với mạch khuôn DNA có mang
một đầu 3’- OH tự do giúp DNA polymerase bắt
đầu tổng hợp mạch mới.
Trong một phản ứng cần có 2 mồi

2



 Thang DNA (DNA marker) là phương tiện để đo
kích thước các đoạn DNA. Đây là hỗn hợp các
đoạn DNA có kích thước khác nhau đã biết
 Cặp base ( base pair - bp): cặp base bổ sung trong
DNA mạch đôi
4


CÁC BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH
KHUẾCH ĐẠI
 Phản ứng PCR được thực hiện thông qua nhiều chu kỳ
nhiệt liên tiếp gồm các bước như sau:
 Bước 1: Biến tính: làm cho hai mạch của DNA tách rời nhau
ra dưới tác dụng của nhiệt. Nhiệt độ biến tính luôn cao hơn
nhiệt nóng chảy (Tm) của khuôn DNA. Thường thực hiện ở
nhiệt độ 92-95oC
 Bước 2: Lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của mồi cho phép
mồi bắt cặp với khuôn DNA. Nhiệt độ lai dao động trong
khoảng 40-70oC
 Bước 3: Kéo dài: nhiệt độ được tăng lên đến nhiệt độ tối ưu
cho taq DNA polymerase hoạt động (72oC) tổng hợp hợp kéo
dài mạch mới từ đầu 3’OH của mồi

 Chu kỳ tiếp theo sẽ quay lại bước 1 sau khi kết thúc
bước 3 của chu kỳ trước
5


CÁC BƯỚC CỦA PHẢN ỨNG PCR
Chu kỳ

PHẢN ỨNG KHUẾCH ĐẠI PCR
 Khuôn DNA
 Mồi (primers): gồm một mồi xuôi và một mồi ngược
có nồng độ bằng nhau
 dNTP là hỗn hợp gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP.
Các thành phần này có nồng độ bằng nhau
 Taq DNA polymerase
 MgCl2 là thành phần không thể thiếu, có tác dụng
làm tăng ái lực kết hợp mồi – khuôn và dNTP – Taq
polymerase.
Nồng độ phụ thuộc từng qui trình khuếch đại

 Đệm phản ứng: gồm Tris – HCl, Tween 20(NH4)SO4,
KCl và các chất tăng cường khuếch đại
8


THU NHẬN KHUÔN DNA
 DNA nằm trong nhân tế bào, bên trong màng tế
bào vi khuẩn hay trong vỏ bọc của virus
 Giải phóng DNA bằng cách phá huỷ màng tế
bào, màng nhân, vỏ virus …
 Tác nhân phá màng để giải phóng DNA có thể
là nhiệt, lysozym hay các chất tẩy mạnh. Trong
phân tích vi sinh thường sử dụng tác nhân là
nhiệt
 Khuôn DNA có thể được tinh sạch hoạt không
9



– Kết quả âm tính: không có DNA được khuếch đại hay
kích thước tạo ra không phù hợp kích thước thiết kế
11


KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÊN GEL
AGAROSE

T: thang DNA, 1,3,4,5,6,8,9,10,11: Mẫu cho kết
quả dương tính với sản phẩm khuếch đại 380bp,
2,7: Mẫu âm tính

12


Ưu, nhược điểm của phương pháp PCR
 Ưu điểm
–
–
–
–

Thời gian cho kết quả nhanh: 24-28 giờ
Có thể phát hiện VSV khó nuôi cấy
Hoá chất dễ bảo quản, dễ tìm
Ít tốn công lao động

 Nhược điểm
– Taq DNA polymerase bò ức chế bởi các thành phần
của mẫu


Sữa tươi, rau
cải, thòt thủy
sản
Thòt thủy sản

V. para.

Thòt thuỷ sản

Thời
gian
(giờ)

Độ nhạy
(CFU/phản
ứng)

Độ nhạy
(CFU/25g
mẫu)

12

90

10

14


370

10

Các ứng dụng đã được nghiên cứu triển khai tại ĐH KHTN14
TPHCM


PHAT HIEN
SALMONELLA TRONG
THệẽC PHAM BAẩNG
PCR

15


THIẾT BỊ, VẬT DỤNG
 Tủ ấm 37oC: tăng sinh Salmonella
 Máy luân nhiệt (thermocycler): khuếch đại
 Máy ly tâm eppendorf 1.5ml: xử lý khuôn DNA
 Máy lắc ống nghiệm
 Thiết bò điện di ngang và bộ nguồn có điện thế
80-150V
 Hộp đèn soi UV có kính lọc 302nm
 Pipetteman 1-10µl, 10-100 µl, 0.1 – 1 ml
 Eppendorf 1.5ml, ống PCR 0.2 hay 0.5ml
16


HOÁ CHẤT – VẬT TƯ

 Đệm điện di TAE 1X
Tris
Na2EDTA 0.5M, pH 8
Axit acetic băng
Nước cất

4.84g
2ml
1.14ml
đủ 1 lít

 Đệm tải mẫu

Glycerol
Brommophenol blue
Tris
Na2EDTA 0.5M, pH 8
 Ethidium bromide

30%
0.25%
200mM
20mM

10mg/ml

18


QUI TRÌNH

3 µl

 Chương trình khuếch đại
95oC / 5 phút  (95oC/60 giây, 54oC / 45 giây, 72oC / 60 giây) x 35 chu
kỳ  72oC/ 10phút  giữ ở 20oC

20


QUI TRÌNH (tt)
 Nhuộm mẫu: cho 10µl dd nhuộm mẫu vào sản phẩm sau khuếch đại 
trộn đều
 Chuẩn bò gel agarose 2%: 2g agarose + 100ml TAE  đun tan  cho
vào 5 µl dd ethidium bromide  cho vào khay có gắn các lược để tạo
giếng  chờ gel đông đặc  bỏ lược  ngâm vào đệm TAE
 Điện di: hút 5-10 µl mẫu đã nhuộm cho vào giếng  điện di ở điện thế
100V trong khoảng 1 giờ
 Cho gel lên bàn UV để đọc kết quả

21


DIỄN GIẢI KẾT QUẢ
 Kết quả dương tính: có xuất hiện vạch sản phẩm 520bp
 Kết quả âm tính: không có vạch sản phẩm, hay xuất hiện các vạch khác
kích thước trên

22