BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐOÀN THỊ NGỌC TUYỀN XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN
ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2005
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước

CEN : European Committee for Normalization (Hội đồng Châu Âu về chuẩn hóa)
dH
2
O : Nước cất
DNA : Deoxyribonucleic acid
d NTP : 3'- Deoxynucleoside - 5' triphosphate
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay (Thử nghiệm hấp thu miễn dòch
gắn enzyme)
FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm)
FP : False positive (dương tính giả)
FN : False negative (âm tính giả)
KDa : Kilo Dalton (1000Da, đơn vò khối lượng protein)
RA : Relative accuracy (độ chính xác tương đối)
RS-P : Relative sensitivity (độ nhạy tương đối)
RS-N : Relative specificity (độ đặc hiệu tương đối)
ISO : International Standards Organisation (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế)
Nordval : Nordic Committee on Food Analysis (Hội đồng phân tích thực
phẩm Bắc Âu)
PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ polymerase)
TAE : Tris acetic acid – EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)
TE : Tris - EDTA
Taq : Thermus aquaticus
UV : Ultraviolet (tia tử ngoại)
WHO : World Health Organization
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền

PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM
1.1. Một số khái niệm liên quan
Trong lónh vực thực phẩm hiện nay, có hai khái niệm đang được sử dụng rộng rãi là vệ sinh thực
phẩm và an toàn thực phẩm và một số khái niệm quan trọng khác cần được phân biệt.
- Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : là khái niệm để biểu thò thực phẩm không
chứa vi sinh vật gây bệnh và không chứa độc tố. Khái niệm này cũng bao hàm tình trạng vệ sinh
trong khi vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: là khả năng không gây ngộ độc của thực phẩm
đối với con người bởi vi sinh vật hoặc bởi hóa chất, các yếu tố vật lý. Theo nghóa rộng, khái
niệm này còn được hiểu là khả năng cung cấp đầy đủ và kòp thời về số lượng và chất lượng thực
phẩm khi một quốc gia gặp thiên tai hoặc một lý do nào đó. Mục đích của an toàn thực phẩm là
việc bảo đảm được thực phẩm không bò nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học,
độc tố hoá học và các yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trong các quá trình sản
xuất, vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm.
- Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có
trong thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm được chia thành 2 nhóm:
+ Ngộ độc do chất độc của vi sinh vật tạo ra trong nguyên liệu hoặc hóa chất từ quá trình
chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến… Các độc chất này đã có trong thực phẩm trước khi
được tiêu thụ.

+ Ngộ độc do nhiễm trùng: là trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào cơ thể
bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của bản thân vi khuẩn hoặc do độc
tố của vi khuẩn .
- Độc tố [7, 8]: là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở
một hàm lượng có thể gây ngộ độc khi được tiêu thụ bởi người hay động vật. Độc tố có thể tồn
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước

1.2. Những vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp
- Coliform [10]: Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật
dùng để chỉ thò khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Nhóm
coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que,
lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Dựa vào nhiệt độ tăng
trưởng, nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ
phân của các loài động vật. Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu
nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter. Trong các thành viên của
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
nhóm coliform phân thì E. coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực
phẩm.
- Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn hiện diện trong ruột người và động vật, được thải ra
ngoài thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp trong đất và nước. Năm 1971 E. coli được
xếp vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thò nhiễm
khuẩn thực phẩm. Loài này là trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất cơ bản của vi khuẩn
đường ruột. Khả năng gây bệnh của E. coli rất đa dạng và tùy thuộc vào vò trí xâm nhập. Đối
với nhiễm khuẩn ngoài đường ruột, E. coli gây nhiều bệnh khác nhau với các triệu chứng không
đặc trưng và được xem là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm
bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu). Ngoài ra E. coli còn có
thể gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E. coli gây các bệnh
viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả.
- Salmonella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động bằng
chu mao. Vi khuẩn này chòu nhiệt kém nhưng chòu được một số hóa chất như brilliant green,
sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate. Người ta đã

phân lập được 2324 chủng Salmonella
khác nhau. Ngoài nội độc tố Salmonella có thể tạo ra hai loại ngoại độc tố là độc tố ruột
(enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin). Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O và H, người ta chia
Salmonella gây bệnh ra thành 3 nhóm: nhóm chỉ gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động

tố ruột. Độc tố ruột V. cholerae là một protein không bền nhiệt, cấu tạo bởi đơn vò A và B. Phần
B giúp độc tố gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào ruột là GM
1
. Tiểu đơn vò A vào ruột tăng hoạt
động của adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP quá nhiều làm tăng tiết ồ ạt nước và chất
điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy. Virio còn có thể tạo hemolysin (chủng
Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận
độc tố.
+ V. parahaemolyticus đa số gây độc trong thức ăn làm viêm ruột.
+ V. vulnificus hiện diện rộng rãi ở nước biển, hải sản, có khả năng tổng hợp độc tố
cytotoxin, hemolysin, cytolysin. Tỉ lệ tử vong bởi độc tố của vibrio thường rất cao.
+ V. alginolyticus ít gặp và được phát hiện gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1971. Vi
khuẩn này có khả năng tạo độc tố ruột. Khi vào cơ thể, chúng phát triển rất nhanh trong máu và
gây bệnh.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
- Yersinia [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột
chòu nhiệt. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm
mạc hầu trong, đường hô hấp). Khi vào cơ thể Yersinia sinh sản rất nhanh, biểu hiện lâm sàng là
các hạch trên cơ thể. Vi khuẩn đi vào máu và xâm nhập vào các phủ tạng gây xuất huyết. Thời
gian ủ bệnh là 2 – 7 ngày. Sau đó có thể sốt cao và đột ngột, hạch to dần gây đau đớn. Trường
hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm thấy bứt rứt, lo âu. Trường hợp nhiễm trùng máu sớm
có thể kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nếu nhiễm muộn thì đông máu nội hạch, hạ huyết áp,
người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim.
- Proteus [8,10]: là vi khuẩn có trong tự nhiên, trong đường tiêu hóa của người và động
vật. Thực phẩm bò nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từ

dụng cụ vật liệu chế biến thực
phẩm không được xử lý tốt. Proteus chỉ gây độc khi lượng tế bào trong cơ thể đủ lớn. Độc tố chỉ
đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả năng thẩm thấu của niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm

thực phẩm. Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ. Triệu chứng là đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn.
Độc tố của

C. perfringens bò bất hoạt ở 60C trong 10 phút.
- Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu là L. monocytogenes, là vi khuẩn ưa lạnh, có thể
phát triển ở nhiệt độ 2,5 - 44C, thường hiện diện trong trong sữa, thòt, cá, rau và cả nước bề
mặt. Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản
trong các đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và
có thể xâm nhập vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi.
Ngoài các vi khuẩn thường gặp kể trên còn có nhiều vi khuẩn khác có vai trò nhất đònh
trong việc gây bệnh cho người từ thực phẩm như Bacillus cereus, Campylobacter jejuni,
Corynebacterium, Aeromonas hydrophila...
- Virus [6,10]: là nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm.
Virus gây bệnh ở thực phẩm ít được nghiên cứu do khó nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thông
thường. Có rất nhiều vụ dòch hay ca bệnh từ thực phẩm do virus gây ra nhưng trong nhiều trường
hợp người ta không phát hiện được nguồn gốc gây bệnh. Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan
truyền mầm bệnh. Một số virus trong thực phẩm gây bệnh ở người đã biết là virus Fadeno
serotype 40 và 41 gây loét dạ dày (họ Adenoviridae, chứa DNA, kích thước 100 nm), virus
Hepatitis E gây bệnh gan (họ Calciviridae, chứa RNA, kích thước 34 nm), virus Pravo gây đau
bao tử ( họ Pravoviridae, chứa DNA, kích thước 22nm), virus Popilo type 1 – 3 và Echo type 1 –
65 gây viêm phổi (họ Picornarividae, chứa RNA, kích thước 28nm)...
- Nấm mốc tạo độc tố [7,20]: một số loài có khả năng tạo độc tố gây ngộ độc hay ung thư
ở người và động vật. Trong thực phẩm, một số loài có khả năng tạo ra các độc tố, thường gặp và
nguy hiểm nhất là aflatoxin do Aspergillus flavus và A. parasiticus tạo ra. Mức độ ngộ độc bởi
nấm mốc là khác nhau, biểu hiện như nhiễm độc nhẹ (gây nôn mữa, tiêu chảy), tổn thương ở
gan, thận, túi mật và ống mật. Một số độc tố còn gây u tuyến hoặc u gan, gây thoái hóa tế bào
nhu mô gan, xơ hóa. Citrinin của Penicilium citrinum và P. viridicatum có thể gây các bệnh tăng
urea huyết, albumin niệu, viêm tiểu cầu thận. Một số độc tố của nấm mốc như tetronic acid,
terestic acid, viridicatic acid... tác động vào tim gây độc đối với chức năng của tim. Độc tố của
Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus... tác động

(tối ưu ở 37C), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4). Khi tăng trưởng trên mặt thạch PCA ở 37C trong
24 giờø, E. coli hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, trong, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường
kính 2 – 3 mm. Trong môi trường nước peptone E. coli phát triển tốt, làm môi trường rất đục có
lắng cặn màu tro nhạt ở đáy dụng cụ nuôi cấy, đôi khi hình thành màng xám nhạt. Canh trường
có mùi phân thối. Trên môi trường Endo, E. coli hình thành những khuẩn lạc màu đỏ ánh kim. Trên
môi trường DA (Desoxycholate Agar), E. coli cho khuẩn lạc màu đỏ, dẹt tròn và khô. Trên môi
trường EMB( Eosine Methylene Blue), E. coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, đỏ tía
thường có ánh kim, bờ tròn đều. Vi khuẩn này không phát triển ở môi trường Kauffmann và môi
trường Wilson Blair.
- Đặc điểm sinh hóa [10]
E. coli lên men sinh hơi với nguồn cacbon là glucose, galactose, lactose, maltose,
arabinose, xylose, ramnose, mannitol, fructose; có thể lên men hay không lên men saccharose,
rafinose, esculin, duncid, glycerol; ít khi lên men inulin, pectin, adonite; không lên men dextrin,
amidon, glycogen, inositol, cellobiose. Vi khuẩn thường sinh indol, không sinh urea và H
2
S, có
sinh lysin decarboxylase, không sử dụng citrate. Sự tăng trưởng của vi khuẩn bò ức chế bởi
chlorine, các dẫn xuất của muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate,
selenite... Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đường ruột khác, 4 tính chất sinh hoá thường
được dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate( còn được gọi là thử nghiệm
IMViC).
+ Indol (I): trong môi trường có tryptophan, tryptophanase của E. coli thuỷ phân
tryptophan thành indol. Để phát hiện indol, dùng vài giọt thuốc thử Kovac
,
s có chứa chất p-
dimethylaminobenzaldehyde. Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl
amonium có màu đỏ .
+ Methyl Red (đỏ methyl, MR): khi được nuôi cấy trong môi trường có glucose, E. coli
sẽ tạo ra một nồng độ H
+

hỗn thực bài tiết nhiều E. coli hơn loài ăn cỏ. Vi khuẩn này được thải theo phân người và động
vật ra ngoài và nhiễm vào đất và nước. Việc phát hiện E. coli trong nguồn nước là một thử
nghiệm chính nhằm xác đònh nước có bò nhiễm phân hay không. Trước đây, E. coli được xem là
một vi khuẩn bình thường trong ruột. Hiện nay có nhiều chủng được xem như một trong những
tác nhân gây tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em.

Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
2.2. Đặc tính gây bệnh [1,7]
E. coli sống cộng sinh trong ruột người. Bình thường vi khuẩn này không gây bệnh và ức
chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác, tổng hợp vitamin C và K rất cần thiết cho con
người. Khi tỉ lệ E. coli giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất
hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn.
Một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh. Bệnh gây ra bởi E. coli thay đổi theo vò trí
xâm nhập và chủng gây bệnh. Một số biểu hiện lâm sàng thường gặp là:
- Nhiễm khuẩn đường tiểu: E. coli có thể gây bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu với các
triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Có trường hợp
biến chứng thành nhiễm khuẩn tử cung, đường niệu, ống dẫn trứng, thận và nhiễm khuẩn máu.
- Nhiễm khuẩn máu: khi sức đề kháng của cơ thể người giảm, vi khuẩn có thể vào
máu và gây nhiễm khuẩn. Thường gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu.

- Viêm màng não: E. coli và streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng đầu gây
viêm màng não ở trẻ em. E. coli chiếm khoảng 40 trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh,
trong đó 75% E. coli có kháng nguyên K1.
- Tiêu chảy và các bệnh đường ruột: trước đây, vai trò gây tiêu chảy của E. coli ít được
đề cặp đến. Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của kó thuật xét nghiệm, người ta ngày càng phát
hiện được nhiều chủng E. coli gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác. E. coli được xem là
nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, đặc biệt là trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới,
ở các nước phát triển lẫn các nước đang phát triển. Nhiều nơi phát sinh thành dòch do khả năng
lây lan rất nhanh và gây hiệu quả nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng.

3.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống [6,10]
Phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát hiện E. coli gồm ba bước: (1) tăng sinh chọn
lọc trên môi trường phù hợp như BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoặc canh Lauryl
Sulphate Tryptose; (2) phân lập trên một các môi trường như Endo, EMB (Eosine Methylene
Blue Agar), DA (Desoxycholate agar) và (3) thử sinh hóa trên các môi trường MRVP (Methyl
Red Voges Proskauer) và Simons citrate agar.
- Tăng sinh chọn lọc: mục tiêu của bước này là làm tăng số lượng E. coli có trong mẫu,
ức chế một số lượng lớn các sinh vật khác. Môi trường dùng để tăng sinh chọn lọc là BGBL vì
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
trong thành phần của môi trường này có chứa mật bò chọn lọc vi khuẩn Gram âm, ức chế sự
phát triển của vi khuẩn Gram dương.
- Phân lập: bước này nhằm tách biệt và nhận dạng E. coli từ tập hợp các quần thể vi sinh
vật khác nhau trong mẫu sau bước tăng sinh chọn lọc. Có nhiều môi trường rắn khác nhau được
sử dụng để phân lập E. coli, mỗi môi trường nhận dạng một vài đặc tính chung nhất của E. coli.
Mức độ chọn lọc, tính đặc trưng và hình thái biểu hiện khuẩn lạc của E. coli trên từng môi
trường cũng khác nhau. Vì vậy các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích cùng
một lúc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát
hiện E. coli, trong đó môi trường EMB được khuyến khích sử dụng. Các biểu hiện của E. coli
trên các môi trường khác nhau như sau:
+ Trên môi trường Endo khuẩn lạc E. coli thường có màu đỏ ánh kim tròn, bờ đều,
đường kính khoảng 0,5mm.
+ Trên môi trường EMB khuẩn lạc E. coli đỏ tía, có ánh kim, bờ đều, đường kính
0,5mm.
+ Trên môi trường DA khuẩn lạc E. coli có màu đỏ, tròn, khô và hơi dẹp, đường kính
0,5mm.
- Thử phản ứng sinh hóa: chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli từ môi trường phân
lập để thử nghiệm IMViC (trang 13, 14).
Mẫu kiểm được kết luận là có E. coli khi làm đổi màu và sinh hơi trên môi trường tăng sinh, tạo
khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập và cho kết quả sinh hóa là: I (+), MR (+), VP (-),

sợi nucleic acid mạch đơn (DNA, RNA) nếu có hai trình tự bổ sung ngược chiều nhau ở nhiệt độ
thấp hơn nhiệt độ tách mạch T
m
của hai phân tử nucleic acid mạch đơn. Một trong hai mạch
DNA bổ sung (thường là DNA mục tiêu) được cố đònh trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên
tế bào hay mô. Sự lai phân tử xãy ra khi đoạn mẫu dò có trình tự nucleotide bổ sung với một
vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường
thấp hơn T
m
ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xãy ra giữa DNA và RNA [10]. ETEC là
một trong những vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được phát hiện bằng phương pháp lai phân tử.
Năm 1982, người ta đã sử dụng có hiệu quả các mẫu dò DNA để phát hiện gen mã hóa ST và
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
LT trong mẫu phân và mẫu môi trường bằng phương pháp lai phân tử. Hiện nay đã có một số bộ
kit thương mại dựa trên kó thuật phân tích nucleic acid dùng trong phát hiện E. coli gây bệnh
trong thực phẩm.

4. PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN E. COLI TRONG PHẨM [4, 10]
Dựa trên sự hiểu biết về nguyên tắc nhân bản DNA trong tế bào, năm 1985 Karl Mullis
và cộng sự đã phát minh ra một phương pháp cho phép nhân bản sao của DNA trong ống
nghiệm gọi là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Đây là một trong những phương
pháp nhân bản DNA in vitro được sử dụng rộng rãi nhất.

4.1. Nguyên tắc
Tất cả DNA polymerase đều cần mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu)
đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen. Mồi là đoạn oligonucleotide ngắn, bắt cặp
bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này
được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này

bản
sao. Sau phản ứng PCR, sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose và vạch của sản
phẩm khuếch đại được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể thấy được dưới hộp đèn soi UV
bước sóng 312nm. Hình 2. Các bước trong phản ứng PCR

94C
94C
72C
72C
4C

55Caa

độ biến tính DNA để có khả năng xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối của quá trình phản ứng.
Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối
nước nóng Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme polymerase chòu nhiệt khác đã
được phát hiện và đưa ra thò trường với chức năng hoàn thiện và chuyên biệt hơn. Enzyme Tth
polymerase được tách từ Thermus thermophilus vừa có thể hoạt động như một enzyme phiên mã
Chu kỳ 1
2.097.152 bản sao (lý
thuyết)
Chu kỳ 3
dNTP
Taq
1 bản sao

Chu kỳ 2
> 20 chu kỳ
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
ngược đểï hình thành cDNA trong trường hợp khuôn là RNA, vừa có khả năng xúc tác phản ứng
khuếch đại DNA.
- Mồi và nhiệt độ lai: mồi là một trong những yếu tố quan trọng để đạt được sự khuếch
đại đặc trưng. Việc thiết kế và chọn mồi phải đạt các yêu cầu sau:
+ Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và
mồi “ngược”, không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác
nhau của một mồi.
+ “Nhiệt độ nóng chảy” (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành
phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh chứa nhiều GC.
+ Mồi phải dặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại
trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR tốt nhất cho
những trình tự nhỏ hơn 1kb.

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thường thấp, nên trong đa số trường
hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
- Phương pháp PCR không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn
đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép
phát hiện bào tử dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ
độc.
Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và
một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản
ứng PCR.

4.4. Các nghiên cứu ứng dụng PCR trong phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm [10]
Hiện nay, có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để
phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hoặc những loài
khó nuôi cấy. Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp PCR cần
phải qua bước nuôi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để
thực hiện phản ứng PCR. Sau khi nuôi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào từ dòch tăng sinh để
tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng
kó thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Trung tâm Khoa học
và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM đã thiết lập
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
được một số bộ kit phát hiện một số loài gây bệnh khác trong thực phẩm như Samonella,
Shigella…bằng PCR [10]
5. XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP [20, 21]
5.1. Đònh nghóa
Xác nhận hiệu lực (validation) là quá trình thực hiện để củng cố một mục đích sử dụng,
thực hiện một qui trình hay một phương pháp bằng những thí nghiệm kiểm tra và cung cấp
những chứng cứ khách quan về những kết quả thu được. Xác nhận hiệu lực một phương pháp
phân tích vi sinh mới (hay phương pháp thay thế, alternative method) là quá trình thực nghiệm
để so sánh những kết quả thu được từ phương pháp thay thế và kết quả thu được so vớiø phương

thành phần tham gia vào qui trình phân tích và cung cấp thông tin về độ tin cậy của phương pháp
trong quá trình sử dụng.
- Độ nhạy (sensitivity): là chỉ số đánh giá khả năng phát hiện vi sinh vật mục tiêu có
trong mẫu của phương pháp thay thế. Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so
với số kết quả dương tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu.
- Độ đặc hiệu (specificity): là khả năng phương pháp đó cho kết quả âm tính trên mẫu
phân tích không chứa vi sinh vật mục tiêu (được kiểm chứng bằng phương pháp tham chiếu). Chỉ
số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả âm tính khi phân tích bằng
phương pháp tham chiếu.
- Âm tính giảû (false negative): là kết quả âm tính khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa
vi sinh vật mục tiêu.
- Dương tính giả (false positive): quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa
vi sinh vật mục tiêu.
- Giới hạn phát hiện: là mật độ tế bào vi sinh vật thấp nhất mà một phương pháp phân
tích có thể phát hiện được. Tại giới hạn phát hiện, số lần phân tích cho kết quả dương tính phải
trên 50%.
Việc xác nhận hiệu lực phải chứng minh được rằng phương pháp thay thế có giới hạn
phát hiện bằng hoặc thấp hơn giới hạn phát hiện cuả phương pháp tham chiếu. Theo tiêu chuẩn
AOAC, giới hạn phát hiện cuả phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chọn ở các cấp độ khác
nhau. Thấp nhất là 1 –5 tế bào/25g mẫu thực phẩm, cao nhất là 10 – 50 tế bào/25g mẫu thực
phẩm.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước
Đoàn Thò Ngọc Tuyền
Các thông số kó thuật nêu trên cho phép ta đánh giá tính khả thi của phương pháp thay
thế, đồng thời cũng cho biết độ tin cậy của kết quả khi phân tích bằng phương pháp này. Các
thông số kó thuật của phương pháp thay thế khi được công bố, sẽ cho phép các phòng thí nghiệm
lựa chọn phương pháp phù hợp với yêu cầu và năng lực của mình.

5.3. Ý nghóa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp thay thế
Một phương pháp mới phải được đánh giá so sánh với những phương pháp truyền thống