BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENES
TRONG THỦY HẢI SẢN ðÔNG LẠNH
Ngành: Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học


2.1.3. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản trên thế giới 6
2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes 8
2.2.1. Lịch sử phát hiện 8
2.2.2 Phân loại 10
2.2.3. ðặc ñiểm chung của chi Listeria 11
2.2.4. ðặc ñiểm hình thái và kháng nguyên 12
2.2.5. Cấu trúc 14
2.2.5.1. Cấu trúc di truyền 14
2.2.5.2. Cấu trúc tế bào 15
2.2.6. Yếu tố ñộc lực 18
2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogen 18
2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO) 19
2.2.6.3. Vai trò của yếu tố ñộc lực 19
2.2.7. Bệnh và triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra22
ii

2.2.7.1. Bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra 22
2.2.7.2.Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra 26
2.2.8. Cơ chế gây bệnh 26
2.2.9. Tình hình nhiễm listeria monocytogenes ở Việt Nam và trên thế giới 29
2.2.10. Nguyên tắc ñiều trị 31
2.2.11. Cách phòng ngừa 33
CHƯƠNG 3:PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH VI KHUẨN L.MNOCYTOGENES 34
3.1. Phương pháp xác ñịnh truyền thống 34
3.1.1. Nguyên lý và phương pháp 34
3.1.2. Phạm vi phát hiện vi khuẩn 34
3.1.3. Dụng cụ sử dụng 3
3.1.4.Môi trường ñể nuôi cấy 34
3.1.5.Quy trình phân tích vi khuẩn Listeria Monocytogenes 35
3.1.5.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes 35

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 8
Hình 2.2. Vi khuẩn Listeria monocytogenes 10
Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes 16
Hình 2.4. Lông roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes 17
Hình 2.5. Cơ chế xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes21
Hình 2.6. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes 27
Hình 3.1. Thử nghiệm Catalase 39

DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ðỒ
Bảng 2.1 Dùng ñể phân biệt các loài Listeria 13
Sơ ñồ 3.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes 36
Sơ ñồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes 44

Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa ñược biết. Bệnh
bắt ñầu từ ñường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường
hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các ñại thực bào và gây nhiễm
trùng máu. Vi khuẩn tác ñộng lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể
xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy thai, ñẻ non hoặc nhiễm trùng thai
nhi.
Listeria monocytogenes ñã ñược phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như
thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước. Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh
vật ở mọi công ñoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi trường, nguyên
2

liệu, ñiều kiện sản xuất, vận chuyển ñến sản phẩm cuối cùng. Nấu chín thực
phẩm là một biện pháp hữu hiệu ñể giảm nguy cơ nhiễm bệnh.
phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng như: nôn mửa,
tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu…
4

- Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tôi quyết ñịnh thực hiện
ñề tài: “quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản ñông lạnh”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.
- Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm
hiểu các phương pháp xác ñịnh Listeria monocytogenes trong các sản
phẩm thủy sản ñông lạnh.

5

có chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm rất cao.
2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam.
- Trong 3 mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia ñã thực hiện ñề tài
nghiên cứu: “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản
ñông lạnh và chế biến trên ñịa bàn Hà Nội”. Kết quả kiểm tra vi sinh vật
tại phòng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản ñông lạnh và chế
biến sẵn (ñược lấy ngẫu nhiên) từ một số chợ và siêu thị trong 6 quận
thành Hà Nội cho thấy 82 mẫu không ñạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực
phẩm. Trong ñó có 36 mẩu cá ñông lạnh, 29 mẫu tôm, cua sơ chế, 8 mẫu
tép và 6 mẫu nem chả giò…
- ðặt biệt có tới gần 30% mẫu không ñạt nhiễm một số loại vi sinh vật vượt
quá giới hạn cho phép. Trong dó có 49 mẫu không ñạt tiêu chuẩn về
Coliforms ( chiếm 16.3%), 34 mẫu không ñạt về E.coli (11%), 28 mẫu
không ñạt về C.perfrigens (9.3%) và 7 mẫu không ñạt về Vibrio
parahaemolyticus(2.3%). Trong 28 mẫu nhiễm C.perfrigens chủ yếu là:
mẫu mắm tôm, mắm tép… có thể gây ngộ ñộc bất cứ lúc nào. Nguy hại
hơn cả là trong hải sản ñông lạnh có vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
ñươc xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ ñộc thức ăn do cá biển
và hải sản. Bệnh hầu hết xãy ra vào mùa hè ñối với những người ăn gỏi cá
và những thực phẩm chưa chín, có thể gây ngộ ñộc, gây ñau bụng, nôn,
sốt, ñặc biệt là gây ra tiêu chảy.
2.1.3. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản trên thế giới.
7

- Ngộ ñộc tiêu chảy ñược phát hiện vào năm 1976 từ con trai nhiễm ñộc tại
Nhật Bản.
- Ngộ ñộc Venerupin ñầu tiên bùng phát do ăn hào và nghêu chỉ có trong
vùng biển nước Nhật vào một thời ñiểm ñặt biệt nào ñó trong năm, chất
ñộc tạo ra bở nhiều sinh vật sinh sản mau lẹ, rất nhiều trong cuối mùa
ñông, ñôi khi xuất hiện ngoài khơi nước Bồ ðào Nha. Cơn bệnh có thể

quan ñến các sản phẩm cá kiếm và nhuyễn thể chân ñầu. Số lần cảnh báo
về lây nhiễm thủy ngân trong cá kiếm năm 2004 là 30 lần, tăng nhẹ so với
năm 2004.
2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes.
2.2.1. Lịch sử phát hiện. Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes.
9

- Chi Listeria ñược ñặt theo tên nhà ngoại khoa người Anh, Joseph Lister.
Năm 1918, một loại vi khuẩn tương tự như Erysipelothrix rhusiopathiae
ñược phân lập từ dịch não tủy của một quân nhân người Pháp. Chủng vi
khuẩn này ñược lưu giữ tại viện Pasteur Paris, nhưng phải nhiều năm sau
ñó, vi khuẩn này mới ñược mệnh danh là Listeria monocytogenes.
- Năm 1924, Murray và cộng sự, trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnh
trên các ñộng vật thí nghiệm, ñã phân lập ñược một chủng vi khuẩn từ các
hạch Lympho của các ñộng vật bị bệnh. Sau ñó , lấy vi khuẩn này tiêm cho
các con khỏe mạnh thì thấy ở chúng, có hiện tượng tăng bạch cầu ñơn
nhân, tương tự như bệnh của quân nhân người Pháp nói trên. Vì vậy, ông
ñặt tên cho nó là: Bacillus monocytogenes. Ba năm sau, tại Nam Phi, Piie
khi ñó ñang nghiên cứu sự mang Yersinia peptis trên chuột ñã phân lập
ñược một vi khuẩn từ gan chuột và ông ñặt tên nó là Listeria hepatolytica.
Trực khuẩn này không thể phân biệt với Bacillus monocytogenes và chủng
vi khuẩn lưu giữ ở viện Pasteur Paris. Chính vì vậy, pirie ñã ñề xuất một
tên mới chỉ chung cho các chủng này là Listeria monocytogenes.
- Năm 1929, Nyfeldt phân lập ñược Listeria monocytogenes từ máu của một
bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch và ông tin rằng ñó là tác nhân gây
bệnh tăng bạch cầu ñơn nhân nhiễm trùng. Tất nhiên, nhiều tác giả khác ñã
không ñồng ý với lập luận của Nifeldt. Nhiều năm sau ñó, những công bố


 Bộ: Bacillales.
 Họ: Listeriaceae.
 Giống: Listeria.
- Hiện tại có 7 loài Listeria ñược công nhận:
 Listeria monocytogenes.
 Listeria ivanovii.
 Listeria innocua.
 Listeria wells.
 Listeria seeligeri.
 Listeria grayi (loài này hiện bao gồm cả loài cấp dưới Listeria murayi.).
- Trong ñó, các loài này chỉ có 2 loài gây bệnh qua thực nghiệm và tự nhiên,
Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii. Trước kia, chúng gây bệnh
cho người và ñộng vật, sau này chúng gây bệnh chủ yếu cho ñộng vật. Cả
2 loài này và loài Listeria seeligeri ñều sản sinh ra β_ haemolysis trên
Sheep Blood Agar và ñây chính là sợi dây nối kết với mầm bệnh. Tuy
nhiên, Listeria seeligeri không gây bệnh vì thế không thể xem xét một
cách riêng biệt ñặc ñiểm này như là một giả ñịnh về khả năng gây bệnh
của các loài Listeria.
2.2.3. ðặc ñiểm chung của chi Listeria.
- Mối liên quan giữa các loài trong chi Listeria là chủ ñề ñược tranh luận
nhiều nhất. Ban ñầu, chi này ñược cho là một thành viên của họ
Corynebacteriaceae, bởi vì các ñặc ñiểm hình thái học và sau ñó nghiên
cứu phân loại hóa học lại cho thấy các loài Listeria tương ñối khác biệt so
với Corynebacteriaceae. Cho ñến năm 1984, trình tự từng phần với 16S
rRNA ñã khẳng ñịnh chính xác vị trí trên cây di truyền của chi Listeria
12

trong nhóm Clostridium- Bacillus-Lactobacillus, với Brochothrix
thermosphacta là gần nhất.

13

- Kháng nguyên chính của các loài Listeria là kháng nguyên thân (O) và
kháng nguyên lông (H).Quy trình ñịnh type huyết thanh hiện nay dựa trên
các kháng nguyên này, ñã phân loại ñược 6 nhóm huyết thanh (1/2, 3, 4, 5,
6 và 7) và phân loại sâu hơn thành các serovar cho tất cả các loài trừ
Listeria grayu và Listeria invanoii. Trong khi Listeria invanoii và Listeria
welshimeri có thể ñược phân biệt với Listeria monocytogenes khẳng ñịnh
type huyết thanh thì các loài khác có thể có chung một hoặc nhiều kháng
nguyên trùng với Listeria monocytogenes. Ví dụ, một số chủng Listeria
seeligeri có thể không phân biệt ñược về mặt kháng nguyên so với chủng
thuộc Listeria monocytogenes ở nhó, huyết thanh ½. Cũng cần lưu ý rằng,
mặc dù có 13 serovar của Listeria monocytogenes mới ñược xác ñịnh hiện
nay, trong khi hơn 90% các chủng phân lập trên lâm sang chỉ thuộc về 3
serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, ñiều này làm hạn chế giá trị của kỹ thuật này
trong các nghiên cứu dịch tễ học. Các ñặc tính quan trọng ñược liệt kê ở
Bảng 2.1 Dùng ñể phân biệt các loài Listeria.
Loại test
L.monocytogenes
L.innocua
L.seeligeri
L.ivanovii
L.welshimeri
Subsp.grayi
Subsp.murrayi
Tan máu beta (β)
CAMP test với
S.aureus
R.equi
Khử Nitrate

-

-

-
14

Acid từ
D-Manitol
L-Rhamnose
D-Xylose
α-Methyl-D-
glucoside
α-Methyl-D-
mannoside

-
-
+

-
+
+
-

+
-

-
V
V
-
+
-

-
V
V
+
+
V

-
V
V

Với (+) ≥ 90% các chủng dương tính.
(-) ≤ 10% các chủng dương tính.
(V) 11-89% các chủng dương tính.

ñiện, không phân cực, và có tính kỵ nước.
16Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes.
- Chức năng chủ yếu của màng.
- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao ñổi chất.
- Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường của tế bào.
- Là nơi sinh tổng hợp của thành phần tế bào và các polymer của bao nhầy.
- Là nơi sinh tổng hợp của nhiều enzyme, các protein của chuỗi hô hấp.
- Cung cấp năng lượng cho sự hoạt ñộng của tiên mao.
- Tiên mao: chúng quyết ñịnh khả năng và phu7o7nmg pháp di ñộng của vi
khuẩn, tiên mao là nhũng sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có
17

thể quan sát cấu trúc khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển
vi ñiện tử có thể thấy rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao.
- Thành tế bào:
- Peptidoglycan chiếm 30 – 95%, là loại xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi ba
thành phần:
- N-Acetylglucolsamin (NAG)
- Acid N0- acetylmuramic (NAM)
- Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin.
- Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc
nhuộm tím tinh thể.
- Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau :
- Tham gia quá trình trao ñổi chất.
- Là nơi chứa ñựng nhiều chất có chứa hoạt tính sinh học.
- Bao nhầy :
- Bào vệ vi khuẩn trong ñiều kiện khô hạn.

gen hly mã hoá protein tạo ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân
gây bệnh Listeriosis ở người và ñộng vật, plcA mã hoá tạo PI-PLC và gen
19

plcB mã hoá tạo PC-PLC, gen inlA ,mã hoá cho internalin A, gen inlB mã
hoá cho internalin B, gen inlC mã hoá cho internalin C. tất cả các gen này
ñều phụ thuộpc vào gen prfA.
2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO).
_ Listeriosin A (LLO) là một ñộc tố protêin ñược tiết bởi L.monocytogenes
thóat khỏi không bào và thực bào chủ có trọng lựơng 58.6 kDa, hình thành
1 chuỗi polypeptide gồm 529 amino acid. Trình tự ñầu N có ñặc ñiểm là
phần ñầu có tính ái nước, mang ñiện tích dương và ñượ theo sau bởi 20
ñầu kỵ nước. trình tự này mã hoá trực tiếp cho protein và ñược phân cắt
sau vị trí lysine 25. kết quả là LLO ñược bắt ñầu từ amino axit thứ 26 và
có trọng lượng phân tử là 55.8kDa, dài 504 axit amin.
_ LLO thuộc nhóm ñộc tố gắn lên cholesterol ñược hoạt hoá bởi nhóm thiol
ñược tạo ra ở hầu hết các vi khuẩn Gram (+).
_ Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan ñến pH của môi trường. Nó
hoạt ñộng cao nhất ở pH 5.5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7.0. Sự phát
hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của
Listeria monocytogenes. Sau quá trình thực bào, môi trường acid của
không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hoá LLO. Chính ñộc tố này xúc
tiến quá trình ly giải không bào và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất,
trong khi ñó pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO.
2.2.6.3. Vai trò của yếu tố ñộc lực.
_ Listeria monocytogenes tồn tại trong môi trường ña dạng như: môi trường
sống bao gồm ñất, nước, thức phẩm, ñộng vật. Gen prfA quy ñịnh sự biểu
hiện của các gen có tính ñộc ñó. Bên ngoài tế bào chủ, gen prfA tồn tại ở

Trích đoạn Thuyết minh quy trình Quy trình thực hiện phân tích Phương pháp lai phân tử

---