BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO
KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ
Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ii
MỤC LỤC
i. Danh mục các từ viết tắt 1
ii. Danh mục các hình 2
iii. Danh mục các bảng, biểu ñồ, sơ ñồ 3
CHƯƠNG MỞ ðẦU 4
1. Tính cấp thiết của ñề tài 5
2. Mục ñích nghiên cứu 5
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 5
4. Phương pháp nghiên cứu 5
5. Các kết quả ñạt ñược của ñề tài 6
Chương 1: TỒNG QUAN BỆNH LAO 7
1.1. Bệnh lao 8
1.1.1. Lịch sử bệnh lao 8
1.1.2. Khái niệm về bệnh lao 8
1.2. Tình hình dịch tễ bệnh lao 8
1.2.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới 8
1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 9
3.2.3. Phương pháp Real-time PCR 32
Chương 4: QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LAO KHÁNG THUỐC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 35
4.1. Giới thiệu quy trình 36
4.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất 36
4.2.1. Vật liệu sinh học 36
4.2.2. Mồi và mẫu dò 36
4.2.3. Thiết bị, dụng cụ 38
4.2.4. Hóa chất 39
4.3. Quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng phương pháp real-time PCR
4.3.1. Mẫu 41
4.3.1.1. Thu mẫu 41
4.3.1.2. Xử lý mẫu 41
4.3.2. Tách chiết DNA 41
iv
4.3.3. Thực hiện Real-time PCR 42
4.3.4. ðọc kết quả 46
4.3.5. Nhận xét quy trình 46
Chương 5: KẾT LUẬN 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
N-acetyl-L-cystein
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCR : Polymerase Chain Reaction
RIF : Rifampicin
RNA : Ribonucleic Acid
RMP : Rifampicin
Taq-DNA polymerase: Thermus Aquaticus DNA Polymerase
TB : Tuberculosis
XDR : Extensively Drug-resistant
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 2DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 : Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi 11
Hình 1.2 : Hình ảnh Mycobacterium tuberculosis hiển vi ñiện tử quét 11
Hình 1.3 : Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis 12
Hình 2.1 : Tình hình bệnh lao kháng thuốc trên thế giới 17
Hình 2.2 : Tình hình bệnh lao ở Việt Nam 18
Hình 2.3 : Hình ảnh vách tế bào vi khuẩn lao 20
Hình 2.4 : ðột biến trong vùng 81 bp codon 507-533 gen rpoB 21
Hình 2.5 : Vùng khả năng bị ñột biến 22
Hình 2.6 : ðột biến trong codon Ser95 22
Hình 3.1 : Hình ảnh lao chụp x-quang 26
Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp 27
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 4
Bệnh lao ñã xuất hiện hàng nghìn năm nay và là căn bệnh khó chữa trị. Hiện nay
có khoảng 1/3 dân số trên thế giới ñã nhiễm lao, mỗi năm có khoảng 3 triệu người chết vì
lao. Nguyên nhân gây bệnh lao là vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. ðây là vi khuẩn
hình que, dài từ 3-5µm, rộng từ 0,3 - 0,5µm, không có tiêm mao, hai ñầu tròn, tế bào có
hạt.
Trong những năm 70-80 công tác phòng chống và ñiều trị lao ñã trở nên không
hữu hiệu do có sự xuất hiện của các chủng lao kháng thuốc khó chữa trị và có nguy cơ lây
lan nhanh và ñã làm cho số người mắc bệnh, tử vong tăng cao. Những người mắc chủng
vi khuẩn lao mới này phải ñiều trị trên 2 năm so với ñiều trị 6- 8 tháng như trước kia và
chi phí tăng lên gấp 100 lần. Tổ chức Y tế thế giới ước tính, ñến nay ñã có 2700 ca bệnh
lao kháng thuốc ở 41 quốc gia. Việc ñiều trị cho bệnh nhân lao kháng thuốc hết sức
nghiêm ngặt và cần phải theo dõi liên tục.
Vi khuẩn lao có thời gian sinh sản và tăng trưởng chậm nên các phương pháp như:
nuôi cấy truyền thống, nhuộm soi ñàm mất nhiều thời gian, chậm trễ trong phát hiện và
ñiều trị bệnh lao. Chính vì vậy một phương pháp phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc
nhanh chóng và chính xác là ñiều cần thiết nhất. ðề tài thực hiện nhằm tìm hiểu về quy
trình phát hiện vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc bằng một số kỹ
thuật sinh học phân tử nhằm cung cấp thêm một số thông tin về vấn ñề này.
2. Mục ñích nghiên cứu
Tìm hiểu về quy trình chẩn ñoán bệnh lao kháng thuốc phương pháp sinh học phân
tử, giúp phát hiện bệnh nhanh chóng và chính xác ñể ñiều trị kịp thời.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tìm hiểu về quy trình phát hiện lao kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
ðánh giá ñược ñộ nhạy và chính xác của quy trình.
4. Phương pháp nghiên cứu
Thu thập tài liệu.
Tìm hiểu các quy trình phát hiện khuẩn lao.
Xác ñịnh quy trình về mặt lý thuyết.
Dự ñoán ñánh giá quy trình ñề xuất.
Khoá luận tốt nghiệp
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 7
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VỀ BỆNH LAO Khoá luận tốt nghiệp
lao ở vùng này chiếm 1/3 tổng số ca lao trên toàn cầu, trong ñó 70% ca lao ở ñộ tuổi 15 –
54. Năm 2005 vùng này có 990000 ca lao ñược báo cáo, trong ñó 455000 ca là nguồn lây.
9/10 ca lao trong vùng ñược tìm thấy tại 7 quốc gia: Campuchia, Trung Quốc, Lào, Mông
Cổ, Papua New Guinea, Philippines và Việt Nam.
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 9Bảng 1.1: Thống kê tình hình bệnh lao trên thế giới năm 2009
“Nguồn: http://www.who.int”
Khu vực Tính trên ngàn dân % của tổng toàn cầu
Châu Phi 2800 30
Châu Mỹ 270 2,9
Châu Âu 420 4,5
ðông Nam Á 3300 35
ðông ðịa Trung Hải 660 7,1
Tây Thái Bình Dương 1900 21
Tổng số toàn cầu 9400 100
1.2.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Trong giai ñoạn từ 1997 – 2002 phát hiện 530 nghìn bệnh nhân lao các thể, ñã ñiều
trị 260 nghìn bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi là 92%. So với khu vực Tây Thái Bình
Dương, Việt Nam chiếm 12% bệnh nhân nhiễm lao các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi
mới.
Tính ñến thời ñiểm tháng 7 năm 2006, Việt Nam xếp thứ 13 trong 22 nước có số
lượng bệnh nhân lao cao nhất thế giới. Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam
ñứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philippin.
Họ: Mycobacteriaceae
Chi: Mycobacterium
Loài: Mycobacterium tuberculosis
Phân loại dựa vào ñối tượng gây bệnh cho người và các vật, vi khuẩn lao bao gồm:
- Vi khuẩn lao người - Mycobacterium tuberculosis homonis.
- Vi khuẩn lao bò - Mycobacterium bovis.
- Vi khuẩn lao chim - Mycobacterium avium.
- Vi khuẩn lao chuột - Mycobacterium microti.
Phân loại dựa trên ñoạn gen IS6110 chiều dài 1361 bp nằm trong cấu trúc DNA
của vi khuẩn thì chỉ có ở 4 loài Mycobacteria là M.tuberculosis, M.bovis, M. microti,
M.africanum (gọi chung là M.tuberculosis complex), mà không có ở các Mycobacteria
khác. Tại khoa vi sinh của Bệnh viện Lao- Phổi Trung ương, các nhà nghiên cứu nhận
thấy 71% các chủng vi khuẩn lao hiện nay có từ 5 ñoạn IS6110 trở xuống, trong khi vi
khuẩn cổ ñiển tỷ lệ này là 10%.
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 11 1.3.2.ðặc ñiểm
Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn lao chụp dưới kính hiển vi
“Nguồn:
Vi khuẩn lao sinh sản chậm, trong ñiều kiện bình thường, trung bình 20-24 giờ
sinh sản một lần và có khi hàng tháng chúng mới sinh sản, thậm chí có thể nằm ở vùng
tổn thương rất lâu mà không sinh sản hay hoạt ñộng khi gặp ñiều kiện thuận lợi thì chúng
phát triển trở lại.
1.3.3 Bộ gen của vi khuẩn lao
Bộ gen của vi khuẩn lao ñã ñược giải trình tự vào năm 1998, có chiều dài 4411522
bp trong ñó có 3924 bp trình tự ñược dự ñoán là mã hóa protein, tỷ lệ G + C chiếm ñến
65,6%. Bộ gen của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có 6
gen giả. [20]
Gen IS6110 phân bố rải rác nhiều nơi trong bộ gen. ðây là ñoạn gen có tính bảo
tồn cao. Các phương pháp PCR, real-time PCR phát hiện vi khuẩn Mycobacterium
tuberculosis ñều dựa trên tín hiệu khuếch ñại vùng gen này. Hình 1.3: Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis
“Nguồn: http:/www.Clcbio.com” Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 13 1.4. Nguồn lây, ñường xâm nhiễm và diễn biến bệnh
1.4.1. Nguồn lây [6]
Tất cả các bệnh nhân lao ñều có thể là nguồn lây, nhưng mức ñộ rất khác nhau.
ðối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, lao màng bụng, xương khớp…) ñược gọi là
các thể lao “kín”, vi khuẩn ít có khả năng lây nhiễm. Ngược lại, lao phổi là thể bệnh dễ
ñưa vi khuẩn ra bên ngoài. Vì vậy lao phổi là nguồn lây quan trọng nhất. Nhưng ngay ñối
thể, nhưng miễn dịch ñầy ñủ của cơ thể chống lại bệnh lao phải sau 2-3 tháng.
Như vậy nhiễm lao là giai ñoạn ñầu tiên khi vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gây
những tổn thương ñặc hiệu. ða số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể hình
thành dị ứng và miễn dịch chống lao.
+ Bệnh lao [6]
ðây là giai ñoạn vi khuẩn ñã vào máu và gây ra tổn thương tại các cơ quan trong
cơ thể. Vi khuẩn lao có thể gián tiếp theo mạch bạch huyết ñến các nốt bạch huyết ở
cuống phổi hoặc vùng trung thất và sau ñó theo hệ thống ống dẫn ở lồng ngực vào trong
dòng máu, hoặc trực tiếp vào dòng máu từ hệ thống mạch máu ở vùng phổi có các u lao.
Khi ñã xâm nhập thành công vào dòng máu, chúng lan tỏa khắp cơ thể, tạo vô số ổ nhiễm,
với biểu hiện là củ lao màu trắng ở mô.
Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, chúng có thể sống tiềm ẩn, khi sức ñề
kháng của cơ thể suy yếu thì chúng mới phát triển và tấn công gây bệnh. Việc chuyển từ
nhiễm lao sang bệnh lao phụ thuộc vào ba yếu tố chính: số lượng và ñộc tính của vi khuẩn
lao, sức ñề kháng của cơ thể. Khoá luận tốt nghiệp Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 16 2.1. Lịch sử bệnh lao kháng thuốc
Bệnh lao kháng thuốc lần ñầu tiên ñược xác ñịnh trong năm 2006. Bệnh ñược phát
hiện ở 57 quốc qia và gây khó khăn ñiều trị. Bệnh lao kháng thuốc phổ biến ở ðông Âu,
Liên Xô cũ, Trung Quốc và Ấn ðộ và ñang tăng lên ở châu Phi. MDR-TB là viết tắt của
nhiều bệnh lao kháng thuốc, nó kháng với hai trong số các loại thuốc bệnh lao hiệu quả
nhất dòng ñầu tiên. Lao XDR- kháng thuốc diện rộng bệnh lao, mô tả một hình thức cao
gây chết người của bệnh lao kháng thuốc. [32]
2.2. Tình hình bệnh lao kháng thuốc
2.2.1. Trên thế giới
Tổ chức Y tế Thế giới mở cuộc khảo sát dựa vào số liệu của các phòng thí nghiệm
chuẩn trên thế giới. Trong số 17.690 mẫu phân lập ñược từ năm 2000-2004 và từ nhiều
quốc gia có 20% chủng kháng nhiều thuốc (MDR-TB), 2% chủng kháng thuốc diện rộng
(XDR-TB). Lao kháng thuốc diện rộng xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhiều nhất ở
Hàn Quốc là nơi có ñiều tra dịch tễ về ñộ nhạy của vi khuẩn, ðông Âu và Tây Á châu.
Bệnh nhân bị lao kháng thuốc diện rộng có tỉ lệ tử vong cao hơn bệnh nhân khác.
[31]
Ở Hoa kỳ trong 169654 trường hợp lao từ năm 1993 ñến 2004 có 1.6% vi khuẩn
kháng nhiều thuốc, 0,04% là kháng thuốc diện rộng. Tuy bệnh lao ở Hoa kỳ giảm, số lao
kháng nhiều thuốc tăng từ 113 trong năm 2003 lên 128 trong năm 2004. Tuy các con số
100000 dân
Chưa thống kê
Khố luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 1835%
27.70%
15.30%
17%
10.30%
2.90%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
kháng bất kỳ kháng isoniazid MDR
qua điều trò
nhiễm mới
Biểu đồ 2.1: Tỷ lệ kháng thuốc trong các ca đã trải qua điều trị và nhiễm mới
Việt Nam trải qua một thời gian dài nghiên cứu, vào tháng 5 năm 2011, PGS-TS Nguyễn
Thái Sơn, chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh Y học Bệnh viện 103 (Học viện Quân y - Bộ Quốc
Phòng) và các cộng sự ñã nghiên cứu thành công bộ kít ña mồi có tên mPCR, giúp nâng
cao hiệu quả chẩn ñoán vi khuẩn lao. Bộ kít ña mồi có chứa các cặp mồi dùng phát hiện 3
gen ñặc hiệu (IS6110, IS1081, 23S rDNA) của vi khuẩn lao trong cùng một phản ứng,
trong khi kít nhập ngoại chỉ phát hiện một gen (IS6110). Do ñó, kít ña mồi không bỏ sót
chẩn ñoán, ñồng nghĩa với việc hạn chế nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn lao ra cộng ñồng, hạn
chế biến chứng ở người bệnh và giúp kiểm soát bệnh lao ñược tốt hơn. Mặt khác giá
thành dự kiến của bộ kit này chỉ bằng 1/2 so với kit nhập ngoại. Với bộ kit này, các cơ sở
y tế có thể phát hiện vi khuẩn lao trong vòng 24 giờ vì chúng ñạt ñộ nhạy, ñộ ñặc hiệu ñến
trên 90%.
► Xét nghiệm bệnh lao phổi trong vòng 100 phút: [29]
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ñã ñưa vào sử dụng trên toàn cầu thiết bị xét nghiệm
mới cho phép chẩn ñoán và phát hiện nhanh, chính xác bệnh lao phổi trong vòng 100
phút. Giá thành thiết bị này sẽ ñược giảm 75% cho 116 nước thu nhập trung bình và thấp
trên thế giới, mở ra triển vọng ñiều trị và kiểm soát bệnh lao phổi hiệu quả ở cả những
nước nghèo và chậm phát triển nhất thế giới.
Xét nghiệm mới này ñược gọi là "xét nghiệm khuếch ñại axít nucleic" (Nucleic
acid amplification tests) ñược thử nghiệm lâm sàng trong 18 tháng ñã chứng tỏ hiệu quả
Khoá luận tốt nghiệp
SVTH: LƯ NHẬT HUY
Trang 20chính xác trong chẩn ñoán phát hiện sớm bệnh lao phổi, bệnh lao kháng nhiều thuốc
(MDR-TB) và bệnh lao bội nhiễm HIV rất khó phát hiện.
Phương pháp xét nghiệm mới có hiệu quả cao gấp 3 lần so với xét nghiệm hiện
hành, ñặc biệt ñối với các bệnh lao kháng thuốc và gấp 2 lần ñối với bệnh lao bội nhiễm
HIV. Xét nghiệm Nucleic acid amplification tests kết hợp với công nghệ DNA hiện ñại
plasma
P
eptidoglycan
M
ycolic
Lipoarabinomanna
Thành tế bào
xương
Copyright: Tài liệu đại học ©