BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER
SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỜI CẢM ƠN

Trải qua ba năm học dưới mái trường đại học kỹ thuật công nghệ, được sự
giúp đỡ tận tình của các thầy cô, nay đã hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp. Nhờ
trong quá trình làm bài khóa luận, mà em đã học được nhiều kiến thức mà trước đó
em chưa hề biết.
Em xin chân thành cám ơn các thầy cô khoa Môi trường và công nghệ sinh
học, đã giúp đỡ em tận tình trong ba năm học vừa qua để hoàn thành khóa học. Em
xin cám ơn giáo viên hướng dẩn đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm
bài khóa luận tốt nghiệp.
Một điều không thể thiếu, đó chính là gia đình, cha mẹ đã động viên em,
giúp em có thêm tinh thần, vượt qua được khó khăn về tinh thần, cũng như về vật
chất. Nhờ vậy, mà em có thể hoàn thành khóa học và hoàn thành bài khóa luận tốt
nghiệp này.
Ngoài thầy cô và gia đình ra, một điều quan trọng không thể thiếu, đó chính
là tập thể các bạn lớp 08CSH trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ. Chính nhờ các
bạn, giúp đỡ động viên rất nhiều trong quá trình học tập, cũng như trong đời sống.

Em xin chân thành cám ơn!!!
TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011
Sinh viên
Vương Minh Đạt

2.2.1.4. Yếu tố độc lực 7
2.2.1.5. Khả năng gây bệnh 8
2.2.1.6. Các thực phẩm liên quan 9
2.2.2. Escherichia Coli 9
2.2.2.1. Giới thiệu 9
2.2.2.2. Phân loại 9
2.2.2.3. Hình thái, cấu trúc 10
2.2.2.4. Đặc điểm 10
ii

2.2.2.5. Khả năng gây bệnh 11
2.2.2.6. Các thực phẩm liên quan 12
2.3. Tổng quan về Enterobacter sakazakii 13
2.3.1. Lịch sử phát hiện 13
2.3.2. Phân loại 13
2.3.3 Đặc điểm 14
2.2.3.1. Đặc điểm chung 14
2.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa 16
2.3.4. Cấu trúc 16
2.3.4.1. Thành tế bào 17
2.3.4.2. Màng sinh học 18
2.3.4.3. Tiên mao 19
2.3.5. Yếu tố độc lực 20
2.3.6. Cơ chế gây bệnh 21
2.2.6.1. Các nguồn nhiễm bệnh 21
2.2.6.2. Triệu chứng 21
2.2.7. Các biện pháp phòng và xử lí bệnh 22

3.1.10.3. Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase 34
3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase 34
3.1.10.5. Phép thử lên men các loại đường khác nhau 34
3.1.10.6. Phép thử chỉ sử dụng Citrate 34
3.1.10.7. Thử nghiệm Nitrate 35
3.1.10.8. Thử nghiệm ONPG 36
3.1.10.9. Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm 37
3.1.9.10. Thử nghiệm VP (voges-proskauer) 38
3.2. Các phương pháp hiện đại 39
3.2.1. Phương pháp PCR 39
3.2.1.1. lịch sử phát triển 40
3.2.1.2. Nguyên tắc 40
3.2.1.3. Các thành phần tham gia vào quá trình PCR 41
3.2.1.4. Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR 43
3.2.2. Phương pháp real time PCR 46
3.2.2.1. Lịch sử phát triển 46
iv

3.2.2.2. Khái niệm và nguyên lí hoạt động 47
3.2.2.3. Phương pháp tiến hành 49
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 52
4.2. Kiến nghị 53
Tài liệu tham khảo 55
PHỤ LỤC 56
TM
: Môi trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định
TSA: Tryptone Soya Agar
EE: Enrichment Enterobacteriaceae
ONPG: O-Nitrophenyl-p-D-galactopyranoside
MR-VP: Methyl red – Voges Proskauer
KIA: Kligler Iron Agar
TSI: Triple Sugar Iron Agar
PCR: Polymerase Chain Reaction
vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột
Bảng 2.2. Thành phần chất béo có trong sữa bò

Hình 2.2: Vi khuẩn Escherichia Coli
Hình 2.3: Trẻ em bị viêm màng não do sử dụng sữa bột nhiễm E. sakazakii
Hình 2.4: E.sakazakii dưới kính hiển vi
Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E. sakazakii
Hình 2.6: Cấu trúc tế bào Gram –
Hình 2.7: 5 bước phát triển của màng sinh học
Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao
Hình 2.9: Hai loại sữa điển hình nhiễm E. sakazakii
Hình 3.1: E. sakazakii trong môi trường ESIA
Hình 3.2: E. sakazakii trên môi trương thạch TSA
Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance
Enterobacter sakazakii Agar
Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey
Hình 3.5: Kết quả thử nghiệm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ
Hình 3.6: Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng
Hình 3.7: Kết quả thử nghiệm VP ( Voges-Proskauer)
Hình 3.8: Cơ chế của phản ứng PCR
Hình 3.9: Kết quả sau khi điện di
Hình 3.10: Sơ đồ phát quang của Taqman-probe
Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500.
Hình 3.12: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên
gene OmpA của E. sakazakii
1

2

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN
2.1 Giá trị dinh dưỡng của sữa bột
2.1.1 Đường lactose
Glucid của sữa là lactose hay còn gọi là đường sữa, trung bình mỗi 1 lít sữa
bột có 50g. Lactose là một disaccharide do một phân tử glucose liên kết với một
phân tử galactose tạo thành, enzyme lactase phân hủy đường lactose thành
monosacarit
Trong sữa đường lactose tồn tại dưới 2 dạng
 Dạng α-lactose mono hydrat C
12
H
22
O
11
H
2
O
 Dạng β-lactose anhydrous C
12
H
22
O
11

Ngoài ra trong sữa bò còn chứa các loại đường khác nhưng hàm lượng rất
thấp

Ngoài ra trong sữa còn có các loại protein màng, hàm lượng của chúng rất
thấp
- Enzyme
Enzyme do tuyến vú tiết ra hoặc do vi sinh vật trong sữa tổng hợp nên. Sự
có mặt của enzyme là nguyên nhân gây ra biến đổi thành phần hóa học của sữa
trong quá trình bảo quản, dẫn đến chất lượng sữa hư hỏng. Nhưng một số loại
enzyme trong sữa có khả năng kháng khuẩn như lactoperoxydase, lysozyme. Hàm
lượng vi sinh vật càng nhiều thì thành phần enzyme càng đa dạng, có 60 loại
enzyme trong sữa
Lactoperoxidase: Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa oxy từ H
2
O
2
,
đến các chất oxy hóa khác
Catalase: Enzyme này luôn có trong sữa do tuyến vú tiết ra, xúc tác phân
hủy H
2
O
2
, thành nước và oxy tự do
Lipase: enzyme quan trọng nhất trong sữa,là một glycoprotein, xúc tác thủy
phân liên kết ester trong cơ chất triglyceride
Protease: enzyme này xúc tác phân hủy protein. Có 2 loại protease là :
protease kiềm và protease axit
Ngoài ra còn có các loại enzyme khác như : phosphatase, phosphatase acid.
2.1.3 Chất béo
Chất béo là một trong những thành phần quan trọng nhất của sữa. Hàm
lượng chất béo của sữa thay đổi trong một phạm vi khá rộng. Có loại sữa ít


Cholesteride
Ceride
98,5
95-96
2-3
0,1
0,03
0,02
Ester của acid béo và
cholesterol
Ester của acid béo và
rượu cao phân tử
5

2.1.4. Chất khoáng
Hàm lượng chất khoáng trong sữa dao động từ 8-10g/l, các chất khoáng
trong sữa dạng hòa tan hoặc dung dịch dạng keo dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ và pH
các muối trong sữa đều ở dạng dễ đồng hóa.
Các nguyên tố chiếm hàm lượng cao nhất là Ca, P, Mg, K,
Các nguyên tố khác như K, Na, Cl đóng vai trò là chất điện ly. Và Zn, Al,
I, Cu, Mn, Ag… chúng cần thiết cho quá trình dinh dưỡng của con người
Bảng 2.3. Thành phần chất khoáng có trong sữa bột
[1]



Thành phần Khối lương/100g
Natri
Muối
Kali
Magiê
Canxi
Photpho
Kẽm
Iôt
Selen
560,0 mg
1426,9 mg
1710,0 mg
126,0 mg
1360,0 mg
980 mg
0,4 mg
130 µg
20 µg
6 Bảng 2.4. các thành phần vitamin trong sữa
[1]
Vitamin

Mg/100g

Vitamin

Mg/100g

A
D
E
B1
B2
B12
0,3
0,001
1,4
0,4
1,7
0,5

B6
B3
B5
C
H
M
0,005
1
3

Tạo ra hemolysin beta gây phá hủy tế bào máu
2.2.1.4 Yếu tố độc lực
Vi khuẩn L. monocytogenes có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào
chủ (của bệnh nhân) và làm thay đổi một vài chức năng của tế bào trong chiều
hướng có lợi cho vi khuẩn để chúng thoát khỏi hệ thống phòng vệ của cơ thể. Nhờ
vào chiến thuật này, vi khuẩn có thể dễ dàng vượt qua hàng rào của vùng ruột cũng
như của một số bộ phận khác trong cơ thể.
8

Nhóm khảo cứu Pháp cho biết vi khuẩn L. monocytogenes sản xuất ra một
loại độc tố chuyên biệt có khả năng phá vỡ hệ thống SUMOYLATION tức là nguồn
máy phòng vệ tối quan trọng của tế bào chủ.
Ngày 15/2 trong tạp chí Thực nghiệm Y Khoa, tiến sĩ Laurel Lenz và đồng
sự đã công bố, đại thực bào bị Listeria xâm nhiễm phóng ra interferon αβ (IFN- αβ),
làm chúng và những tế bào miễn dịch lân cận không thể đáp ứng với các tín hiệu
hoạt hóa. Điều này làm giảm khả năng miễn dịch với vi khuẩn, gây ra hàng nghìn ca
ngộ độc thực phẩm và hơn 500 người chết mỗi năm ở Mỹ
2.2.1.5 Khả năng gây bệnh
Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria hay còn gọi là bệnh Listeriosis. Đây là tình
trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm bị nhiễm một loại vi
khuẩn có tên khoa học là Listeria monocytogenes. Loại vi khuẩn listeria này được
Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh
vực an toàn vệ sinh thực phẩm.
Hiện nay, chúng ta đã biết đến hai thể bệnh Listeriosis:
Listeriosis khu trú ở ruột: Bệnh chỉ khu trú ở hệ thống tiêu hóa. Người
bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm thường như sốt và đau mỏi
cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy.

trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của
E. coli trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. E. coli thuộc
họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho
các nghiên cứu về vi khuẩn.
E. Coli đóng vai trò quan trọng trong y tế, nó được sử dụng như là một
công cụ để sản xuất các loại thuốc thông qua việc chuyển gen vào các plasmid
2.2.2.2 Phân loại

10 Hình 2.2 : Vi khuẩn Escherichia Coli
Escherichia Coli là một trong những vi khuẩn đa dạng nhất, 20% của bộ
gen là chung cho tất cả các chủng, và phân thành nhiều loài khác nhau
2.2.2.3 Hình thái, cấu trúc
Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế
bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có
capsul. Kích thước trung bình (0,5µm x 1-3µm) hai đầu tròn. Một số dòng có lông

ra ngoài thiên nhiên.
 Bị ức chế bởi một số loại hóa chất như chlorine, mối mật, brillian
green
 Có khả năng lên men được nhiều loại đường, sinh hơi. Chúng có khả
năng khử nitrate thành nitrit.
 E.coli có enzyme trytophanase. Nếu trong môi trường có trytophan,
chúng sẽ phân giải trytophan thành Indol.
2.2.2.5 Khả năng gây bệnh
Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm
theo độc tố của chúng.
 Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết
gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh.
 Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc
thần kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác.
E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và
F41.Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của
từng serotyp. Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của
E.coli.
E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có. Bình thường, vi khuẩn
không gây tác hại trên ký chủ (10
3
cfu/g phân). Khi mật số tăng lên cao (10
6
– 10
9

cfu/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh.
Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường
miệng. Ở dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn.
Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc

loài gia súc. Nguồn E.coli trong ruột gia súc có thể được truyền qua quá trình chế
biến
Sữa chưa được tiệt trùng. Vi khuẩn E.coli được truyền sang sữa qua các
thiết bị vắt hoặc từ vú của động vật
Nước bị ô nhiễm : phân người và động vật có thể gây ô nhiễm mặt đất và
nguồn nước và nước tưới cây, trồng, uống hoặc sử dụng các nguồn nước này có thể
gây nhiễm E.coli 13

2.3. Tổng quan về Enterobacter sakazakii
2.3.1 Lịch sử phát hiện
1958 Enterobacter sakazakii được biết đến với sự mô tả như một sắc tố
màu vàng được Urmenyi và Franklin điều tra thông qua hai trường hợp nhiễm trùng
huyết và viêm màng não gây tử vong ở bệnh viện Osterhills tại Anh .
1980 E. sakazaki được định danh là một loài mới của họ
Enterrobacteriaceae. Đặt theo tên của Riichi Sakazakii nhà vi trùng học Nhật Bản
cho đóng góp quan trọng của ông về sự hiểu biết sinh học Vibrionaceae và
Enterobacteriaceae
1982 có 8 trường hợp bệnh viêm màng não ở trẻ sơ sinh gây ra bởi
E.sakazaki được phát hiện ở Hà Lan
1994 một đợt bùng phát nhiễm trùng E. sakazakii ở Pháp đã xảy ra trong
một khu vực chăm sóc trẻ sơ sinh trong đó có 17 trẻ sơ sinh bị nhiễm. 7 trường hợp
viêm ruột hoại tử, một trường hợp nhiễm trùng máu và một trường hợp gây viêm
màng não


và dữ liệu của tất cả 16 biogroup (Iversen et al., 2007). Đã đưa ra đề xuất phân loại
các chủng thành 1 chi mới Cronobacter.
Cronobacter spp được xem như là một chi mới của E. sakazakii. bằng các
phương pháp nêu trên nhiều loài đã được tìm ra như Cronobacter sakazakii; C.
turicensis; C. malonaticus; C. muytjensii; and C. dublinensis.
2.3.3 Đặc điểm

Hình 2.4: E. sakazakii dưới kính hiển vi
2.2.3.1 Đặc điểm chung
- Đặc điểm
15

E. sakazakii là một vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaciae và đủ
tiêu chuẩn là một vi khuẩn Coliform, chiều dài khoảng 3 µm và chiều rộng
hình que, kị khí tùy nghi, các tế bào di chuyển bằng tiên mao Peritrichous
và không hình thành bào tử, có khả năng tạo màng sinh học.
- Môi trường sống
E. sakazakii không phải là dạng sinh vật cư trú trong đường ruột của con
người. Ta có thể phân lập hàng loạt từ các mẫu môi trường (đất, nước), các loài gây
hại như (ruồi, chuột), từ thực phẩm và từ môi trường bệnh viện. E. sakazakii cũng
có thể được tìm thấy trong sữa bột, ngũ cốc, chocolate, bột mì và các khu vực sản