BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.
HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME
BROMELAIN TỪ VỎ DỨA
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC CHÂU
MSSV: 0811110006 Lớp: 08CSH2

Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii
MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu dề tài 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme 3
2.2. Enzyme protease 4
2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 5
2.2.1.1. Protease động vật 5
2.2.1.2 Protease thực vật 5
2.2.1.3. Protease vi sinh vật 6
2.2.2. Ứng dụng enzyme protease 9
2.3. Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 11
2.3.1. Giới thiệu enzyme bromelain 11
2.3.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain 11
2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12
2.3.3.1. Cấu tạo hoá học 12

3
) 20
3.2.2.1 Nguyên tắc 20
3.2.2.2. Tủa enzyme bằng cồn 96
0
20
3.2.2.3. Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH
4
)
2
SO
4
21
3.2.2.4. Tủa enzyme bằng aceton (CH
3
COCH
3
) 21
3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch
chiết enzyme 22

3.2.3.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 22
3.3. Enzyme cố định 28
3.3.1. Định nghĩa enzyme cố định 28
3.3.2. Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định 29
3.2.2.1. Ưu điểm 29
3.3.2.2. Nhược điểm 29
3.3.3. Một số phương pháp cố định enzyme 30
3.3.3.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)
30


3.3.7.1. Nguyên tắc 39
3.3.7.2. Thiết bị và hóa chất 39
3.3.7.3. Phương pháp 41
3.3.7.4. Xác định trọng lượng phân tử của enzyme Bromelain 43
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
4.1. Kết luận 44
4.2. Kiến nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản 15
Bảng 3.1. Tỷ lệ bằng cồn 96
o
đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 20
Bảng 3.2. Nồng độ tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 21
Bảng 3.3. Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 22

Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease 4
Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật 6
Hình 2.3. Vi khuẩn Clostridium 7
Hình 2.4. Vi khuẩn Bacillus 7
Hình 2.5. Nấm mốc 8
Hình 2.6. Xạ khuẩn 8
Hình 3.1. Thiết bị lọc gel áp suất thấp 35
Hình 3.2. Loại muối trước khi chạy sắc ký 38
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 1
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc
tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme
đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm
tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về công nghệ
enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả
như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản
xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những
thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột
protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa….
Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số
bệnh, đặc biệ
t là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số

4
)
2
SO
4
) và aceton ( CH
3
COCH
3
).
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.
Tinh sạch enzyme bromelain.
Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di. Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme
Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học. Chúng có khả năng xúc tác
đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc
tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản
ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợ
p.
Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động sống của
tế bào. Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm
phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi chất mà nhờ đó các chất
dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được lưu dữ và biến đổi, các đại phân
tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân đơ

− Nguồn động vật.
− Nguồn thực vật.
− Nguồn vi sinh vật.
2.2. Enzyme protease
Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân
liên kết peptit ( -CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối
cùng là axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết
este và vận chuyển axit amin.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và độ
ng vật ( gan, dạ
dày…). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất có thể tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhât .
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hi
ệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 5
2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease
2.2.1.1. Protease động vật
Tuy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều

SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 6

Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật.
2.2.1.3. Protease vi sinh vật
Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…gồm nhiều
loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số
loại nấm men.
 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai lo
ại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai lọai trên. Do đó
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao, chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus,
B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Trong
đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường
tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid
ưa béo và thơm.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 7
Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticis, và
một số giống chi Clostridium.

Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase ( Nhật ) được
tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân
tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 9
Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Protease
từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các peptide định
trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm cacboxyl hoặc
nhóm amine được l
ựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong
hệ hai pha lỏng.
2.2.2. Ứng dụng enzyme protease
Trong công nghiệp làm chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự
thủy phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có
vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. Có th
ể
ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định-phương pháp này phổ
biến và thuận lợi nhất: Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt ( enzyme, muối, bọt ngọt), tiêm
dung dịch enzyme vào thịt ( tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ ).
Trong chế biến thủy sản: Khi sản xuất nước mắm thường thời gian chế biến là
dài nhất, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thu
ộc rất nhiều địa phương, phương
pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày
đã được hoàn thiện nhờ sử dụng chế phẩm enzyme thực vật ( bromelain và papain )
và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm, cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy
nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về phần công nghệ.

ợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm .
+ Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,
kháng sinh,…
+ Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein,
sản xuất mỹ phẩm.
+ Sử dụng nhiều enzyme protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao
động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 11
2.3. Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa
2.3.1. Giới thiệu enzyme bromelain
Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19
nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain
được bắt đầu từ những năm 1968-1970.
Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc
biệt là từ thân ( EC-3.4.22.32 ) và trái dứa ( EC-3.4.22.33 ). Ở mỗi bộ phận khác
nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain
là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein
để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide ( Dương Thị
Hương Giang, 2004).

Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải
protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của
bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả invitro ( Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
2.3.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain
Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi

**

35 500
***
*
: Tính từ phương pháp sa lắng – khuếch tán.
**
: Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong.
***
: Tính bằng phương pháp Archibald.
2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain
2.3.3.1. Cấu tạo hoá học
Bromelain là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như
papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2
glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose ( Nguyễn Đức Lượng 2004).
Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –
NH
2
là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelin quả, acid amin đầu –
NH
2
là alanine ( Nguyễn Đức Lượng 2004).
2.3.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain
Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách
sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –


của chất nhận khác.
Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain. Casein và
hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
Đầu tiên, bromelain kết h
ợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide
và acid amin. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi
nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide.
Ở giai đoạn đầu, Zn
2+
rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm
hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết
phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin,
carboxyl…)

Enzyme –SH +Zn
2+
=> enzyme-S-Zn + H
+

Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc
không gian được bảo vệ ổn định.

Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 14
2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain
Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số
nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch.


ạnh tranh kìm hãm với
cơ chất ở trung tâm hoạt động của enzyme.
- Chất kìm hãm không cạnh tranh: làm thay đổi cấu trúc không gian của
phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác của enzyme.
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 15

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa
Là những chất anion, các ion kim loại, chất hữu cơ, có tác dụng làm tăng hoạt
tính xúc tác của enzyme trong giới hạn nồng độ xác định.

Ảnh hưởng bởi các ion kim loại
Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động,
do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme.
Vì bromelain thuộc nhóm
protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho
bromelain. Ví dụ: Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit…

Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –
SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate,
clo acetophenol, H
2
O
2
, methyl bromur.
Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân
tử bromelain ( Nguyễn Đức Lượng ).
 Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản.

và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế.
Chữa bệnh đau tim ( làm tan máu tụ gây đau tim ).
Điều trị các bệnh nhiễm trùng ( Jayaran và ctv, 1991 ).
Ngăn ngừa bệnh tiêu ch
ảy ở heo con ( Chandler và Mynott, 1998 ).
Chữa rối loạn tiêu hóa, giúp tiêu hóa chất đạm tốt, tăng khả năng đề kháng.
Phối hợp với kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiễm trùng.
Điều trị bong gân, căng cơ, đau và nhức cơ.
Bromelain trong dứa là hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV.
Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất
khác để bổ sung hay điều tr
ị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên ( Nielsel và ctv,
2001 ).
Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành
tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật Đó là thành quả nghiên cứu của các
nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ ( Viện Hóa học, Viện Khoa học
- công nghệ VN ) năm 2006.
Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ.
2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain
2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước
Ở
nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme
bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch
và khả năng ứng dụng của enzyme này. Một số công trình nghiên cứu về enzyme
bromelain như:
Tìm hi
ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa
SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 17
Lê Thị Thanh Mai ( 1997 ) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng
bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng

3.1.1. Nguyên liệu
Vỏ quả dứa
3.1.2. Hóa chất
Hóa chất để tủa: Cồn 96
o
, muối ammonium sulphate và aceton.
Dung dịch đệm phosphate : NaH
2
PO
4
.12H
2
O, NaH
2
PO
4
.
Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử Bradford.
Hóa chất xác định hoạt tính enzyme.
Hóa chất để cố định enzyme:
- Đệm phosphate 0.1 M pH 7
- CaCl
2
0.02 M
- Acid acetic 1%
3.1.3. Thiết bị
Máy quang phổ UV-Vis
Máy ly tâm.
Máy xay vỏ dứa.
Máy đo PH.