BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
TỐNG PHƯƠNG THỦY
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
NẤM DALDINIA CONCENTRICA Ở VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Vinh, 2015
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
TỐNG PHƯƠNG THỦY
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ
NẤM DALDINIA CONCENTRICA Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: HÓA HỌC HỮU CƠ
Mã số: 60440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ VĂN HẠC
A. Mở đầu
1. Lý do chọn đề tài
2. Mục đích nghiên cứu
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5. Phương pháp nghiên cứu
6. Những đóng góp mới
B. Nội dung
Chương 1. Tổng quan
1. Chi Daldinia
1.1.1. Lịch sử hình thành chi Daldinia
1.1.2. Đặc điểm phân bố
1.1.3. Phân loại
2.
Nấm Daldinia concentrica
1.2.1. Đặc điểm thực vật
1.2.2. Thành phần hóa học
1.2.3. Môi trường sống và phân bố của nấm Daldinia concentrica
1.2.4. Hoạt tính sinh học
3. Hợp chất Cytochalasan
1.3.1. Cấu trúc đa dạng
1.3.2. Hoạt tính sinh học
1.3.2.1. Tính gây độc tế bào và tiềm năng như tác nhân chống ung thư
1.3.2.2. Hoạt tính chống vi trùng và ký sinh trùng
1.3.2.3. Tính chất dược lý khác
HPLC: Sắc ký lỏng cao áp.
* Các phương pháp phổ :
MS: phổ khối lượng.
EI - MS: phổ khối va chạm electron.
1
H - MNR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton.
13
C- NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C.
DEPT: Distotionless Enhancement by polarisaton Transfer.
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương quan đa lượng
tử).
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan dị hạt nhân
qua nhiều liên kết).
UV: Phổ tử ngoại.
IR: Phổ hồng ngoại.
- Các danh mục khác :
s: Singlet
brs: Singlet tù
d: dublet
t: tritplet
TMS: Tetramethylsilan
DMSO : DimethylSulfoxide
BNT: Binaphthyl
DANH MỤC CÁC BẢNG – HÌNH – SƠ ĐỒ
6
Bảng 3.1. Bảng số liệu phổ của hợp chất A
Bảng 3.2. Bảng số liệu phổ của hợp chất B
Hình 3.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất B
Hình 3.23. Phổ 13C-NMR của hợp chất B
Hình 3.24. Phổ DEPT của hợp chất B
Hình 3.25. Phổ DEPT của hợp chất B
Hình 3.26. Phổ DEPT của hợp chất B
7
Hình 3.27. Phổ HSQC của hợp chất B
Hình 3.28. Phổ HSQC của hợp chất B
Hình 3.29. Phổ HSQC của hợp chất B
Hình 3.30. Phổ HSQC của hợp chất B
Hình 3.31. Phổ HMBC của hợp chất B
Hình 3.32. Phổ HMBC của hợp chất B
Hình 3.33. Phổ HMBC của hợp chất B
Hình 3.34. Phổ HMBC của hợp chất B
Hình 3.35. Phổ HMBC của hợp chất B
Hình 3.36. Phổ HMBC của hợp chất B
Sơ đồ 2.1. Phân lập hợp chất trong quả thể nấm
MỞ ĐẦU
8
1. Lý do chọn đề tài
Giới nấm (Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có thành tế bào
bằng kitin. Giới nấm có số lượng loài lớn, bao gồm 97861 loài, 8283 chi (và gần 5101
giống), 560 họ, 140 bộ, 36 lớp đã được mô tả [3] và ước tính số lượng loài có thể lên
tới 1,5 triệu [2] bên cạnh giới Thực vật (Plant), Động vật (Animal), Vi khuẩn
(Bacteria). Số lượng loài nấm lớn (Marcrofungi) có quả thể nhìn thấy bằng mắt thường
Xylariaceae (Daldinia concentrica, Xylaria polymorpha, Hypoxylon fragiforme...) có
9
khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học mạnh [80]. Các
dịch chiết thô từ một số loài thuộc họ Xylariaceae (Daldinia sp., Hypoxylon sp.,
Nodulisporium sp... .) có hoạt tính kháng khuẩn [29][30].
Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và xác định cấu trúc một số
hợp chất cytochalasan từ nấm Daldinia concentrica ở Việt Nam” từ đó góp phần
xác định thành phần hóa học của các hợp chất và tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành
hóa dược, hương liệu, mỹ phẩm.
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được thành phần loài và đánh giá đa dạng sinh học, đặc điểm sinh
học, thành phần hóa học của nấm Daldinia concentrica tại Việt Nam.
Xác định được cấu trúc, tính chất, hoạt tính sinh học hợp chất cytochalasan của
nấm Daldinia concentrica tại Việt Nam.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất
cytochalasan từ nấm Daldinia Concentrica.
Sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp
chất.
Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất thu được.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết cytochalasan trong nấm.
- Phạm vi nghiên cứu: Loài nấm Daldinia Concentrica ở Việt Nam.
5. Phương pháp nghiên cứu
5.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tươi sau khi lấy
về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 40 0C. Việc xử lý tiếp các mẫu
bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các
Sphaeria concentrica.
Daldinia được hiểu như ngày hôm nay, được xây dựng vào năm 1863 bởi
Cesati và DeNotaris, "Khi quan sát thấy rằng các khoang vùng đồng tâm trong thịt quả
nấm rõ rệt ở Daldinia concentrica hơn ở các loài khác trong Hypoxylon. Việc chấp
nhận không phải là ngay lập tức, trên thực tế đã gặp với một số phản đối. Nitzschke
trong bản ghi chép về Daldinia concentrica, viết rằng “ Sự tách biệt như hiện nay của
các loài có họ hàng gần nhau (trừ các loài Hypoxylon của Đức), quan điểm tách nhóm
Daldinia Ces. Et. De. Not. như một chi riêng biệt, tôi thấy không
hợp lý’’. Dòng suy nghĩ này cũng được sự ủng hộ của Fucke. Với sự chấp nhận bởi
Saccardo [67], “ý kiến phản đối với chi Daldinia dường như đã giảm bớt”, dẫu cho
Cooke đã viết: “Chúng tôi nên ưu tiên tiếp bước theo Nitzschke, và sáp nhập Daldinia
(Hypoxylon concentricum) và Bolinia (Hypoxylon tubulina) vào Hypoxylon”. Từ khi
Saccardo chấp nhận chi Daldinia, đã đánh dấu bước ngoặt cho Daldinia, nó chính thức
tách ra khỏi Hypoxylon để trở thành một nhóm loài riêng và đã được chấp nhận rộng
rãi. Hơn nữa, Whalley & Edwards (1995) đã báo cáo rằng Daldinia khác với
Hypoxylon bởi sự hiện diện của naphthalen có trong thịt quả nấm của chúng, trong khi
các loại hợp chất khác nhau của dihydroisocoumarin chiếm ưu thế trong thịt quả nấm
của Hypoxylon và Xylariaceae khác khi hai ông nghiên cứu đồng thời.
1.1.2. Đặc điểm phân bố
11
Trong mười ba loài được ghi nhận trong báo cáo The Genus Daldinia, nhưng có
bốn loài là phân bố tương đối giới hạn, chúng được giới hạn trong một lục địa hoặc là
phần nào đó của lục địa. Dadinia simulan đã được tìm thấy chỉ ở Ohio, Illinois và
Missouri.
Daldinia clavata là một loài quý hiếm, đã được thu thập ở Bắc và Nam Mỹ, từ
Mexico tới Argentina. Không có nghi ngờ về sự phân bố của Daldinia albozonata, đối
với các loài này chỉ được thu thập ở châu Phi, được tìm thấy trong các nước thuộc khối
12
Mặc dù trong những năm gần đây, nghiên cứu về nấm Daldinia đã có những
tín hiệu tích cực hơn nhưng con số này vẫn chưa thể hiện hết mức độ đa dạng sinh học
cũng như tiềm năng ứng dụng và nguồn lợi từ nấm ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu nấm
ở Việt Nam là nhiệm vụ quan trọng và bức thiết nhằm phát hiện, bảo tồn các nguồn
gen quý hiếm đồng thời bảo vệ sự đa dạng thành phần loài cũng như sử dụng hợp lý
nguồn tài nguyên thiên nhiên ở Việt Nam.
1.1.3. Phân loại
Daldinia thuộc nhóm nấm lớn rất phổ biến. Chi Daldinia có hơn 80
loài Daldinia được liệt kê trong Index Fungorum (CABI 2012), nhưng chi này chỉ có
25 loài có giá trị . Tên của một số loài nấm Daldinia:
stt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
D. dennisii
D. dennisii var. microspora
D. eschscholtzii
D. exsurgens
D. fissa
D. gelatinosa
D. graminis
D. granulosa
D. trung gian
D. lloydii
D. macaronesica
D. martinii
D. novae-zelandiae
D. obovata
D. palmensis
D. placentiformis
D. pyrenaica
D. simulans
D. singularis
D. stratosa
stt
35
36
37
38
39
40
41
42
D. concentrica
D. bambusicola
D. barbata
D. caldariorum
D. clavata
D. concentrica var. concentrica ·
D. concentrica var. minuta
D. cudonia
D. decipiens
D. dennisii var. dennisii
D. durissima
D. eschscholzii
D. feei
D. gelatinoides
D.gollani
D. grandis
D. loculata
D. loculatoides
D. luzonensis
D. macrospora
D. mexicana
D. novaezelandiae
D. occidentalis
D. petriniae
D. platensis
D. Raimundi
D. sacchari
D. steglichii
D. tuberosa
Wanderers) Grev.
* Tên thông thường như bánh vua Alfred’s hay bóng cacbon, cũng có khi gọi là
nấm than.
1.2.1. Đặc điểm thực vật
Daldinia concentrica cứng, hình bán cầu (thường không đều). Thịt nấm thường
có màu nâu, màu tím, màu hạt dẻ cuối cùng trở thành màu đen sáng bóng khi chín.
Thịt xơ được cấu tạo bằng nhiều lớp đồng tâm. Mỗi lớp đại diện cho một mùa sinh
sản.
14
Hình 1.1. Nấm Daldinia concentrica
Bề mặt của quả trưởng thành có xuất hiện mụn chấm. Trong giai đoạn sinh sản
vô tính nấm giải phóng bào tử màu đen. Đây là những khe hở được hình thành trên quả
thể nối với khoang chứa bào tử hình trụ nằm ngay dưới bề mặt.
Loài này phát triển mạnh nhất vào tháng 9 hàng năm. Ở Việt Nam, nấm rất
thích chọn cây điều khô làm vật chủ.
Daldinia concentrica (Bolton Fr.) Ces. & De Not. là dễ thấy vì kích thước của
nó tương đối lớn (vài cm đường kính và chiều cao) và cấu trúc bên trong của nó xoay
vòng màu sáng và màu tối. Vì vậy, nó từ lâu đã được con người biết đến. Saccardo
(1910) liệt kê 24 nguồn minh họa của Daldinia concentrica và kể từ đó, nó đã được
mô tả nhiều lần hơn.
Các quả thể của Daldinia concentrica đã được sử dụng làm mồi nhóm lửa để
lấy ánh sáng và sưởi ấm từ thời tiền sử. Có bằng chứng rằng tổ tiên loài người sống du
mục của chúng ta sử dụng nấm Daldinia concentrica theo cách trên để vận chuyển lửa
của họ khi di chuyển từ một chỗ ở cũ đến một lán trại mới để tìm thức ăn. Cheddar
Man, một hóa thạch người Anh có niên đại hơn 9.000 năm, được tìm thấy vào năm
1998 trong hang động Gough tại Cheddar Gorge, mang một cặp quả thể Daldinia
[89] và hàng loạt đồng đẳng mới 3-alkyl–5–methoxy-2-methyl-1,4-benzoquinon được
phân lập từ các cơ quan quả của Daldinia concentrica ở Trung Quốc, [90] cũng như
một cặp đồng phân lập thể mới hept–6–en-2,4,5-triol stereoisomer phân lập từ dung
dịch chiết. [90]
Thêm một loài nữa ở châu Á đã được nghiên cứu, và một hợp chất mới, (3,4,5trimethoxyphenyl) ethanol, được phát hiện cùng với một hợp chất đã được biết đến từ
trước, caruilignan C, từ các cơ quan quả Daldinia concentrica của Hàn Quốc. Cả hai
hợp chất bảo vệ thần kinh thể hiện khả năng chống lại ảnh hưởng thoái hóa thần kinh
do thiếu sắt gây ra trong tế bào thần kinh của vỏ não chuột. [91]
Trong khi đó, Daldinia concentrica thu mẫu ở Đức sản sinh ra không những
BNT, mà còn daldinon A; daldinon B; daldiniapyron (4-methoxy-5-carbomethoxy-6pentyl-2H-pyran-2-on; daldinialanon (22R-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-3-on-4);
16
3,4,5-trihydroxy-1-tetralon; (+)-orthosporin; curuilignan D; (22E)-cholesta-4,
6,8(14),22-tetraen-3-on;
3β,22-dihydroxy-lanosta-7,9(11),24-trien;
concentricol;
concentricol B-D; và phenochalasin B. Các cấu hình tuyệt đối được xác định bằng CD
quang phổ và phương pháp Mosher sửa đổi, tương ứng.
Daldinia concentrica chứa một số hợp chất độc đáo, trong đó có một sắc tố
màu tím từ một quinon perylen và một chất chuyển hóa được gọi là concentricol, được
oxy hóa squalen. Nhiều loại côn trùng và động vật nhỏ khác làm nhà của chúng bên
trong loài nấm này.
Khi nghiên cứu Daldinia concentrica ở Đức, giáo sư Hashimoto (2002) và các
cộng sự không chỉ thu được BNT, mà còn thu được 14 hợp chất khác:
O
HO
O
CH3
O
O
H3C
O
CH3
Daldiniapyron
Daldinialanon
O
OH
O
O H
OH
OH
CH3
CH3
O
(22E)-Cholesta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on
Curuilignan D
OH
OH
HO
OH
OH
OH
HO
concentricol
22-dihydroxy-lanosta-7,9(11),24-trien
OH
HO
OH
OH
OH
Concentricol D
O
O
H
H
O
N
H3CO
H
O
OH
O
O
OH
O
18
phenochalasin B
Một báo cáo của Daldinia concentrica trên tre là kết quả của một nhận dạng sai
lầm (thấy ở nơi khác trong tài liệu này). Hồ sơ lưu trữ của Daldinia concentrica và
đơn vị phân loại có khả năng bị nhầm lẫn với nó, chẳng hạn như Daldinia petriniae
Y.-M. Ju, J.D.Rogers, và San Martins ở châu Âu, cho thấy sự tương đồng rất lớn với
những người Mỹ (Cannon và cộng sự, 1985;. Petrini và Muller, 1986; Saccardo,
1897). Một số loài được biết đến chỉ từ cây một lá mầm. Chúng bao gồm Daldinia
bambusicola Y.-M. Ju, J.D.Rogers và San Martins, Daldinia graminis Dargan &
Thind, và Daldinia sacchari Dargan & Thind.
Ở đây dường như có ít nhất vài đặc trưng cây chủ trong số những loài Daldinia
xảy ra trên cây hai lá mầm thân gỗ. Daldinia concentrica xuất hiện rất phổ biến trên vỏ
bào fraxinus trong Vương quốc Anh (Cannon và cộng sự, 1985) và thường gặp trên
các loài Betula trong rừng sồi-bạch dương-phong của Bắc Mỹ và Canada (quan sát cá
nhân, JDR). Whalley và Watling (1980) báo cáo Daldinia vernicosa hết sức đặc trưng
cho cháy gỗ cây kim tước trong Vương quốc Anh. Nấm đó được coi là Daldinia
caldariorum Henn. [79]
19
1.2.4. Hoạt tính sinh học
Daldinia concentrica, cũng như đa số dù không phải tất cả các loại nấm
Xylariaceou, gây thối trắng gỗ chủ, tức là, cả xenlulozơ và lignin bị phân hủy
(Cartwright và Findlay, 1950; Rogers, 1979).
Mục gỗ do nấm Xylariaceou rất giống với những cái mà gây ra bởi nấm đảm
trắng mục nát (Sutherland và Crawford, 1981). Merrill và cộng sự (1964) thấy rằng
các khối gỗ vô trùng được phân rã chậm hơn bởi Daldinia concentrica bởi một số nấm
đảm, nhưng sự xuất hiện tương tự. Nilsson và Daniel (1989) báo cáo rằng Daldinia
concentrica gây ra mất 62,9% trọng lượng trong gỗ bạch dương (Betula) sau 2 tháng
tiếp xúc với các loại nấm. Panisset (1929), trong việc chứng minh Daldinia
concentrica là nguyên nhân của "gỗ vải in hoa" trong cây tần bì (vỏ bào fraxinus), đã
thường với liều lượng EC50 0.83 µg/ml, ức chế sự sinh sản của HIV và trì hoãn việc
phá hủy hệ thống miễn dịch của con người với liều lượng (EC50 0.83 µg/ml). Theo đó,
concentricolit có thể được sử dụng để phòng ngừa và điều trị nhiễm HIV để nâng cao
chất lượng cuộc sống và kéo dài tuổi thọ cho các bệnh nhân bị nhiễm căn bệnh thế kỉ
HIV.
1.3. Cytochalasan
Cytochalasan gồm một nhóm đa dạng của nấm polyketit - chất chuyển hóa
amino axit hybrit với một loạt các chức năng sinh học đặc biệt.
Một số hợp chất của nhóm này đều là độc tố thực vật hoặc các nhân tố độc hại
và thể hiện các hoạt động kháng khuẩn hoặc gây độc tế bào. [81]
Ngoài ra, một số cytochalasan ức chế sự tổng hợp cholesterol hay cản trở sự
vận chuyển glucozơ và giải phóng hoocmon. [41]
Trong tự nhiên, cytochalasan đóng một vai trò quan trọng trong tính độc hại
của nấm và làm hư hỏng thực phẩm, nhưng cũng có thể được tham gia vào việc duy trì
các mối quan hệ cộng sinh nấm - thực vật.
Một đặc điểm trong cytochalasan là cấu trúc nhân ba vòng của chúng, trong đó
một macrocycle được hàn lại thành một hệ thống lactam (isoindolon) được tạo thành
bằng hai vòng. [53]
Kể từ khi cytochalasan đầu tiên được mô tả vào năm 1966 (cytochalasin A và
B), một loạt các cytochalasan cấu trúc hấp dẫn đã được phân lập từ nhiều nguồn khác
nhau và đặc trưng.
Ngoài việc xác định nhiều cytochalasan mới, các hoạt tính sinh học của chúng
và đối tượng, trong thập kỷ gần đây đã có nhiều nghiên cứu về sinh tổng hợp và chức
năng sinh học của chúng, và các con đường tổng hợp mới đã được thành lập. Điều này
xem xét nhằm đưa ra một cái nhìn tổng quan về sự đa dạng về cấu trúc, các hoạt tính
sinh học, sinh tổng hợp và tổng hợp của cytochalasan.
1.3.1. Cấu trúc đa dạng
Cytochalasan được đặc trưng bởi một nhóm thế ở mức độ cao perhydroisoindolon mà thường là một vòng macrocyclic - hoặc là một carbocycle, một lacton
hoặc theo chu kỳ cacbonat - hợp nhất.
Tùy thuộc vào các amino axit kết hợp vào khung polyketit, hydro hóa
22
OH
OH
H
H
O
O
HN
O
HN
O
O
O
R1
O
OH
Cytochalasin F
O
N
H
R2
OH
H
H
HN
O O
HN
O O
O
Deoxaphomin
Cytochalasin G
H
HN
O OAc
O
HO
L-696,474
19,20-EpoxyCytochalasin Q
OH
OH
H
H
HN
O
O
OH
OH
OH
H
Cytochalasin Z14
Cytochalasin Z13
OH
O
H
HN
O
O
H
H
HN
O
HO
Cytochalasin Z10
Cytochalasin Z2
HN
O
OH
HN
O
O
H3CO
O
O
HN
O
OH
O
O
H3CO
O
OH
O
Scoparasin B
Scoparasin A
O
H
O
N
H
O
H
H
HN
O O
HN
O
N
H
O
Cytochalasin G
Penochalasin A
H
H
Hình 1.5.(a). Cấu trúc của tryptophan-nguồn gốc từ cytochalasan.
25
O
Copyright: Tài liệu đại học ©