MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt .................................................................................. vi
Danh mục các bảng ............................................................................................................ vii
Danh mục các hình vẽ và đồ thị ............................................................................................ x
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................................. 3
1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic ..................................................................... 3
1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam ............................................. 4
1.2.1.
1.2.2.

Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới. ..................................................... 4
Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam ........................................................ 7

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA....................................................................................... 8
1.4 Tính chất γ-PGA........................................................................................................ 11
1.5 Phân loại γ-PGA ....................................................................................................... 12
1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA............................................................................. 13
1.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ...................................... 15
1.7.1.
1.7.2.
1.7.3.

Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng ................................................................ 15
Ảnh hƣởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men ............................. 21
Phƣơng pháp lên men γ-PGA ........................................................................ 23

1.8 Xác định và đánh giá chất lƣợng và γ-PGA.............................................................. 24
1.8.1.
1.8.2.
1.8.3.

2.2.5.
2.2.6.
lụa

VẬT LIỆU ...................................................................................................... 40
Nguồn phân lập ............................................................................................. 40
Hóa chất ........................................................................................................ 40
Môi trƣờng nuôi cấy: ..................................................................................... 40
Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 41
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 41
Phƣơng pháp vi sinh và sinh học phân tử ..................................................... 41
Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA............ 42
Phƣơng pháp toán học - tối ƣu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực
43
Phƣơng pháp phân tích hóa lý, hóa sinh ....................................................... 46
Phƣơng pháp đánh giá cảm quan .................................................................. 49
Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hƣởng của γ-PGA đến chất lƣợng giò
49
iii


CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 51
3.1.
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.

3.6.2.
3.7.

Ảnh hƣởng của chế độ khuấy và sục khí........................................................ 77
Sự thay đổi của hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình lên men ................. 78
Tinh sạch γ-PGA ............................................................................................ 79

3.7.1. Tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm lƣợng protein và carbonhydrat.................. 79
3.7.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi tinh sạch. .............................. 80
3.7.3. Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao
áp (HPLC) .................................................................................................................... 81
3.7.4. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm tinh sạch, cấu trúc γ-PGA qua kính hiển vi
điện tử quét. .................................................................................................................. 83
3.7.5. Xác định cấu trúc và độ sạch của γ-PGA thông qua phổ FT-IR và phổ H
NMR
84
3.8.
3.8.1.
3.8.2.
3.8.3.
3.8.4.
3.9.
3.9.1.
3.9.2.
phẩm.
3.10.
3.10.1.
3.10.2.
gia khác



KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 109
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN........................................ 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 111
PHỤ LỤC.......................................................................................................................... 121

v


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

CFU/ml

Colony forming unit

CMC

Carboxyl Methyl Celullose

D,L-PGA

axit D,L- Poly γ- glutamic


Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

K – γ-PGA

Kali – γ-PGA

LDL

Lipoprotein tỷ trọng thấp

L-PGA

axit L-Poly γ- glutamic

MEGA6

Phần mêm phân tích trình tự gen, phân loài

NCBI

Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Axit Ribonucleic


Bảng 1.3. Thành phần môi trƣờng cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA ............................. 15
Bảng 2.1. Khoảng biến đổi của các yếu tố ......................................................................... 44
Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm tối ƣu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA. 45
Bảng 3.1. Sự phát triển, tạo màng nhày của các trực khuẩn gram dƣơng trên môi trƣờng
đặc hiệu ............................................................................................................................... 51
Bảng 3.2. Độ nhớt của canh trƣờng nuôi cấy của các chủng tuyển chọn .......................... 53
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn trên môi trƣờng LB ............ 55
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn
............................................................................................................................................. 56
Bảng 3.5. Kết quả sinh tổng hợp enzym ngoại bảo của các chủng vi khuẩn ...................... 58
Bảng 3.6. Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API 50 CHB............. 59
Bảng 3.7. Kết quả thực nghiệm theo ma trận quy hoạch thực nghiệm. .............................. 70
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phƣơng sai ANOVA của mô hình .......................................... 71
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) .......... 77
Bảng 3.10: Hàm lƣợng protein và carbonhydrat còn lại sau khi tinh sạch γ-PGA ............ 80
Bảng 3.11. Các tiêu chí đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm γ-PGA......................... 81
Bảng 3.12. Kết quả chạy sắc ký lọc gel (GPC) mẫu γ-PGA từ chủng B. subtilis B5.......... 88
Bảng 3.13. Tỷ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học axit glutamic. ............................ 89
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của axit đến tính chất của sản phẩm γ-PGA .................................. 90
Bảng 3.15. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA ................................................... 92
Bảng 3.16. Bảng phân tích chỉ tiêu hóa lý, hóa sinh của γ-PGA sử dụng làm phụ gia thực
phẩm .................................................................................................................................... 93
Bảng 3.17. Một số chỉ tiêu hóa học của cam sành Hà Giang............................................. 94
Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch quả đến chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam .......... 94
Bảng 3.19. Ảnh hƣởng của các phụ gia ổn định đến sự biến đổi độ nhớt của nƣớc cam... 96
Bảng 3.20. Sự biến đổi màu sắc sản phẩm sau thời gian bảo quản ................................... 97
Bảng 3.21. Chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA ...... 100
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của chế độ thanh trùng tới chất lƣợng màu sắc và mùi vị của nƣớc
cam .................................................................................................................................... 102
Bảng PL1. Bảng thành phần các môi trƣờng lên men sinh tổng hợp γ-PGA ................... 122

Hình 3.7. Cây phát sinh chủng (T1) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA .................................. 60
Hình 3.8 Ảnh hƣởng của các tiền chất đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA. .................................... 61
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ............................................ 62
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ....................................... 63
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA .................................................. 64
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến sự hình thành γ-PGA ................................................ 66
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ-PGA ..................................................... 67
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA .............................. 68
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nồng độ Natriglutamat đến sự tổng hợp γ-PGA ..................................... 69
Hình 3.16. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi thời gian và nhiệt độ thay đổi ............................................. 73
Hình 3.17. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ và tiền chất thay đổi .............................................. 74
Hình 3.18. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và nhiệt độ thay đổi ....................................................... 74
Hình 3.19. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và thời gian thay đổi ..................................................... 75
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA ..................................................... 76
Hình 3.21. Sự biến đổi của hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình lên men.................................... 78
Hình 3.22. Sắc ký đồ HPLC mẫu γ-PGA thủy phân thành glutamic. ................................................ 82
Hình 3.23. Sắc ký đồ axit L-Glutamic sử dụng trong sinh tổng hợp γ-PGA. ..................................... 82
Hình 3.24. Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA bằng kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 100.000 lần...... 83
Hình 3.25. Phổ FT-IR của γ-PGA tinh sạch thu đƣợc bởi chủng B. subtilis B5 ................................ 84
Hình 3.26. Phổ FT-IR của γ-PGA chuẩn của hãng Merck ................................................................ 85
Hình 3.27. Phổ H NMR của γ-PGA tinh sạch thu đƣợc bởi chủng B. subtilis B5 ............................. 85
Hình 3.28. Phổ HNMR mẫu γ-PGA chuẩn của hãng Merck ............................................................. 86
ix


Hình 3.29. Điện di SDS PAGE xác định khối lƣợng phân tử của γ-PGA .......................................... 87
Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu γ-PGA tạo thành bởi chủng B. subtilis B5 bằng sắc ký lọc gel ............... 88
Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biến đổi độ nhớt của dịch γ-PGA .................................. 91
Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của γ-PGA và các phụ gia thƣờng dùng khác trong việc ổn
định cho nƣớc cam............................................................................................................................. 95

glutamic. Với ƣu thế là một polymer có khả năng phân hủy, không độc với con ngƣời và tự
nhiên nên γ-PGA đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, thí
dụ: Trong công nghiệp môi trƣờng γ-PGA đƣợc sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình
lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học [5, 59, 82, 83, 88, 95, 126]. Trong
y dƣợc γ-PGA đƣợc dùng nhƣ các chất mang, chất giữ ẩm... Trong sản xuất thực phẩm γPGA đƣợc sử dụng nhƣ một dạng phụ gia ổn định chất lƣợng sản phẩm, chất chống kết
tinh, chất ổn định… Axit poly γ-glutamic đƣợc sản xuất bằng cách trùng hợp các axit
glutamic, thông qua con đƣờng tổng hợp hóa học [1, 2], hay theo con đƣờng lên men sử
dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic. Các chủng vi
sinh vật này thƣờng đƣợc tuyển chọn trong các sản phẩm lên men truyền thống nhƣ Natto
(Nhật Bản), Thua-nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc), Tƣơng (Việt Nam)…[8,
53, 100].
Ở Việt Nam những nghiên cứu về γ-PGA cho đến nay chỉ đƣợc triển khai trên quy mô
phòng thí nghiệm, ở mức độ phân lập và tuyển chọn chủng giống. Một số nghiên cứu sản
xuất γ-PGA trên quy mô công nghiệp phục vụ nông nghiệp đƣợc thực hiện bởi các công ty
của Đài Loan và Nhật Bản với chủng giống độc quyền của họ Bacillus là vi khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm nƣớc ngoài mà có
thể phân lập đƣợc từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam nhƣ Tƣơng Bần,
Tƣơng Nam Đàn, Nƣớc Mắm, Chao…[3].
Thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng
ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus trong sinh
1


tổng hợp γ-PGA và ứng dụng của chúng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm. Hơn nữa
việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hƣớng
mới, tiến bộ bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống.
Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có
nguồn gốc hóa học đang diễn biến rất phức tạp, với việc nhiều loại hóa chất công nghiệp
đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm. Các nhà quản lý và nhà nghiên cứu đang dần trở
nên thụ động đối với mỗi loại sản phẩm có chứa các phụ gia lạ. Từ góc độ nghiên cứu cho

tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 của nhóm α-COOH và γ-COOH theo thứ tự
giảm dần theo mạch. Thông thƣờng, α-NH2 liên kết với α-COOH tạo nên liên kết α-peptid
(hình 1.1), tạo ra sản phẩm là α-PGA thông qua các phản ứng hóa học bằng cách trùng hợp
nucleophile. Nhƣng khi có đƣợc một hệ xúc tác thích hợp, nhóm α-NH2 sẽ liên kết với
nhóm γ-COOH để tạo nên liên kết γ-peptid, nhƣ mô tả trong hình 1.1. Sự hình thành γPGA khác với sự hình thành của protein, vì glutamate đƣợc polymer hóa bên trong tế bào
thông qua các mối liên kết γ-amide, tổng hợp một cách độc lập với ribosome. Do vậy, các
chất ức chế của protein, chẳng hạn nhƣ chloramphenicol không có ảnh hƣởng đến việc
tổng hợp γ-PGA[4]. Nhờ quá trình polymer hóa, γ-PGA có thể đƣợc hình thành từ hơn
10.000 phân tử axit glutamic. Tùy theo môi trƣờng và phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, γPGA có thể đƣợc hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó một loại đƣợc tạo thành từ toàn
bộ D-γ-PGA, một loại đƣợc tạo thành nhờ toàn bộ L-γ-PGA và một loại đƣợc tạo thành
nhờ polymer hóa hỗn hợp DL-γ-PGA. Sự khác biệt này có đƣợc khi vi khuẩn có khả năng
chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp axit L-glutamic thành axit D-glutamic và hai dạng này
sẽ đồng trùng hợp tạo ra DL-γ-PGA gọi chung là γ-PGA [95].

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA [4]

Một vài nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã đƣợc tiến hành thông qua việc đo độ nhớt, đo
phổ hấp thụ hồng ngoại. Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong phần nhầy của Natto có
58% γ-PGA và 40% polysaccharide, pH khoảng 5 – 8,8 và phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ lệ
γ-PGA và polysaccharide khi pH môi trƣờng thay đổi [42, 85, 92, 130]. Nghiên cứu về
ảnh hƣởng của nồng độ polymer tới cấu trúc cho thấy γ-PGA có cấu trúc xoắn khi ở nồng
3


độ thấp và có dạng  khi nồng độ cao (thể hiện ở 2 dải quang phổ 1635 và 1588 cm-1) [58,
84]. Khi nồng độ polymer tăng, có sự ảnh hƣởng lẫn nhau giữa các phân tử, sự ảnh hƣởng
này lớn hơn rất nhiều so với ảnh hƣởng nội phân tử. Nhƣ vậy có thể thấy polymer ngoại
bào đƣợc sản xuất từ vi khuẩn tồn tại nhiều cấu hình khác nhau, phụ thuộc vào điều kiện
môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ polymer và nồng độ ion những nhân tố quan trọng
ảnh hƣởng tới xu hƣớng hình thành các nhóm chức năng trong polymer. Cấu trúc thay đổi

Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập đƣợc một số enzym ngoại
bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển hóa amin đặc biệt là cho
glutamine. Các đơn phân này đƣợc chuyển hóa thành đơn phân còn lại, sau đó chúng sẽ
liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptid và tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại
đơn phân. Kết quả là có hàng loạt enzym phải tham gia vào quá trình tổng hợp này [48,
112].
Các nghiên cứu sâu hơn về γ-PGA đã đƣợc tiến hành vào năm 1995, từ đó sản phẩm này
trở thành một polymer nhận đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học trong
những năm gần đây. Phƣơng pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định γ-PGA đã
đƣợc Kanno và cộng sự đƣa ra và rất hữu ích trong nghiên cứu di truyền và sinh hóa.
Phƣơng pháp này sử dụng Cetyltrimethylammonium bromide là chất tạo độ đục cho dung
dịch chứa γ-PGA rồi đo OD ở 400 nm có thế xác định đƣợc hàm lƣợng γ-PGA [7].
Năm 2006, Masaaki và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về sự hình thành màng
sinh học từ chủng B. subtilis ATCC 14593 và chỉ ra rằng γ-PGA là thành phần chính của
màng sinh học. Nghiên cứu này đã mở ra một hƣớng ứng dụng mới đầy tiềm năng cho γPGA trong tƣơng lai đặc biệt là việc lựa chọn phƣơng thức lên men nhằm tăng hiệu suất
chuyển hóa tạo γ-PGA của chủng vi khuẩn [79, 82].
Theo số liệu thống kê trong bảng 1.1 để thu γ-PGA thời gian lên men trung bình từ 3 đến 4
ngày (72-96h) và hàm lƣợng γ-PGA sinh tổng hợp đạt đƣợc từ 20-35 g/l [95, 96].

5


Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới [17, 34, 45, 46, 84, 85,
87, 93, 95, 96, 128]

Chủng

Điều kiện, thời

Năng suất


50 g/l

B. subtilis (Natto)

40oC, 96h

35 g/l

37oC, 96h

19–20 g/l

B. licheniformis NCIM 2324

37oC, 96h

46-47 g/l

B. subtilis ZJU-7

37oC, 48h

54 g/l

30oC, 72h

12-15 g/l

37oC, 115h

(2010)
Nuttawut, K và cộng
sự (2012)
Joseph, M và Kumar,
A (2012)

Trong các nghiên cứu khoa học gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào các lĩnh
vực thực phẩm, nông nghiệp và xử lý môi trƣờng, chăm sóc sức khỏe ngày càng phổ biến
và đƣợc quan tâm sâu hơn. Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ
thiên nhiên trong công nghệ thức phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự
nhiên đƣợc tổng hợp từ quá trình sinh học của vi sinh vật đang là đích đến của các nhà
nghiên cứu. Các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật tổng hợp đƣợc phân tách ra làm các
sản phẩm với các mục đích khác nhau. So với các hợp chất đƣợc tổng hợp bằng phƣơng
6


pháp hóa học, chúng có những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ an toàn cho sức khỏe con ngƣời,
thân thiện với môi trƣờng [95].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam
Ở nƣớc ta việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không cao nhƣ các nƣớc phát
triển khác. Song việc khai thác ứng dụng các quá trình sinh học trong công nghệ thực
phẩm đã đƣợc hình thành từ lâu trong đời sống xã hội. Những sản phẩm truyền thống nhƣ
nƣớc mắm, tƣơng Bần, tƣơng Nam đàn, tôm chua Huế, Chao… là những nguồn tài nguyên
vi sinh vật tiềm năng cho phát triển công nghệ sinh học hiện đại đặc biệt là các hợp chất
polymer sinh học.
Nghiên cứu về axit poly γ-glutamic ở Việt Nam còn rất hạn chế, chủ yếu là hợp tác nghiên
cứu các phần có liên quan đến γ-PGA. Sản phẩm γ-PGA chỉ thấy xuất hiện tại Việt Nam ở
các dạng mỹ phẩm gia dụng, màng sinh học... và hầu hết các sản phẩm γ-PGA này đều có
nguồn gốc nƣớc ngoài: từ Nhật bản, Hàn Quốc, Mỹ, Đức… Các công trình nghiên cứu về
γ-PGA tại Việt Nam cho đến nay mới chủ yếu đạt đƣợc ở mức tổng quan, mô tả về quy


khuẩn

có

năng

lực

sinh

tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống Boza” của Trƣờng đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đƣợc thực hiện nhằm mục đích phân lập đƣợc chủng vi khuẩn có năng lực sinh
tổng hợp γ-PGA và ứng dụng các sản phẩm này trong lĩnh vực nông nghiệp.

7


Tóm lại, từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho
thấy cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus cũng
nhƣ các sản phẩm do vi khuẩn này tạo ra.

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để làm sáng tỏ con đƣờng trao đổi chất và các enzym
có liên quan đến quá trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa của vi
khuẩn bằng việc tác động vào các enzym trong quá trình tạo γ-PGA. Đã có nhiều nghiên
cứu công bố cho thấy sự tham gia của enzym transglutaminase của B. subtilis NR-1 là yếu
tố chính xúc tác sinh tổng hợp γ-PGA, và cơ chế đồng phân hóa L-glutamic sang Dglutamic nhờ enzym alanine recemase. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phản ứng kéo dài
chuỗi γ- peptid đƣợc xúc tác bởi hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine synthetase,
pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [45, 92, 95]. Tuy nhiên, B. anthracis và B.


phân

cắt

bởi

enzym

γ-GTP

(γ-

glutamyltranspeptidase) một loại enzym hiếm có trong tự nhiên. Không một protease nào

8


có thể phân cắt đƣợc γ-PGA, tuy nhiên γ-PGA lại là đối tƣợng sử dụng trở lại của các vi
sinh vật tạo nên chúng [95].
Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng các hệ enzym đa dạng tùy thuộc vào hệ vi sinh và
môi trƣờng nuôi cấy. Sơ đồ hình thành nên γ-PGA đƣợc minh họa trong hình 1.2 nhƣ sau:

Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA [48]

Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA đƣợc nghiên cứu và đƣa ra từ năm 1982 bởi Hara và các
cộng sự vẫn là vấn đề đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học, bởi mỗi chủng vi khuẩn
có những cách chuyển hóa riêng [48]. Tuy nhiên có một số điểm chung trong các nghiên
cứu về con đƣờng tổng hợp γ-PGA là: từ các hợp chất polysaccharide sau khi chuyển hóa
thành các dạng đƣờng cơ bản là glucose hoặc saccharose đƣợc vi khuẩn chuyển hóa qua

điều tiết bởi các gen ComPA, DegSU và DegQ điều khiển mức độ phiên mã để thể hiện
các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và sự biến đổi pha.

10


1.4 Tính chất γ-PGA
Axit poly γ-glutamic có thể bị phân hủy sinh học, không độc với môi trƣờng, sinh vật và
con ngƣời. Axit poly γ-glutamic hòa tan tốt trong nƣớc và tạo đƣợc các liên kết bền vững
với nƣớc, do vậy khả năng giữ nƣớc đƣợc xem là một tính chất nổi trội của axit poly γglutamic [14, 126, 127]. Nó có thể đƣợc phân tách với các thành phần trung tính khác nhờ
sắc kí giấy [9]. Axit poly γ-glutamic khác biệt với protein cả về cấu trúc và tính chất chính
bởi liên kết γ-peptid. Thƣờng thì các liên kết α-peptid bị phân cắt bởi protease nhƣng liên
kết γ-peptid trong γ-PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởi enzym γ-GTP (γglutamyltranspeptidase) [95].
Axit poly γ-glutamic tinh khiết có độ nhớt cao ngay ở nồng độ thấp. Để xác định khả năng
tạo γ-PGA của các chủng vi khuẩn, một số nhà khoa học đã sử dụng phƣơng pháp đo độ
nhớt của canh trƣờng vi sinh vật để làm phƣơng pháp xác định γ-PGA [53, 95].
Axit poly γ-glutamic có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo nên các loại muối dạng
phức với các ion: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+ có ứng dụng rộng rãi trong ngành y tế, môi
trƣờng, mỹ phẩm [61, 125].
Đối với các dạng D-PGA và L-PGA riêng rẽ, chúng có khả năng tan trong ethanol, nhƣng
khi chúng là một hỗn hợp đẳng mol thì bị kết tủa trong ethanol [50, 95].
Kích thƣớc cũng nhƣ khối lƣợng của axit poly γ-glutamic rất đa dạng, phụ thuộc vào cấu
trúc cũng nhƣ dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh trƣờng vi sinh vật. Khối
lƣợng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kilo dalton đến hàng triệu kilo dalton. Nhìn
chung, các phân tử D,L-γ-PGA thƣờng có khối lƣợng lớn hơn nhiều so với D-γ-PGA hay
L-γ-PGA và dạng neo giữ thƣờng có kích thƣớc nhỏ hơn dạng tự do [33].
Trong huyền phù cao lanh, γ-PGA đạt độ kết dính cao nhất ở nồng độ 20mg/l và độ kết
dính tăng lên khi có các cation kim loại nhƣ Ca+2,Mg+2,Fe+2... Độ kết dính cao trong môi
trƣờng pH thấp 3-5 và giảm khi nhiệt độ trên 100oC [126].
Nếu cấu trúc hình thể γ-PGA có độ tinh sạch cao sẽ đƣợc sử dụng trong dƣợc phẩm và

ra nó cụ thể đƣợc chỉ ra trong bảng 1.2:

12


Bảng 1.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic [69]

Tỷ lệ trongγ-PGA tạo thành (%)
Chủng loại

Khối lƣợng phân
tử [kDa]

D-γ-PGA

L-γ-PGA

B. subtilis (natto)

10–1000

50–80

20–50

B. subtilis (chungkookjang)

>1000

60–70


0

100

Natrialba aegyptiaca

>1000

0

100

Hydra

3–25

0

100

Phân loại theo phƣơng thức tồn tại trong canh trƣờng vi sinh vật, có 2 dạng nhƣ sau:
Axit poly γ-glutamic dạng neo giữ: Chủ yếu có trong vi khuẩn B. anthracis đối với loài vi
khuẩn này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn
công vào bên trong tế bào. Dạng neo giữ thƣờng đƣợc tìm thấy dƣới dạng nội bào, đƣợc
tiết ra ngoài dƣới dạng các sợi liên kết giữa vi khuẩn và môi trƣờng ngoài khi gặp điều
kiện bất lợi. Do vậy việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít đƣợc nghiên cứu [50].
Axit poly γ-glutamic dạng tự do đƣợc tiết trực tiếp vào môi trƣờng nuôi cấy: Dạng này chủ
yếu đƣợc tìm thấy trong các loài lành tính của chi Bacillus mà điển hình là B. subtilis. Loài
vi khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng tự do là B. subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao

các nguồn cơ chất đa dạng, có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA và sinh trƣởng tốt. Loài vi
khuẩn điển hình nhất, an toàn đối với ngƣời, đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay trong ngành
công nghiệp thực phẩm là B. subtilis. Một số chủng B. subtilis đã đƣợc phân lập và nghiên
cứu sinh tổng hợp γ-PGA trên thế giới nhƣ B. subtilis NX-2, ZJU-7, TAM 4, IFO 3335,
RKY3, chungkookjang, natto… là nhƣng vi khuẩn điển hình đƣợc phân lập từ các sản
phẩm thực phẩm. Các chủng này khi ứng dụng để sản xuất γ-PGA trên thực tế cho sản
lƣợng ổn định từ 20g/l đến 50 g/l, an toàn với ngƣời và động vật [93, 106, 116, 121, 128].
Vi khuẩn B. licheniformis thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất, trên lông của các loài chim mặt
đất và thủy cầm. B. licheniformis là vi khuẩn Gram dƣơng và ƣa ấm, với nhiệt độ sinh
trƣởng tối ƣu của nó là khoảng 37°C, mặc dù nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn. B.
licheniformis đƣợc phân lập và ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, xử lý môi
trƣờng và xử lý các sản phẩm nông nghiệp. Các chủng B. licheniformis đƣợc nghiên cứu và
ứng dụng nhiều trên thế giới là B. licheniformis NCIM 2324, S2, ATCC 9945a, WBL-3,
CCRC 12826, với khả năng sinh tổng hợp γ-PGA đến 98 g/l [17, 33, 38, 80].
Vi khuẩn B. anthracis là vi khuẩn gây bệnh than, một căn bệnh phổ biến của gia súc và con
ngƣời là loại vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn B. anthracis sinh tổng hợp chủ yếu là D – PGA
dƣới dạng neo giữ và ít đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm bởi tính chất gây
bệnh của B. anthracis [32, 33].
14


Chuyển gen sinh tổng hợp γ-PGA: một số gen trong vi khuẩn có chức năng polymer hóa γPGA đã đƣợc tìm ra và đã đƣợc nghiên cứu chuyển gen vào một số vi khuẩn có đặc tính
sinh trƣởng cao nhƣ Erscherichia coli và Agrobacterium trên cây thuốc lá nhằm cải thiện
năng suất và giảm giá thành γ-PGA sản phẩm. Tuy nhiên những nghiên cứu này vẫn chƣa
đạt yêu cầu khai thác công nghiệp do lƣợng γ-PGA sản sinh thấp với khoảng 0,024 g/l trên
vi khuẩn E. coli và 0,6mg/g lá thuốc lá [12, 108].

1.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA
1.7.1. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng
Nguồn dinh dƣỡng là yếu tố cốt lõi để vi sinh vật sinh trƣởng và tạo thành các sản phẩm


FeCl3.6H2O

0,04

K2HPO4

0,50

CaCl2.2H2O

0,15

MnSO4.H2O

0,26.10-4 đến 0,42

Nƣớc cất đến 1000ml
Điều chỉnh pH đến 7,4 bằng NaOH
Môi trƣờng dinh dƣỡng này đƣợc gọi tắt là môi trƣờng cơ bản E. Tùy thuộc vào từng loại
vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA mà sự điều chỉnh các thành phần trong môi trƣờng dinh
15


dƣỡng bao gồm: nguồn carbon, nguồn nitơ, nguyên tố vi lƣợng Mn+2, Mg+2...[72, 95].
Những yếu tố này đƣợc thay đổi phụ thuộc vào chủng giống vi khuẩn khi tổng hợp và
những tính chất đặc điểm cần đạt của γ-PGA nhƣ khối lƣợng phân tử, năng suất, tỷ lệ đồng
phân D và L-glutamic trong γ-PGA.
1.7.1.1 Nguồn Carbon
Cùng với việc sử dụng các chất hữu cơ sẵn có trên thị trƣờng nhƣ axit citric, đƣờng

glycerol và axit glutamic đƣợc cụ thể nhƣ sau:
- Axit citric: Theo chu trình chuyển hóa γ-PGA việc sử dụng các nguồn carbon từ axit
citric là nguồn cacbon chính, bởi nó là mắt xích trung gian quan trong trong chu trình axit
tricacboxylic. Vì vậy nó xuất hiện trong trao đổi chất của gần nhƣ mọi sinh vật. Hai phần
ba nguồn năng lƣợng sử dụng cho các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật là lấy từ citric.
Chu trình chuyển hóa axit tricarboxylic cho thấy tất cả các hợp chất polysaccharide đều
phải chuyển hóa thành axit citric trƣớc khi thành axit α-ketoglutaric và glutamic. Một số
nghiên cứu đã chỉ ra có thể không sử dụng glucose làm nguồn carbon khi tổng hợp γ-PGA,
nhƣng nếu không sử dụng axit citric trong thành phần của môi trƣờng, thì việc hình thành
γ-PGA là rất ít hoặc không có [38, 95, 113]. Tuy nhiên điều này chỉ đúng với một số loại vi
khuẩn. Một số chủng sử dụng glucose cho sản lƣợng cao hơn khi sử dụng citric nhƣ B.
subtilis NX2, B. subtilis ZJU7, B. subtilis F-2-1, B. subtilis AR1 [57, 76, 123]. Khi nghiên
cứu so sánh sử dụng axit citric với một số các axit hữu cơ khác nhƣ axit succinic, L-malic,
fumaric trong nghiên cứu lên men sinh γ-PGA cho thấy sự hình thành γ-PGA là rất ít, thay
vào đó là sự hình thành nhiều hơn của các sản phẩm phụ. Các tế bào vi sinh vật không thể
sinh trƣởng đƣợc trong môi trƣờng dinh dƣỡng, nếu sử dụng nguồn carbon là axit axetic
thay cho citric [45]. Khi nghiên cứu nồng độ axit citric đến sự sinh tổng hợp γ-PGA của vi
khuẩn Bacillus sp. RKY3 cho thấy nồng độ tối ƣu cho việc tạo γ-PGA cực đại là 30 g/l. Ở
nồng độ citric cao hơn 30 g/l sẽ gây ra hiện tƣợng ức chế, giảm sự sinh trƣởng của tế bào
vi sinh vật, làm ảnh hƣởng đến sự tạo thành γ-PGA [60]. Những nghiên cứu về sự ảnh
hƣởng của axit citric và các hợp chất ammonium trong sinh tổng hợp γ-PGA trong một số
chủng vi khuẩn nhƣ Bacillus velezensis NRRL-23189 cho thấy có sự ảnh hƣởng không nhỏ
của yếu tố NH4+ trong sự hình thành γ-PGA bởi yếu tố này là tác nhân trong chu trình tổng
hợp glutamic [81]. Sự chuyển hóa của axit citric trong quá trình tổng hợp γ-PGA đƣợc
khảo sát trên đối tƣợng là vi khuẩn B. licheniformis cho thấy với nồng độ ban đầu là 12g/l,
sau 10h lên men nồng độ citric giảm mạnh và gần nhƣ bằng không sau 21h lên men. Để
tăng hàm lƣợng γ-PGA, các nghiên cứu đã tiến hành bổ sung một lƣợng từ 2-5 g/l axit
citric vào thời điểm sau 21h lên men, kết quả cho thấy lƣợng γ-PGA đƣợc cải thiện khoảng
15% [127].
- Glycerol: Glycerol tham gia trong chu trình tổng hợp này nhƣ một chất xúc tác cho quá