ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHAN HUÊ PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NANO BẠC
BẰNG SINH KHỐI VI KHUẨN B.subtilis và
B.licheniformis
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2010
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHAN HUÊ PHƯƠNG

vật lý, hóa lý kết hợp) thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu
tư rất tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi, nên có thể nói phương pháp
sinh tổng hợp là một xu hướng mang tính tất yếu. Phương pháp tổng hợp theo
hướng này tạo ra các hạt nano bạc đạt tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn
so với các phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn.
Các hạt nano cũng có thể được ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các
polymer sinh học. Nhằm tiếp cận với phương pháp mới này, tôi đã chọn đề tài
“Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis ”
làm luận văn tốt nghiệp.
Đề tài hướng đến các mục tiêu sau:
2
• Thu được vật liệu nano bạc có kích thước nhỏ, độ bền cao (trên 3
tháng) và hiệu suất kháng khuẩn cao (trên 90%) bởi vi khuẩn
B.subtilis và B.licheniformis.
• Xác định các điều kiện (lượng sinh khối, nồng độ AgNO
3
, thời gian
phản ứng) thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp nano bạc ngoại bào
(B.subtilis) và nội bào (B.licheniformis).
• Dùng dung dịch nano bạc thu được để chế tạo vải kháng khuẩn
Những mục tiêu nêu trên được cụ thể hóa qua nội dung thực hiện sau đây:
 Khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu của B.subtilis và B.licheniformis
 Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện (lượng sinh khối vi khuẩn,
thời gian phản ứng, nồng độ AgNO
3
) đến quá trình sinh tổng hợp bạc
nano.

giới
4
Công nghệ nano là một khoa học mới đang phát triển rất nhanh chóng và được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuôc sống như điện tử, hóa học, y sinh
học Trong đó nổi bật là công nghệ nano bạc vì bạc nano có hoạt tính diệt khuẩn
cao, không độc hại với con người và môi trường. Hiện có nhiều phương pháp hóa,
lý hoặc kết hợp hóa - lý được sử dụng để tổng hợp bạc nano. Nhìn chung các
phương pháp này cho hiệu suất cao, thời gian tổng hợp ngắn nhưng lại gây tác động
lớn đến môi trường, sử dụng các hóa chất thiết bị đắt tiền. Do đó, phương pháp tổng
hợp theo hướng sinh học thân thiện với môi trường được đặc biệt chú ý.
Ngoài nước:
Vào năm 2001 Klaus-Joerger nhận thấy vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
AG259 phân lập từ mỏ bạc có thể khử Ag
+
trong dung dịch muối AgNO
3
thành các
hạt Ag nano trong vùng chu chất của nó [13].
Tiếp sau đó, rất nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi sinh đơn bào (vi khuẩn)
hoặc đa bào (nấm sợi, nấm đảm) đều có khả năng khử Ag
+
tạo bạc nano theo các cơ
chế ngoại bào hoặc nội bào. Cụ thế như A.Ahmad chứng minh khả năng tổng hợp
nano bạc của nấm Fusariuim oxysporum [10]. Sastry và cộng sự nhận thấy
Verticillium sp và Fusariuim oxysporum khi tiếp xúc với ion Au
3+
và Ag

• Khoa học nano là ngành khoa học nghiên cứu về các hiện tượng và
sự can thiệp vào vật liệu theo các quy mô nguyên tử, phân tử và đại
phân tử. Với quy mô này, tính chất của vật liệu khác hẳn so với tính
chất của chúng ở các quy mô lớn hơn.
• Công nghệ nano là việc thiết kế, phân tích đặc trưng, chế tạo và ứng
dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng
và kích thước trên quy mô nano mét.
Vật liệu nano là đối tượng của hai lĩnh vực là khoa học nano và công nghệ
nano, nó liên kết hai lĩnh vực trên với nhau. Kích thước của vật liệu nano từ 0,1 nm
đến 100 nm [2].
1.2.1.Phân loại vật liệu nano
Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano, mỗi cách phân loại cho ra rất nhiều
loại nhỏ nên thường hay làm lẫn lộn các khái niệm. Sau đây là một vài cách phân
loại thường dùng.
Phân loại theo hình dáng của vật liệu
• Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám
nano, hạt nano.
• Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó một chiều tự do, hai chiều có
kích thước nano, ví dụ dây nano, ống nano.
6
• Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kích
thước nano, ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano).
• Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có
một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không
chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau. Cũng theo cách phân loại theo
hình dáng của vật liệu, một số người đặt tên số chiều bị giới hạn ở kích thước
nano. Nếu như thế thì hạt nano là vật liệu nano 3 chiều, dây nano là vật liệu

của hạt nano. Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất
nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [4].
Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng. Tuy
nhiên, ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sang màu da
cam khi kích thước của hạt thay đổi. Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do
một hiệu ứng gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt. Chỉ có các hạt nano kim loại,
trong đó các điện tử tự do mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng
có hiện tượng quang học thú vị như trên [28], [44].
1.2.3.Hạt nano bạc
Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm.
Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer
(polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các
hạt nano bạc không bị kết tụ. Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so
với bạc bình thường. Đó là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng
ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm. Tính chất kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc
đã được tìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỷ 20, nhưng sự phát minh ra
thuốc kháng sinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này. Những năm
gần đây do công nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn
với vi khuẩn, virus nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trong lĩnh vực Y sinh
học được quan tâm nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ [28]. Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây:
8
• Diệt trên 650 loại vi khuẩn
• Hiệu quả cao
• Tác dụng nhanh


Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1 nm – 100nm), diện tích bề mặt tổng cộng của
bạc nano rất lớn và hiệu quả hoạt động của bạc nano tăng đáng kể so với hạt bạc có
kích thước lớn hơn (micro) [28]. Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có
kích thước lớn hơn và với ion. Theo tính toán lý thuyết bạc nano có hoạt tính mạnh
hơn ít nhất 40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường. Vì
vậy, người ta có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương. Điều này
rất có ý nghĩa vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có
thể dùng tối đa 350 µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria
hay còn gọi là trúng độc bạc. Nếu dùng 1 – 2 muỗng càphê/ngày (20 ppm) tương
đương 100 – 200 µg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc
trong nguồn nước cung cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt. Điều này
đảm bảo cho người dùng có thể sử dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa
ăn hay trong nước uống mà không bị hiện tượng Argyria [28].
Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khoẻ con người, các nhà khoa học cho
rằng nano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con nguời có được là do
các vi khuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng
có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khoẻ. Tuy nhiên cho đến nay
chưa thấy công trình nào công bố sự tác hại của nano bạc. Các nghiên cứu tại
Odense Universitets Hospital [28] cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc được
hấp thu vào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cũng như gây
độc cho cơ thể. Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải
phóng ra khỏi cơ thể theo thời gian [28]. Các hãng sản xuất những sản phẩm chứa
nano bạc chẳng hạn như Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử
nghiệm và cho đến nay họ vẫn khẳng định tính an toàn của nó đối với sức khoẻ của
người sử dụng [5].
10


11
Dựa trên tính năng diệt khuẩn của bạc, Samsung đã đưa ra phương pháp sử
dụng ion bạc trong các thiết bị dân dụng: máy điều hòa nhiệt độ, tủ lạnh, máy hút
bụi và máy giặt để khử trùng. Với tủ lạnh tự làm sạch, các bộ phận của tủ lạnh đều
là các loại chất dẻo có hạt nano bạc, sản phẩm này đã tạo một sự kiện phi thường
trong giới khoa học, gần như không có vi khuẩn nào trong tủ lạnh nano. Ngoài ra,
nano bạc là một chất khử mùi cực kỳ hiệu quả nên các hương vị của thức ăn, thức
uống trong tủ lạnh đều được giữ nguyên vẹn. Trong máy giặt, công nghệ nano bạc
tạo thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước. Cách làm
này vừa ít hao tốn điện năng nhưng vẫn bảo đảm hiệu quả.
Hãng Mummybear (Hàn Quốc) gần đây đã giới thiệu công nghệ Nano Silver
được ứng dụng vào sản xuất bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ. Những sản
phẩm này đã được Bộ y tế, Viện dinh dưỡng, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm,
Vinacontrol cấp chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm và chất lượng [46].
Ngoài ra, hiện nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như
nước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm, ca uống nước …


E.coli. Nước qua hệ lọc PU/Ag không còn
vi khuẩn và uống được theo tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [8].

Hình 1.4.Sản phẩm thuốc trừ
bệnh MIFUM có chứa nano bạc
Hình 1.5.Thiết bị xử lý nước uống nhiễm
khuẩn với cột lọc Polyurethane xốp tẩm
nano b
ạc

13
1.3.Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc
Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và
phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc
các nguyên tử kết hợp lại với nhau. Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo
vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu.
Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim, thì phương
pháp thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là khử các ion
kim loại như Ag
+
, Au
+
để tạo thành các nguyên tử Ag và Au. Các nguyên tử sẽ liên
kết với nhau tạo ra hạt nano. Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn
nhưng thời gian gần đây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương
pháp này.

4
, sodium citrate, citric acid,
EDTA, ethanol, ethylene glycol, hydrogen, hydrogen peroxid, hydroxylamine,
hydrazine, formaldehyde và các dẫn xuất của nó [1], [12], [30]
Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người
ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích
và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt động bề mặt. Phương pháp
tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử. Phương pháp bao phủ
phức tạp nhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt
nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Các hạt nano Ag, Au, Pt, Pd, Rh
với kích thước từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này.
1.3.3.Phương pháp khử vật lý
Phương pháp này sử dụng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng
lượng cao như tia gamma, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia laser, tia UV để khử ion
Ag
+
thành nguyên tử Ag
0
[24], [34].
Dung dịch muối bạc không có thêm chất phụ gia nào khác có thể được chiếu
bằng phương pháp chiếu xạ với bức xạ năng lượng cao, quá trình này tạo ra các
electron hydrate hóa và hydro nguyên tử có khả năng khử bạc ion.
Một thí dụ sử dụng phương pháp vật lý để chế tạo hạt nano bạc là dùng các
tia laser xung có bước sống 500 nm, độ dài xung 6sn, tần số 10 hz công suất 12-14
mJ [34] chiếu vào dung dịch AgNO
3
như là nguồn kim loại và sodium dodecyl
sulfate (SDS) như chất hoạt động bề mặt để thu được hạt nano bạc. Kích thước của
hạt nano Ag tạo ra bằng phương pháp laser phụ thuộc vào chiều dài bước sóng và
cường độ của laser [9]. Phương pháp khử vật lý đơn giản hơn phương pháp khử

[13]. Vì vậy, các nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến các phương pháp sinh
tổng hợp. Phương pháp sinh tổng hợp tạo ra các hạt nano bạc có độ phân bố khá
đồng đều và có khả năng sản xuất với qui mô lớn do các hạt được ổn định ngay
trong quy trình sản xuất bởi các protein.
Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc:
Nấm: Fusarium oxysporum [10], Fusarium semitectum [11], Aspergillus
fumigatus[13], Aspergillus flavus [36], Phaenerochaete chrysosporium [37],
Penicillium fellutanum [21], Verticillium sp [32]…
16
Vi khuẩn: Pseudomonas stutzeri [13],, Lactobacillus sp [35], Bacillus licheniformis
[19], Bacillus subtilis [31], Klebsiella pneumonia [27]…
Xạ khuẩn: Rhodococcus sp, Thermomonospora [11]…
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu
tường tận nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động
của enzyme khử nitrate (nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra. Quá trình khử bắt
đầu bởi sự vận chuyển electron từ các chất cho electron đến Ag
+
để khử các ion Ag
+

tạo thành các nguyên tử Ag. Các enzyme phụ thuộc NADH như nitrate reductase
đóng vai trò chất vận chuyển điện tử. Bên cạnh các enzyme này, một số
naphthoquinone và anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể
đóng vai trò chất truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa
khử đặc trưng của chúng [10],[15].
Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào
ra khỏi dịch nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi.
Theo tài liệu [11], ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương
pháp phá màng tế bào để thu nhận sản phẩm.
1.4. Sơ lược về Bacillus licheniformis
1.4.1 Phân loại khoa học vi khuẩn B.licheniformis [16]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: B. licheniformis
18
1.4.2.Đặc điểm hình thái, sinh hóa
Hình thái: Là vi khuẩn Gram dương,
hình que, có khả năng di động và khả năng
tạo nội bào tử gần như hình cầu giúp nó tồn
tại trong thời gian dài khi gặp điều kiện sống
khắc nghiệt.
Bộ gen: có chiều dài là 4,22Mb chứa
khoảng 4200 gen mã hóa cho 4192
protein[47].
Phân bố: Vi khuẩn này hiện diện chủ yếu trong đất, gần đây nó còn được
phát hiện trong lông chim
Đặc điểm sinh hóa: B. licheniformis cho phản ứng catalase dương tính, sử
dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất.

3
-
và vận chuyển electron từ chất cho electron là NADH đến chất
nhận là Ag
+
để khử Ag
+
thành Ag
0
. 1.5. Sơ lược về Bacillus subtilis

1.5.1 Phân loại khoa học vi khuẩn B.subtilis [16]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Hình 1.8. Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn B.licheniformis
20
Bộ: Bacillales

16–18 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt, lắc nhẹ váng vỡ ra và
Hình 1.9. Vi khuẩn B.subtilis
21
chìm xuống đáy, làm đục môi trường nhẹ nhưng không đều. Trên bề mặt thạch,
khuẩn lạc không màu hay có màu trắng đến xám, bề mặt khuẩn lạc bóng và có chóp
lồi ở giữa [3].
1.5.4. Sự tạo thành bào tử
Đa số tế bào sinh dưỡng của B. subtilis đều tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy.
Bào tử có hình bầu dục, kích thước nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng bình thường vài lần
nên trong tế bào có thể có từ 1 -3 bào tử, kích thước của bào tử thường là 0,9 x
0,6µm, nội bào tử nằm gần tâm hoặc lệch tâm, không làm biến dạng tế bào mẹ. Bào
tử chịu được nhiệt độ cao và có thể tồn tại lâu trong điều kiện khắc nghiệt: ở 110
0
C
tồn tại trong 180 phút, sống lâu trong môi trường chất diệt khuẩn như phenol, H
2
O
2
,
…tồn tại đến 15 ngày trong dung dịch phenol 5%. Tính ổn định với nhiệt độ liên
quan đến sự có mặt trong bào tử nhiều ion Ca
+
, acid dipicolinic (acid piridin 2-6
dicarbonic). Acid này liên kết với protein của bào tử thành một phức chất có tính ổn
định cao với nhiệt độ. Bào tử chứa nhiều cysteine hơn so với tế bào sinh dưỡng.
Điều này có liên quan đến tính ổn định cao của bào tử đối với chiếu xạ. Enzyme và
các chất hóa học khác trong bào tử ở trạng thái bất hoạt và chỉ hoạt động khi bào tử

được sơ bộ rằng ta đã chế tạo ra dung dịch bạc nano và cũng dự đoán được kích
thước hạt nano bạc theo các công trình công bố [28]. Hình1.10. Máy
đo UV
-
V
is

Cary
-

10023


Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray
diffraction) được sử dụng để phân tích các vật
liệu có cấu trúc, nó cho phép xác định hằng số
mạng và các đỉnh đặc trưng cho các cấu trúc đó.
Đối với kim loại, phương pháp XRD cho phép
xác định chính xác sự tồn tại của kim loại trong
mẫu dựa trên các đỉnh thu được so sánh với các
đỉnh chuẩn của nguyên tố đó.

Hình 1.12. Máy XRD D8 Advance