BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
══●══

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG OXY
HÓA CỦA CAO METHANOL CÂY HÀ THỦ Ô TRẮNG
(Streptocaulon juventas Merr.)

GVHD:

SVTH:

Ts. Đái Thị Xuân Trang

Lâm Hồng Bảo Ngọc
MSSV: 3112380
Ngành: Sinh học Khóa 37

1 5 năm 2015
Cần Thơ, tháng


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
══●══

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

 Cô Võ Thị Tú Anh
Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành nhiều thời gian và công sức để truyền
đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn
thành luận văn tốt nghiệp này.
Chân thành cảm ơn các bạn lớp Cử Nhân Sinh Học K37 đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.

i


TÓM TẮT
Khả năng kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao methanol cây Hà Thủ Ô
trắng (thân và lá) được khảo sát. Bộ phận của cây Hà Thủ Ô được ly trích bằng
dung môi methanol. Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus
aureus được xác định bằng phương pháp Kirby-Bauer và khả năng kháng oxy hóa
được tiến hành bằng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1 picrylhydrazyl). Kết quả
chứng minh hiệu quả kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô rất cao ở giá trị
MIC = 16 µg/ml đối với 2 dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus
aureus. Cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô có khả năng kháng vi khuẩn
Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao hơn thuốc kháng sinh chuẩn
ampicillin (MIC = 64 µg/ml) và amoxicillin (MIC E.

coli

= 64 µg/ml và

MICS. aureus = 16 µg/ml ). Hiệu quả loại bỏ gốc tự do hydro ở DPPH của cao Hà
Thủ Ô (IC50 = 349 µg/ml) thấp hơn so với vitamin C 15,5 lần (IC 5 0 = 22,55
µg/ml).
Từ khóa: cây Hà Thủ Ô, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, DPPH, Kirby-Bauer.

2.2.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.aureus) ................................7
2.2.2.1 Đặc điểm hình thái ..................................................................7
2.2.2.2 Đặc tính nuôi cấy .....................................................................7
2.2.2.3 Khả năng gây bệnh của S. aureus ............................................7
2.2.2.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn S. aureus ............8
2.2.3 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ..............................................8
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái ..................................................................8
2.2.3.2 Đặc tính nuôi cấy .....................................................................8
2.2.3.3 Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa .....................................8
2.2.3.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa ...10
iii


2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa ..................................................................10
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..............................................12
3.1 Vật liệu .............................................................................................12
3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ..........................................................12
3.2.1 Thiết bị, dụng cụ ........................................................................12
3.1.2 Hóa chất .....................................................................................12
3.3 Phương pháp tiến hành ...................................................................13
3.3.1 Điều chế cao chiết methanol cây HTO .......................................13
3.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây
Hà Thủ Ô..............................................................................................14
3.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết
cây Hà Thủ Ô .......................................................................................14
3.3.4 Phương pháp thống kê, phân tích số liệu ..................................15
CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................16
4.1 Kết quả chiết cao methanol cây Hà Thủ Ô......................................16
4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cây Hà Thủ Ô 16
4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô ......25

Hình 6: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng E. coli của cao Hà Thủ Ô so với 2 loại
kháng sinh ampicillin và amoxicillin ...................................................................23
Hình 7: Đường chuẩn kháng oxy hóa của vitamin C (µg/ml) ...............................26

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Khả năng kháng khuẩn của cao methanol cây Hà Thủ Ô ........................16
Bảng 2: Khả năng kháng khuẩn của hai loại kháng sinh ampicillin (10 µg/ml) và
amoxicillin (25 µg/ml).........................................................................................19
Bảng 3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao Hà Thủ Ô và 2 loại
kháng sinh ...........................................................................................................24
Bảng 4: Hiệu suất kháng oxy hóa của cao Hà Thủ Ô (thân và lá) và nồng độ
vitamin C (µg/ml) tương ứng...............................................................................27
Bảng 5: Giá trị IC50 của cao methanol Hà Thủ Ô so với vitamin C ......................27

vii


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây Hà thủ ô (HTO) trắng là một loại dược liệu quý và được sử dụng như
một loại thảo dược mang lại sự trường xuân cho con người. Bên cạnh đó, HTO
trắng còn có nhiều công dụng khác: dùng để giải độc, trị cảm sốt, trị vết sưng đau,
vết thương do rắn cắn...(Đỗ Tất Lợi, 1995).
Hiện nay vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý cũng
như tính ứng dụng của cây HTO trắng. Theo tạp chí cây thuốc quý, dây và lá Hà
thủ ô trắng phối hợp với lá Bồ cu vẽ được dùng để điều trị cho bệnh nhân viêm hắc

Xuất phát từ yêu cầu trên, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng
oxy hóa của cao methanol cây Hà thủ ô (Streptocaulon juventas Merr.)” được tiến
hành. Mục tiêu của đề tài là khảo sát khả năng kháng vi khuẩn của cây HTO cũng
như khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH của cây HTO.
1.2 Nội dung thực hiện
 Dùng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch, sử dụng
phương pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế
tối thiểu của cao methanol cây HTO.
 Thử hoạt tính kháng oxy hóa của cao methanol cây HTO bằng phương
pháp xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH.

2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Giới thiệu về cây Hà thủ ô trắng

2.1.1 Đặc điểm phân loại
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliosida
Bộ: Gentianales
Họ: Asclepiadaceae
Chi: Streptocaulon
Loài: Streptocaulon juventas
Tên thông thường: hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây
mốc, cây sừng bò, cây đa lông, mã liên an (Đỗ Tất Lợi, 1995).
2.1.2 Đặc điểm hình thái

quan tâm trong những năm gần đây. Các thử nghiệm về hoạt tính kháng ung thư
cho thấy dịch chiết methanol rễ cây Hà Thủ Ô trắng có độc tính chọn lọc đối với
năm dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư tử cung Hela người, tế bào ung thư phổi
người A549, tế bào ung thư chuột colon 26-L5, tế bào ung thư phổi chuột LLC và
tế bào ung thư ruột kết chuột B16-BL6 chuột (Udea, 2003). Dịch chiết của S.
4


juventas (cả cây) có khả năng kháng khuẩn (Nguyen và Eun, 2013) và kháng oxy
hóa (Nguyen và Eun, 2011).
2.2

Giới thiệu một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm

2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli)
Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường trực ở
trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường
trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan
khác (Lê Văn Tạo, 1997).
2.2.1.1 Đặc điểm hình thái
E. coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2 – 3 µm. Trong cơ
thể có hình cầu, trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi
trường nuôi cấy, có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 – 8 µm và thường
gặp trong canh khuẩn giả. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có
lông ở xung quanh thân, nhưng cũng có một số chủng không có khả năng di động.
Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Nếu
lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc để nhuộm có thể quan sát thấy giáp mô. Dưới kính hiển
vi điện tử còn phát hiện được cấu trúc pilli – yếu tố mang kháng nguyên bám dính
của vi khuẩn E. coli (Nguyễn Như Thanh, 1997).

máu suy thận cấp trên toàn thế giới. Khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ở
người lớn nhiễm E. coli O157:H7 tiến triển tới hội chứng này, trong đó 50% số
bệnh nhân phải chạy thận và 5% tử vong (Trần Như Dương, 2011).
2.2.1.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn E. coli
Để điều trị bệnh đường ruột, nhiều loại kháng sinh được sử dụng. Kháng
sinh còn được trộn vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng
trọng. Vì vậy, khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn đường ruột nói chung và vi
khuẩn E. coli nói riêng đang ngày một tăng, làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm
chí nhiều loại kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Khả năng kháng kháng
sinh của vi khuẩn tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh
nằm trong plasmid R (resistance). Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền
ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975).
6


2.2.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S.aureus)
2.2.2.1 Đặc điểm hình thái
S. aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, Gram dương,
đường kính 0,8 – 1 µm và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp này do vi
khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian (Nguyễn Trần Hải Hoàng,
2014).
Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường hợp lại từng đôi một hay tạo thành
những đám nhỏ. Vi khuẩn này không di động, không có lông, không sinh nha bào
và thường không có vỏ (Nguyễn Trần Hải Hoàng, 2014).
2.2.2.2 Đặc tính nuôi cấy
S. aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, là vi khuẩn kỵ khí
không bắt buộc. S. aureus phát triển được ở nhiệt độ 10 - 45ºC, mọc tốt ở 37ºC
nhưng tạo sắc tố tốt ở 20ºC. Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn, mô lồi, bóng láng,
óng ánh, đường kính khoảng 1 – 2 mm, có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam
hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ (Nguyễn Trần Hải Hoàng, 2014).

Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu,
hoặc do tụ cầu cư trú ở ruột chiếm số lượng ưu thế. Nguyên nhân là sau một thời
gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn chí
bình thường của đường ruột nhạy cảm với kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện
cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng. Triệu chứng của ngộ
độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính. Sau ăn phải thức ăn nhiễm phải
độc tố tụ cầu 2 – 8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về
sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và chất điện giải nên có
thể dẫn tới sốc. Ngoài bệnh nguyên nhân do tụ cầu một số trường hợp có thêm vai
trò của Clotridium diffiticile, sau khi dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng.
2.2.2.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn S. aureus
Hầu hết các dòng S. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Một
vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những
dòng này ngày càng tăng. Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus
aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh
khác. Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở

8


Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus, và người ta nghĩ rằng việc
chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn. Ngoài
ra, S. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Kenneth Todar , 2005).
Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005
cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng
kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5%
kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006).
2.2.3 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)
2.2.3.1 Đặc điểm hình thái
P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, hình dạng thẳng hoặc hơi

đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu do nhiễm khuẩn thường có tỉ
lệ tử vong khá cao. Tác nhân thường gặp là P. aeruginosa chiếm từ 5% đến 50%
so với các tác nhân vi khuẩn khác. P. aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm
trùng hô hấp bệnh viện, đặc biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông
khí, khả năng bị viêm phổi cao gấp 20 lần và tỉ lệ tử vong cao. Một số nghiên cứu
còn cho thấy P. aeruginosa giữ vai trò gây bệnh trong giai đoạn đầu và cuối của
bệnh đái tháo đường (Deanna, 2003).
2.2.3.4 Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa
P. aeruginosa còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại
kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố
di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp
và tải nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới. P. aeruginosa hiện kháng
với rất nhiều loại kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là việc
cần thiết (Trần Linh Phước, 2006).
2.3 Hoạt tính kháng oxy hóa
Hiện nay, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa thứ
cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa
có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí
đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng
oxy để đạt năng lượng. Trong quá trình hô hấp các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đã
tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O2), hydroxyl
(OH), chất oxy hóa như H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này
10


cũng như các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử
sinh học như DNA, lipid, protein,...(Bùi Trọng Đạt, 2003).
Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm
điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này như superoxide dismutase,
catalase, glutathinone peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn


3.2.1 Thiết bị, dụng cụ
 Dùng cho thí nghiệm vi sinh
Tủ ủ (BE 200, Memmert, Đức)
Nồi hấp khử trùng autoclave (HVE – 50, Hirayama, Nhật)
Tủ cấy (Class II BSC, Esco, Indonesia)
 Dùng cho thí nghiệm sinh hóa
Cân phân tích (AB104 – S, Mettler Toledo, Thụy Sỹ)
Máy ly tâm (Mikro 12 – 24, Hettich, Đức)
Máy vortex (ZX3, Velp, Ý)
Máy đo quang phổ
3.2.2 Hóa chất
 Dùng cho thí nghiệm vi sinh
Môi trường LB
Thuốc kháng sinh chuẩn ampicillin (10 µg/ml) và amoxicillin (25 µg/ml).
12


 Dùng cho thí nghiệm sinh hóa
Methanol (Trung Quốc, Merck)
Vitamin C
DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
3.3

Phương pháp tiến hành

3.3.1 Điều chế cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô
Sau khi thu hái và phơi khô cây HTO, cây được cắt nhỏ và nghiền thành
bột. Hỗn hợp bột thô cây HTO được ngâm trong dung môi methanol trong 48 giờ.
Sau đó hỗn hợp được đem cô quay loại bỏ dung môi dưới áp suất thấp. Quy trình

lượng không đổi.
3.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây Hà Thủ Ô
Chuẩn bị cao chiết: cao chiết được pha với dung môi methanol thành các
nồng độ 8 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml và 128 µg/ml.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: dịch nuôi vi khuẩn đã pha loãng trong
nước muối sinh lý tương đương độ đục ≥ 0,5 Mc Farland mật số vi khuẩn là 108
được trãi đều trên môi trường LB đặc. Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt
khoanh giấy có tẩm cao chiết.
Cao chiết HTO (100 µl) được cho trực tiếp lên khoanh giấy (đường
kính 6 mm) vô trùng ở các nồng độ khác nhau. Các kháng sinh ampicillin và
amoxicillin được sử dụng như đối chứng dương và được pha thành các nồng độ
tương tự như cao chiết. Ngoài ra, do sử dụng methanol để pha cao chiết nên ảnh
hưởng của methanol lên sự phát triển của vi khuẩn cũng được khảo sát. Mỗi đĩa
thạch được đặt từ 1, 2 hay 3 khoanh giấy tẩm cao chiết, sau đó để khô. Mỗi nồng
độ được lặp lại 3 lần. Các đĩa thạch được ủ ở 32ºC trong 24 - 48 giờ. Đường kính
vùng ức chế (bao gồm đường kính khoanh giấy) được đo bằng thước đo đơn vị
mm. Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ cao chiết thấp nhất mà tại đó xuất hiện
vòng vô khuẩn, đo ngang các khuẩn lạc li ti nếu có.
3.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết cây Hà Thủ Ô
Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết methanol cây Hà Thủ Ô trắng được
thực hiện theo phương pháp DPPH (2,2 – Diphenyl – 1 –picrylhydrazyl) như sau:
cao methanol Hà Thủ Ô được pha thành các nồng độ 100, 200, 300, 400, 500
µg/ml trong methanol. Lượng cao chiết được pha vào phản ứng là 100 µl và DPPH
6.10-4 M là 100 µl (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 60
14


phút và trong tối, sau đó được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 517nm. Khả
năng kháng oxy hóa được tính dựa vào giá trị IC50. Giá trị IC50 được tính dựa trên
phương trình tuyến tính của cao chiết.

Nồng độ cao
(µg/ml)

E. coli

S. aureus

P. aeruginosa

0

-

-

-

8

10,3dA ± 0,6

11,7cA ± 1,5

-

16

25,3cA ± 0,6

22,7bB ± 0,6


Cao methanol Hà Thủ Ô (thân và lá) cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất
đối với E. coli sau đó đến S. aureus. Ở nồng độ 16 µg/ml, cao HTO có hoạt tính ức

16