ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU TẠO DẪN XUẤT CỦA
CHITOOLIGOSACCHARIDES, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG
OXI HÓA VÀ ỨC CHẾ MATRIX METALLOPROTEINASE

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên) PGS.TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP


Đợt 2: 114.000.000 đồng theo TB số 27/TBKHCN ngày 13/04/2012.
2. Mục tiêu
Cải biến chitooligosaccharide (COS) bằng cách ghép các phân nhánh chức
năng nhằm nâng cao hoạt tính sinh học vốn có của COS như kháng oxi hóa và ức
chế matrix metalloproteinase (MMP-2 và 9), enzyme đóng vai trò trong quá trình
gây di căn của ung thư. Tạo ra sản phẩm sinh học mới là dẫn xuất COS ít độc hoặc
không độc, an toàn.

2

3. Nội dung nghiên cứu và tiến độ theo hợp đồng
TT
Nội dung, công việc
chủ yếu
Sản phẩm cần đạt
Mức độ
1
2
3
4
1
Nghiên cứu thu nhận
chitooligosaccharide
(COS) với trọng lượng
phân tử khác nhau (1-3
kDa và 3-5 kDa) từ
chitosan

DPPH
Kết quả năng lực khử, kháng
oxi hóa
Đạt kết quả
4
Báo cáo sơ kết giai
đoạn 1
Báo cáo kết quả theo quy định
Đạt, thông qua
5
Thử nghiệm hoạ
củĐạt kết quả
6
metalloproteinase
(MMP-2,-9,
collagenase)
collaganase
4 dẫn xuất ức chế
collaganase và 2
ức chế MMP
7
ệm
Đạt
4

thu cơ sở.
thu cơ sở.

nhiều dạng khác nhau, trong đó chitin có 3 dạng chính: α-chitin, β-chitin và γ-chitin;
α-chitin là dạng phổ biến nhất [6][15].
Chitosan, polyglucosamine, được tạo ra bởi phản ứng deacetyl hoá nhóm N–
acetyl của chitin. Khi đó gốc acetyl (-COCH
3
) sẽ tách khỏi gốc amino (-NH
2
) trong
nhóm acetamide (-NHCOCH
3
), hay chúng có số nhóm amin tự do tăng lên rất nhiều
so với chitin. Chúng là các sản phẩm tự nhiên, không độc, an toàn với môi trường
và được sử dụng rộng rãi trong y học và nông lâm ngư nghiệp. Chitin, chitosan
cùng với các dẫn xuất của chúng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng
6

nấm, kháng oxi hóa [16], kích thích và tăng cường hoạt động của hệ thống miễn
dịch, ức chế khối u, ung thư, ức chế enzyme như angiotensin I converting enzyme
đóng vai trò trong việc điều hòa huyết áp và gây bệnh cao huyết áp hay
myeloperoxidase tạo các chất oxi hóa gây hư hại tế bào… Ngoài ra, chúng làm
giảm cholesterol và lipid trong máu nhất là các cholesterol có hại [17][30].
Mặt dù chitin và chitosan được biết là có tính chất và chức năng quan trọng
trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, do độ hoà tan kém trong điều kiện sinh lý làm cho
sự biến đổi hoá học của nó khó khăn và hạn chế ứng dụng cho đến nay.
Chitooligosaccharide (COS) hay chitosan oligomer là các polymer mạch
thẳng của 2–amino–2–deoxy–D–glucose (GlcN) và 2–acetamido–2–deoxy–D–
glucose (GlcNAc) liên kết β-(14) với mức độ trùng hợp (DP, degrees of
polymerization) từ 1 – 20 [16]. Các COS có DP từ 2 – 4 là hoà tan hoàn toàn trong
methanol nhưng những oligomer với DP lớn hơn 5 thì ít hoà tan hơn. Trong trường
hợp với các chitosan trọng lượng phân tử thấp (Lower Molecular Weight Chitosan,

thuộc trọng lượng phân tử. Năm 2004, Je, Park và Kim báo cáo rằng COS với độ
deacetyl hóa cao (90%) thích hợp hơn trong việc bắt DPPH, hydroxyl, superoxide
và các gốc tự do có carbon trung tâm. Các nghiên cứu của Huang, Mendis và Kim
(2005) cho thấy khả năng thu hút ion kim loại của COS có ảnh hưởng rất lớn đến sự
8

bắt gốc hydroxyl của COS [20]. Các nghiên cứu của Kim và Thomas (2007) [13],
Chen và cộng sự (2003) [8], Ngo, Kim và Kim (2008) [22] cũng cho thấy khả năng
chống oxi hóa của COS.
Nghiên cứu của Je và Kim (2006) [21], Ngo và các đồng sự (2012) [23][18]
đã tổng hợp các dẫn xuất của chitosan, COS cho thấy hoạt tính chống oxy hóa, bảo
vệ tế bào được nâng cao.
Chitosan các dẫn xuất của chúng còn có hoạt tính ức chế ung thư di căn, một
vài công trình nghiênc cứu như: Qin và các đồng nghiệp (2004) [27][28], Hongbin
và cộng sự (2004) [12], Rajapakse và Mendis (2007) [29], Kim và Kim (2006) [14],
Ngo, Kim và Kim (2006) [24].
Chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng còn có khả năng kích thích tăng
trưởng động vật như: Vitastim là hỗn hợp gồm 10 loại oligosaccharide khác nhau do
các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu có thể kích thích khả năng kháng bệnh, ngăn
ngừa bệnh cho các loại thủy sản: tôm, cua, sò, cá…Nhiều nghiên cứu cho thấy
chitooligosaccharide có khả năng kích hoạt tính lysozyme ngoại bào cũng như kích
thích sự phát triển của tế bào cơ trơn giúp cho mạch máu lưu thông dễ dàng [9].
Hơn nữa oligoglucosamine còn có thể kích thích hoạt tính chitosanase ở thực
vật. Hiroshi Inui và cộng sự (2008) dùng môi trường có chứa oligoglucosamine
nuôi mô sẹo lúa nhận thấy hoạt tính chitosanase tăng nhanh và đạt đỉnh sau 2 ngày.
Mặc khác, khi xử lí mô sẹo lúa với oligosaccharide Shinyu và cộng sự (2002) cũng
cho kết quả tương tự.
9

Ngoài ra, chitooligosaccharide còn được ứng dụng trong thực phẩm chức

chitosan ban đầu [6][32].
1.4 Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, ở Việt Nam và trên thế giới, khuynh hướng sử dụng các chất có
nguồn gốc sinh học được thu nhận từ các nguyên liệu tự nhiên để tạo thành các chế
phẩm sinh học không gây độc hoặc ít độc, ứng dụng cho các lĩnh vực khác nhau
như y dược, chăn nuôi, nông nghiệp, chế biến thực phẩm…, nhằm tạo ra các sản
phẩm sạch, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe cộng đồng đang
được chú trọng. Một trong những hoạt chất sinh học có ưu điểm trên là các chế
phẩm chitin, chitosan, COS và các dẫn xuất của chúng. Trên thế giới, việc nghiên
cứu, ứng dụng chitosan, COS trong chăn nuôi và thực phẩm như là một thực phẩm
chức năng đã được ứng dụng trong sản xuất trong những năm gần đây.
Riêng đối với Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các hoạt tính của
chitosan, COS, dẫn xuất từ COS mà đặc biệt là hoạt tính chống oxi hóa và ức chế
11

MMP-2, -9 –enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình di căn của ung thư-
còn chưa được nghiên cứu nhiều.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, việc nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa và
ức chế ung thư di căn của các dẫn xuất từ COS bằng cách cải biến COS nhằm nâng
cao hoạt tính sinh học vốn có của COS và hướng tới ứng dụng trong thực phẩm
chức năng và y dược là hết sức cấp thiết.
1.5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn
Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa và ức chế MMP-2, -9 (đây là enzyme
đóng vai trò quan trọng trong quá trình di căn của ung thư), của các dẫn xuất mới
của COS là rất mới mẻ, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao không chỉ đối với Việt
Nam mà cả đối với thế giới trong việc nâng cao giá trị của các sản phẩm có nguồn
gốc từ tự nhiên. Hơn nữa, từ những thử nghiệm hiệu quả kháng oxi hóa và ức chế
MMP-2 và MMP-9 trên dòng tế bào nuôi cấy (HT1080) của các dẫn xuất của COS
hướng đến tạo ra chế phẩm thực phẩm chức năng bổ sung và ngăn ngừa các bệnh
nan y là một trong những khuynh hướng hiện nay, gắn kết nghiên cứu khoa học cơ

Phương trình phản ứng như sau:

Tạo dẫn xuất N,O-aminoethyl chitooligosaccharide: các hợp chất alkyl
halogen có thể được dùng để cải biến một cách khá chuyên biệt các nhóm hydroxyl
trong carbohydrate, các polymer và các phân tử khác mà cụ thể ở đây là các gốc
đường glucosamine. Sự cải biến các nhóm hydroxyl có thể được thực hiện trong
điều kiện: 3 – 10 M NaOH, từ 35
o
C đến 50
o
C trong khoảng từ 1,5 đến 4 giờ [10].
Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm chitooligosaccharide cải biến:
xác định mức độ phân nhánh bằng phương pháp ninhydrin, cấu trúc bằng phổ IR và
NMR, độ tinh sạch bằng sắc kí bản mỏng.
2.3 Nội dung 3: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa của COS và dẫn xuất
Sử dụng phương pháp năng lực khử của Yen và Chen (1995) và kháng gốc tự
do DPPH bằng phương pháp của Shimada và cộng sự (1992).
2.4 Nội dung 4: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa lipid, protein màng, bảo
vệ DNA của COS và dẫn xuất
Xác định mức độ gây độc đối với tế bào nuôi cấy HT1080 theo phương pháp
MTT được mô tả bởi Hansen, Neilsen và Berg (1989) [11].
Hoạt tính kháng oxi hóa lipid theo phương pháp TBA (2-thiobarbituric acid)
được Niranjan Rajapakse và Se-Kwon Kim (2006) cải biến [29].
NaBH
4
14

Hoạt tính kháng oxi hóa protein màng theo phương pháp của Kim và cộng sự
(2010) [19].
Hoạt tính bảo vệ DNA được thực hiện trên cơ sở của Milne và cộng sự

1- 2,5% tùy từng hợp chất, khuấy ở nhiệt độ 32
o
C để phản ứng hình thành tối đa
dạng base Schiff. Sau đó thêm 0.1g NaBH
4
làm tác nhân khử khuấy thêm cho đủ 24
giờ. Sau đó pH của dung dịch phản ứng được điều chỉnh lên pH 7 bằng dung dịch
NaOH 15%. Ly tâm thu lấy dẫn xuất và rửa sạch nhiều lần bằng nước cất rồi rửa
16

dẫn xuất nhiều lần với ether để loại bỏ các aldehyde không phản ứng. Sau cùng dẫn
xuất COS được đem sấy ở 40
o
C thu được dạng bột.
3.2.1.1 Dẫn xuất N-benzyl chitooligosaccharide (BCOS)
Kết quả nghiên cứu điều kiện cho quá trình tổng hợp dẫn xuất BCOS như
sau:
- pH = 5,0, hiệu suất tổng hợp đạt 3,65% và độ thay thế đạt 72,77%.
- Nhiệt độ: 32
o
C, hiệu suất tổng hợp là 4,5%, độ thay thế 56,84%.
- Tỉ lệ 1g COS và 2ml benzaldehyde, hiệu suất tổng hợp cao đạt 5,5% và
độ thay thế cao nhất đạt 72,65%.
- Thời gian tổng hợp liên tục trong 24 giờ.
Dẫn xuất BCOS sau khi được tổng hợp ở điều kiện xác định trên được tiến
hành đánh giá độ tinh sạch bằng sắc ký TLC, kết quả cho thấy không xuất hiện vết
benzaldehyde ở BCOS. Kết quả phổ IR và
1
H-NMR cho thấy chúng tôi đã tổng hợp
thành công dẫn xuất BCOS.

3.2.1.4 Dẫn xuất N-cinnamyl chitooligosaccharide (CCOS)
Kết quả nghiên cứu cho điều kiện tổng hợp dẫn xuất CCOS như sau:
- pH = 4,5 hiệu suất tổng hợp 22,39% và độ thay thế 42,87%.
- Tỉ lệ 1:1, độ thay thế đạt 70,04% hiệu suất là 61,95%.
- Thời gian tổng hợp 24 giờ, nhiệt độ 32
o
C.
18

Để kiểm tra độ tinh sạch cũng như cấu trúc dẫn xuất CCOS, chúng tôi tiến
hành chạy sắc ký TLC và phổ IR,
1
H-NMR, kết quả cho thấy đã tổng hợp thành
công dẫn xuất CCOS, sản phẩm không còn lẫn N-cinnamaldehyde.
3.2.1.5 Dẫn xuất N-(4-hydroxybenzyl) chitooligosaccharide (HBCOS)
Kết quả khảo sát điều kiện tổng hợp dẫn xuất HBCOS như sau:
- pH = 5,0, hiệu suất đạt 43,53% và độ thay thế đạt 90,99%.
- Tỉ lệ COS : 4-hydroxybenzaldehyde là 1:2,5 với hiệu suất 50,57% và độ
thay thế 83,96%.
- Tổng hợp ở nhiệt độ phòng và thời gian là 24 giờ.
Sắc ký TLC, phổ IR,
1
H-NMR cho kết quả chúng tôi đã tổng hợp thành công
dẫn xuất CCOS, không còn lẫn chất gắn.
3.2.2 Nghiên cứu tạo dẫn xuất N,O-aminoethyl chitooligosaccharide (AECOS)
Tương tự như tổng hợp dẫn xuất N-aryl COS, chúng tôi tiến hành khảo sát
điều kiện về hàm lượng NaOH, nhiệt độ cho quá trình tổng hợp dẫn xuất AECOS,
kết quả như sau: 0,2g COS và NaOH 3M cho hiệu suất đạt cao nhất 78%; tổng hợp
đạt hiệu suất cao nhất 85% ở nhiệt độ 50
o

Trong khoảng giới hạn nồng độ khảo sát, hiệu suất bắt gốc tự do DPPH ở
nồng độ 200 g/ml và 1000 g/ml của BCOS lần lượt là 7,48% và 33,36%; của
CCOS là 4,01% và 16,54%; của DMABCOS là 39,14% và 85,27%; của MBCOS là
20,20% và 76,73%. AECOS và HBCOS lần lượt có hiệu suất bắt gốc DPPH đạt
83,08% và 77,19% ở nồng độ 100 g/ml; 90,93% và 79,73% ở nồng độ 500 g/ml.
Giá trị IC50 của CCOS và BCOS không xác định được trong khoảng giới
hạn của nồng độ khảo sát. Kết quả cho thấy, ngoài CCOS và BCOS, giá trị IC50
của COS là lớn nhất 655,90. IC50 của các dẫn xuất còn lại đều nhỏ hơn, IC50 của
AECOS nhỏ hơn 10,8 lần, của DMABCOS là 1,9 lần, của HBCOS là 89,8 lần và
của MBCOS là 1,2 lần.
3.4 Nội dung 4: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa lipid, protein màng, bảo
vệ DNA của COS và dẫn xuất
3.4.1 Khảo sát khả năng gây độc của COS 1000 – 3000 Da và dẫn xuất đối với
dòng tế bào HT1080
3.4.1.1 Tế bào được nuôi trong điều kiện có huyết thanh
Kết quả thí nghiệm MTT cho thấy, trong điều kiện có huyết thanh, COS và
đa số các dẫn xuất đều không gây độc cho tế bào ở tất cả các nồng độ khảo sát. Ở
những nồng độ cao như 500 ppm hay 1000 ppm, mật độ tế bào có giảm nhưng
không nhiều. Riêng dẫn xuất AECOS, gây độc cho tế bào ở nồng độ từ 250 ppm trở
lên (mật độ tế bào còn lại dưới 50%).
21

3.4.1.2 Tế bào được nuôi trong điều kiện không có huyết thanh
Tương tự như trong trường hợp có huyết thanh, trong trường hợp không có
huyết thanh cũng chỉ có AECOS là gây độc cho tế bào ở nồng độ từ 250 ppm trở
lên. COS và các dẫn xuất còn lại đều không gây độc cho tế bào ở các nồng độ khảo
sát.
Từ kết quả MTT của cả hai điều kiện nuôi cấy có huyết thanh và không có
huyết thanh, chúng tôi có thể kết luận độ gây độc của COS và dẫn xuất đối với dòng
tế bào HT1080 đều ở mức thấp. Do vậy, có thể sử dụng các chất thử nghiệm với các

2
O
2
và Fe
2+
thích hợp để phá hủy toàn bộ DNA bộ gene. Kết quả điện di DNA
được xử lý với H
2
O
2
0,2mM và Fe
2+
10mM trên gel agerose 1% cho thấy toàn bộ
DNA bộ gene đều bị phân mảnh, băng điện di kéo vệch và biến mất khi so sánh với
mẫu DNA đối chứng.
3.4.4.2 Đánh giá khả năng bảo vệ DNA của các dẫn xuất
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
- AECOS 1 – 3kDa có khả năng bảo vệ DNA tốt nhất ở nồng độ 50 ppm,
mức độ nguyên vẹn của DNA được bảo vệ bởi dẫn xuất đạt 56,23%.
- Ở nồng độ 5 ppm, DMABCOS 1 – 3kDa có khả năng giữ nguyên vẹn
DNA bộ gen đến 75,06%.
- Nồng độ HBCOS 1 – 3kDa có khả năng bảo vệ DNA tốt nhất là 10 ppm,
giữ nguyên vẹn DNA bộ gen.
23

- Dẫn xuất MBCOS 1 – 3kDa có khả năng bảo vệ DNA bộ gen nguyên
vẹn, từ nồng độ 5 ppm đến 50 ppm, mức độ nguyên vẹn của DNA có thể
đạt được 100%.
3.5 Nội dung 5: Thử nghiệm hoạt tính ức chế matrix metalloproteinase
(MMP) của COS và một số dẫn xuất

Như vậy, vì dẫn xuất CCOS 3000 – 5000 Da không làm giảm đáng kể mật
độ tế bào HT1080 ở tất cả các nồng độ khảo sát, chúng tôi có thể kết luận dẫn xuất
này không gây độc cho tế bào HT1080.
3.5.3.2 Khả năng ức chế MMP-2 và MMP-9 của CCOS 3000 – 5000 Da xác định
bằng phương pháp Zymography
MMPs đóng vai trò quan trọng trong sự thoái biến sinh lý ECM, sữa chữa
mô, hình thành mạch và trong các điều kiện bệnh lý phân giải vượt mức ECM như
viêm mãn tính, viêm khớp, ung bướu và di căn. Hình 3.1 cho thấy CCOS 3000-
5000Da ức chế MPP-2 và MPP-9 cao hơn COS 3000- 5000Da.