BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ VÀ
ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP HẮC TỐ
Ở LOÀI Ô DƯỢC (Lindera myrrha)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG
ThS. LÊ QUỲNH LOAN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100730

: VÕ THỊ THUẬN
Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của
riêng người thực hiện đề tài dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoàng

đề tài tốt nghiệp.
Em xin chân thàh cám ơn cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM
đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài.
Cám ơn tập thể lớp 13DSH02 đã cùng em trao đổi, cùng nhau học tập trong
suốt bốn năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, cám ơn tập thể phòng Vi
sinh – Viện Sinh học Nhiệt đới đã động viên và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, con gửi lời cám ơn sâu sắc đến Ba Mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con,
cám ơn anh chị trong gia đình luôn bên cạnh động viên em trong suốt quá trình học
tập và trưởng thành.

ii


Đồ án tốt nghiệp

Vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề
tài này em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến
đóng góp từ phía quý Thầy Cô.
Tp. Hồ Chí Minh, Ngày 18 tháng 7 năm
2017
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Thuận

iii


Đồ án tốt nghiệp


nghiên

cứu……………………………………………………...3
4.

Nhiệm

vụ

nghiên

cứu……………………………………………………...3
5.

Phương

pháp

nghiên

quả

đạt

cứu………………………………………………….4
6.

Kết


án

tốt

nghiệp……………………………………………….....5
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................6
1.1.

Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae)............................6

iv


Đồ án tốt nghiệp

1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae) ...........................................................6
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học .................................................8
1.2.

Tổng quan về cây ô dƣợc ..................................................................9

1.2.1. Phân loại khoa học ..........................................................................9
1.2.2. Đặc điểm thực vật .........................................................................10
1.2.3. Thành phần hoá học ......................................................................12
1.2.4. Công dụng theo y học dân gian .....................................................12
1.3.

Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da ..................................12

1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người .................................12

Vật liệu nghiên cứu .........................................................................39

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................39
2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị .........................................................................39
2.2.3. Hoá chất ........................................................................................39

v


Đồ án tốt nghiệp

2.3.

Quy trình thực hiện .........................................................................40

2.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................41

2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu .....................................................41
2.4.2. Quy trình chiết và thu nhận cao chiết ...........................................41
2.4.3. Phương pháp xác định thành phần hoá học ..................................43
2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) .........47
2.4.5. Phương pháp nuôi cấy tế bào (B16F10) .......................................49
2.4.6. Phương pháp xác định độc tính .....................................................49
2.4.7. Phương pháp xác định hàm lượng melanin ..................................49
2.4.8. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ............................50
2.4.9. Xử lý số liệu ..................................................................................51
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................52
3.1.


Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết phân đoạn ...............61

3.9.

Khảo sát tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế

melanin của tế bào u sắc tố B16F10 ................................................................63
3.10. Kết quả xác định thành phần hoá học bằng phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................................................64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................67
4.1.

Kết luận ............................................................................................67

4.2.

Đề nghị..............................................................................................68
vi


Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DHICA 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid
DHI

5,6-dihydroxyindole

TRP-2

DOPA chrome tautomerase

vii


Đồ án tốt nghiệp

UV

Ultraviolet (Tia cực tím).

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Dung môi khác nhau dung trong chiết xuất các nhóm hoạt chất trong
dược liệu. ...................................................................................................................28
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao tổng methanol ô dược
...................................................................................................................................53
Bảng 3.2. Kết quả xác định thành phần hoá học các mẫu cao phân đoạn ô dược ...59

viii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera ....................................................8
Hình 1.2. Một số hợp chất Sesquiterpenoids được xác định trong chi Lindera ........8
Hình 1.3. Một số hợp chất alkaloids được xác định trong chi Lindera .....................9
Hình 1.4. Cây ô dược...............................................................................................11

...................................................................................................................................53
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện khả năng kháng oxy hóa của ..........................................55
Hình 3.4. Tác dụng của cao methanol ô dược lên độc tính tế bào. .........................56
Hình 3.6. Tác dụng của cao methanol ô dược lên quá trình tổng hợp melanin. .....57
Hình 3.5. Tế bào B16F10 melanoma thu nhận sau khi xử lý với cao methanol ô
dược ...........................................................................................................................57
Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện hiệu suất thu hồi (%) của các cao phân đoạn ô dược ...59
Hình 3.8. Đồ thị thể hiện khả năng chống oxi hóa của các cao dịch chiết. .............61
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện giá trị IC50 của các phân đoạn cao ô dược ....................62
Hình 3.10. Tác dụng của phân đoạn cao lên độc tính và ức chế melanin của tế bào
u sắc tố B16F10 .........................................................................................................63
Hình 3.12. Phổ HPLC dịch cao chiết phân đoạn ethyl acetate ô dược....................65
Hình 3.11. Phổ HPLC dịch cao chiết methanol ô dược ..........................................65

x


Đồ án tốt nghiệp

xi


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng
trong việc tạo nên sắc tố da ở người. Các hắc tố (melanin) trong da được sản xuất
bởi tế bào hắc tố nằm trong lớp nền của biểu mô. Trong tế bào hắc tố, melanin được
tổng hợp trong một bào quan đặc biệt gọi là melanosome. Melanosome chứa nhiều

gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng
làm thuốc. Trước kia, các cây thuốc dân gian đóng vai trò quan trọng trong việc
chữa bệnh cho con người. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
được phân lập từ thực vật đã được nghiên cứu và ứng dụng trực tiếp làm các chất
dẫn đường cho một loạt các hợp chất ứng dụng mới trong các ngành công nghiệp
như chữa bệnh, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm v.v… Do đó, việc tiếp tục nghiên
cứu tính chất và tác dụng của các hợp chất thiên nhiên vẫn đang là nhiệm vụ của rất
nhiều nha khoa học.
Trong thế giới thực vật muôn màu, đa dạng, cây ô dược (Lindera myrrha
Merr) là một loài thuộc chi Lindera, họ Long não (Lauraceae) được sử dụng để trị
bệnh một số bệnh trong y học cổ truyền như: đau bụng, nôn mửa, trị tiểu nhiều lần
hoặc đái dầm, trị chứng rối loạn tiêu hóa ăn không tiêu, và một số bệnh khác. Các
nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các lớp chất
alkaloid, tinh dầu…Nhiều hoạt chất trong số đó đã thể hiện nhiều hoạt tính sinh học
tốt như: Borneol, Linderane, Linderalactone. Tuy nhiên, khả năng kháng oxy hoá và
ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của ô dược chưa được nghiên cứu chuyên sâu. Do
vậy, đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình tổng hợp hắc
tố từ loài ô dƣợc (Lindera myrrha Merr)” được thực hiện để tiến hành kiểm tra
khả năng ức chế quá trình tổng hợp melanin từ ô dược.
2. Tình hình nghiên cứu
 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Cho đến nay, những nghiên cứu về loài ô dược vẫn chưa được công bố nhiều.
Tuy nhiên, những nghiên cứu về những loài thuộc chi Lindera đã được công bố.
Năm 1925, lần đầu tiên Kondo và cộng sự đã xác định được hợp chất lindeneol
từ loài L. strychnifolia. Sau đó, năm 1964, takeda và cộng sự đã xác định được hơn
100 chất tương tự, những hợp chất này chủ yếu được phân lập từ L. strychnifolia, L.

2



Khảo sát khả năng ức chế quá trình tổng hợp hắc tố của cao chiết ô dược.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu
4.1. Giai đoạn 1
-

Tiến hành chiết, cô quay chân không và thu cao methanol.

-

Định tính thành phần hoá học từ cao methanol.

-

Thử hoạt tính kháng oxy hóa từ cao methanol thu được.

3


Đồ án tốt nghiệp

-

Khảo sát tác dụng của ô dược lên quá trình tổng hợp melanin.

-

Khảo sát tác dụng của ô dược lên độc tính của tế bào u sắc tố B16F10.

4.2. Giai đoạn 2

dược.

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phần
hóa học các chất từ thực vật.
- Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và ứng
dụng của loài ô dược.
 Nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp lấy và xử lí mẫu.
-

Phương pháp tách chiết các hợp chất hữu cơ bằng dung môi: phương pháp
chiết rắn – lỏng, chiết lỏng – lỏng.

4


Đồ án tốt nghiệp

-

Phương pháp xác định thành phần hoá: định tính và sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC).

-

Phương pháp sinh học thăm dò hoạt tính kháng oxy hoá và ức chế quá trình
tổng hợp hắc tố của cao chiết.

-


-

Chương 3: Kết quả và thảo luận

-

Chương 4: Kết luận và đề nghị.

5


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về chi Lindera (Họ Lauraceae)
1.1.1. Chi Lindera (Họ Lauraceae)
Chi Lindera thuộc họ Long não (Laraceae) hay còn gọi là Nguyệt quế, gồm
khoảng 100 loài, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn
thế giới, đặc biệt là các nước Đông Nam Á và Brazil. Chúng chủ yếu là các loại
thân gỗ hay cây bụi có hương thơm (Võ Văn Chi, 1997). Cây gỗ có cành non màu
xanh, vỏ có mùi thơm, thường có chồi ngủ đông. Lá thường mọc cụm đầu cành, có
ba gân chính hay hệ gân đơn giản. Hoa mẫu ba, thường có nhị lép và tuyến mật ở
gốc chỉ nhị. Quả thường có đài dính liền, phát triển thành dạng đấu dưới quả (Phạm
Hoàng Hộ, 1991) (Hình 1.1).
Theo thông kê “Tiếp cận các nguồn gen và chia sẻ lợi ích” của Tổ chức Bảo
tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), Lindera không chỉ mang giá trị kinh tế cao mà
bên cạnh đó nó còn mang tính dược lý và sinh học như khả năng chống ung thư, cao
huyết áp, kháng viêm và được dùng làm thuốc giảm đau. Các nghiên cứu đã tìm ra
được khoảng 341 thành phần có trong cây bao gồm sesquiterpenoids, alkaloids,
butanolides, lucidones, flavonoids và phenylpropanoids. Butanolides và lucidones

cộng sự, 1985).

Lindera glauca

Lindera aggregate

Lindera myrhaa

Lindera obtusiloba

7


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Lindera
1.1.2. Nghiên cứu về thành phần hoá học
Trong tổng thể, 341 chất chuyển hóa thứ cấp đã được cô lập và xác định từ chi
Lindera cho đến nay. Những thành phần chủ yếu gồm có bảy loại: sesquiterpenoids,
alkaloids, butanolides, lucidones, flavonoids, phenylpropanoids và các loại khác.
Trong đó, sesquiterpenoids và alkaloids là thành phần chiếm ưu thế (Hình 1.2, hình
1.3).
1.1.2.1. Sesquiterpenoids
Năm 1925, Kondo và cộng sự lần đầu tiên đã xác định được hợp chất lindeneol
từ loài L. strychnifolia. Năm 1964, Takeda và cộng sự đã xác định được hơn 100
chất tương tự. Nhìn chung, những hợp chất này được phân lập từ L. strychnifolia, L.
chunii, và L. aggregata. Một số hợp chất có đặc tính kháng ung thư, kháng viêm và

R1: OH


Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.2. Alkaloids
Alkaloids là một trong những chất chuyển hoá thứ cấp phổ biến nhất và là
thành phần quan trọng trong chi Lindera. Đa số các hợp chất alkaloids có tác dụng
giảm huyết áp, chống viêm và giảm đau đáng kể.
Năm 2000, Chang và cộng sự đã xác định được những hợp chất alkaloids từ 10
loài Lindera như: aporphines, benzylinocinolines, isopavines, proaporphine.

R1: H
R2: OCH2O
R3: OCH2O
R4: H

R1: H
R2, R3: -CH2R4, R5: -CH2R6: H
Hernandonine

Lindechunine B

R1: H
R2: H
N-p-Coumaroyltyramine

Squamolone

R: H
Hernovine

Northalifoline

gân phụ bắt đầu từ điểm cách cuống lá 2 mm, dài ra chừng 2/3 lá, mặt trên lõm, mặt
dưới lồi lên. Cuống dài 7 - 10 mm, lúc đầu có lông, sau nhẵn, mặt trên hõm thành
rãnh (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Cụm hoa tán đơn tính, hợp thành tán nhỏ, mọc ở nách lá, không cuống,
đường kính 3 - 4 mm. Bao hoa 6 thùy, ở hoa đực, nhị hữu thụ 9, xếp 3 vòng, vòng
trong cùng mỗi nhị có 2 tuyến, nhị lép 3. Bầu gần hình cầu, có lông, vòi cong. Quả
mọng hình trứng khi chín có màu đỏ, một hạt (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Rễ ô dược đa số hình thoi, hơi cong, hai đầu hơi nhọn, phần giữa phình to
thành hình chuỗi dài khoảng 10 - 13 cm, đường kính ở chỗ phình to là 1 - 2 cm. Mặt
ngoài màu nâu vàng hoặc màu nâu nhạt vàng, có vết của rễ tơ đã rụng, có vằn nứt

10


Đồ án tốt nghiệp

ngang và nếp nhăn dọc. Cứng, khó bẻ gãy, mặt cắt ngang màu nâu nhạt, hơi hồng,
hơi có bột, ở giữa màu đậm hơn, có vằn tròn, và vằn hoa cúc. Mùi hơi thơm, vị hơi
đắng, cay (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Toàn cây có mùi thơm, vị đắng (Đỗ Tất Lợi, 2000).
Mùa hoa nở rộ tháng 4, ở phía Nam mùa hoa sớm hơn. Cây tái sinh bằng hạt
(Lê Đình Sáng, 2010).

Hình 1.4. Cây ô dược

11


Đồ án tốt nghiệp


rút ngắn thời gian đông máu và có tác dụng cầm máu (Đỗ Tất Lợi, 2000).
1.3. Tổng quan về quá trình tổng hợp sắc tố da
1.3.1. Ảnh hưởng của tia cực tím (UV) trên người
Cuộc sống trên trái đất kể từ khi ra đời đã phụ thuộc vào một nguồn năng
lượng mặt trời. Trong quang hợp, sinh vật như vi khuẩn, tảo và các thực vật bậc cao

12


Đồ án tốt nghiệp

sử dụng chất diệp lục để thu năng lượng từ khu vực cụ thể của quang phổ của mặt
trời, cho phép nó được chuyển đổi thành năng lượng hóa học sử dụng trong các
hình thức của phân tử đường, với oxy phân tử như một sản phẩm phụ quan trọng.
Mặc dù chúng ta được hưởng rất nhiều tác dụng có lợi của năng lượng bức xạ mặt
trời, nhưng con người cũng rất nhạy cảm với những tác động có hại của một thành
phần của quang phổ: ánh sáng cực tím (Przemyslaw và Maja, 2006).
Tia cực tím hay tia tử ngoại, tia UV (Ultraviolet) là sóng điện từ có bước
sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X, có bước sóng từ 100 đến
400 nm. Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến
200 nm) và tử ngoại xạ hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10 nm)
(Andrzej và John, 1988).
Khi quan tâm đến ảnh hưởng của tia cực tím lên sức khỏe con người và môi
trường, thì phổ của tia cực tím chia ra làm các phần: UVA (380 - 315 nm), hay gọi
là sóng dài hay "ánh sáng đen", UVB (315 - 280 nm) gọi là bước sóng trung bình và
UVC (ngắn hơn 280 nm) gọi là sóng ngắn hay có tính tiệt trùng. UV chân không
với bước sóng 100 - 200 nm và UVC (200 - 290 nm) có tác dụng gây đột biến và
gây chết người (Andrzej và John, 1988).
