TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO
SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU MẮC
MẬT (Clausena Indica)

Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG
Người thực hiện: PHẠM HỒNG NGỌC TÚ
Lớp

: 14060301

Khoá

: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018


2

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, quý thầy cô
Khoa Khoa học ứng dụng và Bộ môn Công nghệ sinh học đã hết lòng truyền đạt cho
tôi những kiến thức bổ ích về lý thuyết và thực tiễn để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm
vụ học tập trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Để có được khóa luận này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị

và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu Mắc mật
(Clausena indica)”, dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Dung. Đề tài được thực hiện
tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Tôn Đức Thắng. Thời gian nghiên
cứu từ tháng 9/2018 đến tháng 01/2019.
Đề tài được thực hiện qua các giai đoạn sau:
-

Giai đoạn 1: Khảo sát ảnh hưởng của tình trạng nguyên liệu đến hiệu suất thu

-

hồi tinh dầu Mắc mật
Giai đoạn 2: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu Mắc mật bằng

-

phương pháp DPPH
Giai đoạn 3: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu Mắc mật

Qua quá trình thực nghiệm, thu được một số kết quả như sau:
-

Trong cùng một thời gian chưng cất như nhau, nguyên liệu lá Mắc mật tươi cho
hiệu suất thu hồi tinh dầu cao nhất với thể tích trung bình là 1,7 mL trong cùng

-

điều kiện thời gian, nhiệt độ.
Tinh dầu Mắc mật có khả năng kháng oxy hóa nhưng ở mức độ rất thấp do
khoảng chênh lệch IC50 của tinh dầu và mẫu đối chứng quá lớn. IC 50 của mẫu tinh


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
IC50

: Nồng độ của mẫu ức chế được 50% gốc tự do

HQ

: Hiệu quả kháng

NT

: Nghiệm thức

PGA : Potato glucose agar

DANH MỤC CÁC HÌNH


8

DANH MỤC CÁC BẢNG


9

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu Mắc mật
Đồ thị 4.1 Đồ thị biểu hiện phần trăm ức chế của vitamin C theo các nồng độ


Xác định loại nguyên liệu thích hợp có được hiệu suất thu hồi tinh dầu cao nhất với
phương pháp chưng cất tinh dầu bằng lôi cuốn hơi nước, đồng thời khảo sát hoạt tính
kháng oxy hóa, kháng khuẩn của tinh dầu Mắc mật.
1.3 Yêu cầu
- Xác định loại nguyên liệu thích hợp để thu tinh dầu Mắc mật bằng phương pháp
-

chưng cất lôi cuốn hơi nước
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu Mắc mật
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Mắc mật


12

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây Mắc mật [3]

Cây Mắc mật, hay còn được gọi là Hồng bì núi, Dương tùng hoặc Củ khỉ, là loài thực
vật có hoa thuộc họ Cửu lý hương, thường mọc trên núi đá vôi, chủ yếu ở khu vực
miền núi phía Bắc.
Là loại cây gỗ nhỏ, cao tầm 5-7 m, phân cành thấp. Lá kép lông chim mọc cách nhau,
chiều dài lá tối đa gần 10 cm, chop lá nhọn. Quả Mắc mật hình cầu, thịt có màu trắng
hơi đục hoặc trắng trong, khi chín có thể ăn trực tiếp mà không cần qua chế biến. Mắc
mật ra hoa vào khoảng tháng 4-5, đậu quả vào khoảng tháng 7-8.

Hình 2.1 Quả và lá Mắc mật
Từ xa xưa, người dân vùng núi phía Bắc đã biết sử dụng lá và quả Mắc mật phục vụ
cho việc chế biến món ăn vì chúng có chứa hàm lượng tinh dầu rất cao, làm cho món
ăn có mùi vị rất ngon và đặc trưng. Lá Mắc mật cho đến ngày nay vẫn còn rất nổi tiếng

dung môi hữu cơ
Nhiệt độ sôi của tinh dầu không ổn định mà phụ thuộc vào các thành phần hóa học có
trong tinh dầu
2.2.2.2 Tính chất hóa học

Thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu là các hợp chất thuộc nhóm Terpenoid (là các
hydrocarbon không no), do đó chúng rất dễ bị phân hủy hoặc oxy hóa dưới tác dụng


14

của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, tạo thành các hợp chất khác làm biến đổi tính chất
ban đầu của tinh dầu
2.2.3 Các sản phẩm của tinh dầu
2.2.3.1 Tinh dầu dạng cô kết

Sản phẩm tinh dầu cô kết thu được từ phương pháp ngâm chiết tĩnh, dùng để sản xuất
nước hoa khô. Sản phẩm này ngoài tinh dầu còn chứa sáp và chất béo, có dạng sệt, đặc,
có thể sử dụng trực tiếp.
2.2.3.2 Tinh dầu tinh khiết

Sản phẩm tinh dầu tinh khiết được thu nhận bằng cách loại bỏ các tạp chất như sáp,
chất béo bằng ethanol tinh khiets, sau đó làm lạnh đột ngột và loại bỏ chất kết tinh.
Phần dịch thu được đem đi cô quay chân không loại dung môi thu được tinh dầu tinh
khiết.
2.2.3.3 Nước chưng

Đây là phần nước còn lại sau khi lóng, gạn thu tinh dầu trong phương pháp chưng cất
lôi cuốn hơi nước, áp dụng các loại tinh dầu có giá trị thương mại cao, vì trong phần
nước thu được có chứa một phần tinh dầu hòa tan và phân tán. Nước chưng được xem

Dễ hấp thu ở thể khí

Sản phẩm tinh dầu thu được phải đạt các yêu cầu sau:
2.3.1

Có hương vị tự nhiên của nguyên liệu ban đầu
Quy trình kỹ thuật và phương pháp trích ly phải khai thác hết tinh dầu có trong
nguyên liệu với chi phí tối thiểu.
Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này dựa rên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán, lôi cuốn theo hơi nước
của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước
ở nhiệt độ cao. Phương pháp này đang được sử dụng rất phổ biến vì có thể ứng dụng
với cả nguyên liệu tươi hoặc khô.
Nguyên liệu được rửa sạch (nếu là nguyên liệu tươi), để nguyên hoặc cắt nhỏ tùy tính
chất của nguyên liệu, cho vào nồi cất. Cho luồng hơi nước đi qua hoặc đun trực tiếp
cùng với nước, hơi nước cùng hơi tinh dầu bay hơi sang bộ phận làm lạnh (ống sinh
hàn), ngưng tụ lại thành giọt và chảy xuống ống hoặc bình gạn. Tinh dầu có tỷ trọng
nhỏ hơn tỷ trọng của nước sẽ nổi lên trên, một vài trường hợp tinh dầu nặng hơn nước
sẽ chìm xuống dưới. Sau khi tắt thiết bị, không nên xả van thu tinh dầu liền mà nên để
yên vài phút để lắng tinh dầu. Khi thu tinh dầu nên thu cả phần nước vì trong phần


16

nước đó vẫn còn lẫn một ít tinh dầu, tồn tại ở 2 dạng: phân tán và hòa tan. Đối với dạng
phân tán, chỉ cần để lắng hoặc ly tâm sẽ thu được tinh dầu. Đối với dạng hòa tan, có thể
cho muối ăn vào làm tăng tỷ trọng của nước, giúp tinh dầu nổi lên trên hoặc dung dung
môi hữu cơ dễ bay hơi để chiết rồi cô quay đuổi dung môi.
Trong một vài trường hợp, một số chất mẫn cảm với nhiệt, dễ bị biến tính ngay cả ở

-

liệu
Hòa tan kém các hợp chất sáp, nhựa dầu trong nguyên liệu
Không xảy ra phản ứng hóa học với tinh dầu


17

-

Không biến chất khi tái sử dụng nhiều lần
Độ tinh khiết cao, không ăn mòn thiết bị, không tạo hỗn hợp nổ với không khí
Độ nhớt kém
Điểm sôi của dung môi thấp hơn điểm sôi của cấu tử dễ bay hơi nhất trong tinh
dầu

Tuy nhiên trong thực tế, không có loại dung môi nào đáp ứng hoàn toàn các yêu cầu
trên mà chỉ ở mức độ tương đối. Thông thường người ta sử dụng các loại dung môi như
petroleum ether, diethyl ether, ethanol, methanol, hexane,…
Nguyên liệu sau khi làm sạch được ngâm trong dung môi bằng bình chứa với tỷ lệ
thích hợp và được xáo trộn đều trong suốt thời gian ly trích. Giữ nguyên liệu chìm
hoàn toàn trong dung môi từ 24-48h, thu dịch trích ly, làm khan bằng Na2SO4, lọc lại
bằng giấy lọc sau đó đem đi cô quay đuổi dung môi. Sản phẩm thu được sau khi cô
quay gồm tinh dầu, nhựa, sáp, chất béo,… Cho ethanol tinh khiết vào hỗn hợp trên,
khuấy đều ở nhiệt độ phòng liên tục trong vài ngày, sau đó làm lạnh về 10-15oC, lọc lại
bằng giấy lọc. Ở nhiệt độ này, nhựa và chất béo sẽ đông lại, chỉ còn tinh dầu hòa tan
trong ethanol. Đem dung dịch này đi cô quay, thu được tinh dầu tinh khiết.
2.3.4


có trong nguyên liệu mà chọn phương pháp tách chiết tiếp theo cho phù hợp: chưng cất
hơi nước, hấp thụ,…
2.3.6

Phương pháp ép

Phương pháp này được áp dụng với các loại nguyên liệu có tinh dầu được chứa trong
vỏ tươi như vỏ chanh, vỏ quýt, vỏ cam,… Có thể thực hiện phương pháp này bằng tay
hoặc bằng máy. Tinh dầu sau khi ép sẽ hơi đục, cần được để lắng một thời gian để
trong lại, hương thơm của tinh dầu dịu nhẹ, không quá nồng.
2.4 Tinh dầu Mắc mật

Tinh dầu Mắc mật thông thường được thu từ lá và quả Mắc mật, vì tại hai bộ phận đó
có chứa hàm lượng tinh dầu cao nhất, bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
Tinh dầu Mắc mật có tỷ trọng nhẹ hơn nước, màu vàng rất nhạt, vị thơm ngọt đặc
trưng, càng để lâu tinh dầu càng sánh lại.
Thành phần hóa học của tinh dầu trong quả và lá Mắc mật không hoàn toàn giống
nhau. Ngoài ra, thành phần chất thơm trong tinh dầu Mắc mật còn phụ thuộc rất nhiều
vào loại giống, khí hậu, đất đai tại địa phương trồng, kỹ thuật chăm sóc,…
Tinh dầu Mắc mật thực tế không có giá trị thương mại cao như các loại tinh dầu khác,
tuy nhiên, tinh dầu này vẫn được người dân phía Bắc sử dụng để chế biến thức ăn hoặc
làm thuốc chữa các bệnh liên quan đến sự viêm nhiễm, bảo vệ gan,…
2.5 Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp
2.5.1 Escherichia coli [1]
2.5.1.1 Đặc điểm sinh vật học


19

Escherichia coli (E. coli) là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình khoảng 0,5x(23) µm, không sinh nha bào. Hầu hết có lông và di động được. E. coli là vi khuẩn hiếu


Staphylococcus aureus (S. aureus) (tụ cầu vàng) là vi khuẩn hình cầu, có đường kính
0,8-1 µm, thường đứng tụ lại thành chùm như chùm nho. Là vi khuẩn Gram (+), không
có vỏ, không có lông và không sinh nha bào.
S. aureus dễ dàng phát triển trên các môi trường nuối cấy thông thường, với khoảng
nhiệt độ khá rộng tù 10-45oC. Trong môi trường canh thang, vi khuẩn phát triển mạnh
làm đục đều môi trường, để một thời gian sẽ lắng cặn xuống đáy. Trong môi trường
thạch thông thường, vi khuẩn phát triển nhanh tạo khuẩn lạc có dạng chữ S, có màu
vàng chanh. Trong môi trường thạch máu, vi khuẩn phát triển nhanh tạo khuẩn lạc có
dạng chữ S, làm tan máu hoàn toàn.
2.5.2.2 Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn ngoài da: Vi khuẩn thường ký sinh ở da và niêm mạc, chúng xâm nhập
qua vết thương hoặc lỗ chân lông trên da làm nhiễm khuẩn và sinh mủ. Mức độ viêm
nhiễm phụ thuộc vào mức độ đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn.
Nhiễm khuẩn huyết: Loại nhiễm khuẩn này thường xảy ra sau nhiễm khuẩn tiên phát,
thông thường là nhiễm khuẩn ngoài da, sau đó vi khuẩn xâm nhập vào máu rồi di
chuyển đến các cơ quan nội tạng, gây hội chứng apxe (ở gan, phổi, não, xương). Điều
này gây viêm tắc tĩnh mặc, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao.
Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: Nguyên nhân gây ra là do ăn uống thực phẩm có
chứa độc tố ruột hoặc do tụ cầu cư trú sẵn trong đường ruột, khi lạm dụng kháng sinh
trong thời gian dài, các loại vi khuẩn bình thường sẽ bị tiêu diệt, làm tăng khả năng
sinh sôi nảy nở cho tụ cầu vàng và đồng loạt tiết độc tố gây bệnh. Bệnh nhân thường có
các triệu chứng nôn mửa, tiêu.chảy dữ dội, đi ngoài nhiều nước, có thể gây sốc do mất
nước và điện giải.
2.5.2.3 Phòng và trị bệnh

Phòng bệnh: Tăng cường công tác vệ sinh môi trường, vệ sinh cá nhân và vệ sinh ăn
uống. Khử trùng kỹ càng các dụng cụ y khoa trước khi tái sử dụng nhằm hạn chế khả
năng xâm nhiễm.

enzyme thủy phân như protease, lipase,... giúp quá trình tiêu hóa diễn ra tốt hơn.
Tăng cường các phản ứng miễn dịch: B. Subtilis có thể làm tăng đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu

Cải thiện môi trường sống:
-

Phân hủy chất thải: B. subtilis có khả năng tiết các enzyme phân hủy các chất
hữu cơ như polysaccharide, chất đạm, chất béo thành các đơn vị cấu tạo nhỏ
hơn. Ngoài ra chúng còn tham gia vào quá trình amon hóa protein, nghĩa là phân

-

giải các hợp chất hữu cơ có chứa nito và giải phóng NH3.
Giải độc NH3, H2S: Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa
hoàn toàn, gây tích lũy nhiều hợp chất như NH 3, CO2, H2S, acid hữu cơ, rượu,


22

mecaptan và những chất độc như diamin, tomain, indol, scatol. Trong trường
hợp này, B. subtilis đóng vai trò thúc đẩy quá trình phân hủy các hợp chất, giảm
lượng chất dư thừa, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi dưới đáy ao (đối với ngành
thủy sản).
Ức chế tác nhân gây bệnh: Được xem như là một lợi khuẩn với tốc độ phát triển khá
tốt, B. subtilis còn được sử dụng cho việc ức chế tác nhân gây bệnh thông qua các khả
năng như tiết kháng sinh kháng lại các vi sinh vật gây bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng và
cạnh tranh chất sắt với các vi sinh vật gây bệnh làm giảm thiểu khả năng sinh sản và
phát triển của chúng.
2.5.4

2.6 Các loại nấm gây bệnh thực vật
2.6.1 Brachycladium papaveris
2.6.2 Fusarium ambrosium [19]

Ffusarium ambrosium (F. ambrosium) ký sinh hoặc hoại sinh trên cây trồng, cây ăn quả
và rau. Hệ sợi nấm lan tỏa và lấp kín mạch gỗ, làm cản trở quá trình vận chuyển nước
từ rễ lên các bộ phận khác của cây dẫn đến héo cây. Bên cạnh đó loài nấm này còn tiết
ra chất độc gây héo rũ cây
2.6.3

Rhizoctonia solani [7]

Rhizoctonia solani (R. solani) là một loại nấm đảm, có khả năng tồn tại trong khoảng
nhiệt độ lớn từ 5-42oC, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 28-31oC. Ngoài ra khoảng
pH của chúng cũng rộng không kém, từ 2-8, trong đó pH tối thích là khoảng 5-7.
Gây bệnh khô vằn hại lúa (một loại bệnh khá nghiêm trọng đối với nông nghiệp lúa
nước) và lở ổ rễ ở cây rau. Bệnh thường phát sinh ở các bẹ lá già phía dưới. Trong điều
kiện nhiệt độ tối thích kết hợp với độ ẩm cao trong mùa mưa, hoặc nước ở các đồng
ruộng lên quá cao, cấy quá dày sẽ làm tốc độ lây lan tăng nhanh.
2.6.4

Sclerotium rolfsii [13][14]

Sclerotium rolfsii (S. rolfsii) là một mầm bệnh nấm hoại tử trong đất, phát triển trong
điều kiện hiếu khí, nên thường xuất hiện ở rất gần mặt đất. Chúng có thể tồn tại trong
vài năm, và có thể không cần vật chủ. S. rolfsii phát triển ở nhiệt độ cao (27-35oC)
trong điều kiện ẩm ướt và đất có tính acid (pH 3-7).
S. rolfsii gây bệnh trên rất nhiều loài thực vật. Tơ nấm của chúng phát triển nhanh
mạnh bao lấy vật chủ, tiêu diệt các mô thực vật bằng cách sản xuất acid axalic và các
enzyme phân hủy thành tế bào, gây hư thối cây, quả,…

chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt.
2.7.2.2 Tính toán

Kết quả khả năng dọn gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau:

DPPH scavenged (%) =

AB − AA
x100
AB

Trong đó: AB: độ hấp thu của dịch mẫu sau khi được ủ 30 phút
AA: độ hấp thu của mẫu blank (dung dịch DPPH)

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
3.1.1 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Khoa Khoa học ứng dụng, Bộ môn Công nghệ
sinh học, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh
3.1.2

Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2018 đến tháng 1/2019
3.2 Vật liệu thí nghiệm
3.2.1 Vật liệu để chưng cất tinh dầu Mắc mật

Lá Mắc mật tươi được mua tại quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh
3.2.2