BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
 DIỆP THỊ TỨ QUYỀN
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA
THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN
Ở TỈNH KHÁNH HÒA.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN
Ở TỈNH KHÁNH HÒA.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm GVHD: TS Nguyễn Duy Nhứt Nha Trang, tháng 07 năm 2012
i

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài này
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt đã tận tình hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Chế Biến đã truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập ở trường.
Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ
Nha Trang cùng các anh chị làm việc ở Viện đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian
thực tập vừa qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè đã tận tình
động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

CẤP TỪ RONG BIỂN 13
1.4.1. Acetogenins 13
1.4.2. Terpenoids 13
1.4.3. Alkaloids 13
1.4.4. Phenolics 14
iii

1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN 15
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ưu ở công đoạn chiết cồn của quy trình tách chiết
17
2.3.1.1. Qui trình dự kiến tách chiết hỗn hợp chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 17
2.3.1.2. Giải thích quy trình: 18
2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm: 19
2.3.2. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa
bằng phương pháp chiết ethanol. 22
2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol
từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. 23
2.3.3.1. Nguyên tắc 23
2.3.3.2. Tiến hành 23
2.3.4. Tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi
phân cực khác nhau 24
2.3.5. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách
trên các dung môi có độ phân cực khác nhau 26
2.3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa
thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cực khác nhau 27

loài rong nghiên cứu 37 vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins 2
Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids 3
Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids 3
Hình 1.4. Cấu trúc của alkaloids 4
Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics 5
Hình 1.6. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong đỏ 6
Hình 1.7. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong nâu 7
Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục 8
Hình 1.9. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ tảo lam 9
Hình 1.10. Vibrio spp phân lập từ tôm sú bệnh đốm trắng 11
Hình 1.11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực của tôm nhiễm bệnh đốm trắng 11
Hình 2.1. Sơ đồ qui trình dự kiến tách chiết chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 18
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ethanol 19
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết ethanol 20
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết ethanol 21
Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng
các dung môi phân cực khác nhau. 25
Hình 3.1. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nồng độ ethanol 28
Hình 3.2. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nhiệt độ 30
Hình 3.3. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào thời gian 31
Hình 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol 34
Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn khác nhau 36


trình nghiên cứu về rong biển và đã đưa vào thực tiễn ứng dụng trên người, động vật
và thủy hải sản. Tuy nhiên nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ rong biển thì không
nhiều.
Vì vậy, đề tài ”Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của
hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh
Khánh Hòa ” là cần thiết, góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu dược liệu, công nghệ
sinh học và nông nghiệp.
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Diệp Thị Tứ Quyền
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH
1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp
Các chất chuyển hóa thứ cấp là các hợp chất không cần thiết cho sự tăng
trưởng và tái sinh của thực vật, tuy nhiên các chất này góp phần giúp cho thực vật
ngăn cản các loại động vật ăn cỏ sử dụng chúng làm thức ăn, giúp thực vật chống đỡ
các loài vi khuẩn, và giúp cho thực vật nhận ra các mối đe dọa xung quanh [6].
Các chất chuyển hóa thứ cấp là chìa khóa cho sự tương tác giữa thực vật với
môi trường hữu sinh và vô sinh đang gây ảnh hưởng lên chúng. Theo suốt lịch sử phát
hiện và ứng dụng của các chất chuyển hóa thứ cấp phục vụ cho loài người, có thể
phân chúng thành 4 nhóm chính: alkaloids, phenylpropanoids, flavonoids và
terpenoids và đối với rong biển các chất chuyển hóa thứ cấp có trong rong biển có thể
liệt kê thành 4 nhóm cấu trúc: Terpenoids, Acetogenins, Alkaloids và Phenolics.[9]
1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp
Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp có thể liệt kê ra như sau:
 Antistaphylococcal [4]
 Sử dụng chúng như tín hiệu phân loài [7]

Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids
4

1.1.3.3. Alkaloids
Alkaloids là hoạt chất có nguồn gốc từ sinh vật, thường là thực vật. Phân tử
alkaloids luôn luôn có chứa C, H, N, và rất hay gặp oxi, đặc biệt có vài alkaloids có
chứa lưu huỳnh. Có ít hoặc nhiều phản ứng kiềm, những alkaloids đầu tiên phát hiện
được gọi là các chất kiềm thực vật. Chúng được coi như là các bazơ nitơ hữu cơ và
cho các muối với axít. Các muối này dễ kết tinh. Về danh pháp, tên của chúng
(thường nhắc đến tên cây mà từ đó chúng được chiết xuất) mang đuôi in.
Hàm lượng alkaloids trong thực vật thay đổi trong giới hạn rất rộng. Ngày nay
người ta qui ước nói đến thực vật có alkaloids khi hàm lượng của chúng lớn hơn
100ppm. Nhiều alkaloids có trong thực vật 2 đến 3%. Đặc biệt trong vỏ cây canh ki
na có hơn 10%. Alkaloids hòa tan trong dịch tế bào, ít thấy ở trạng thái tự do, thông
thường ở dạng muối (malat, xitrat, tactrat …) hoặc kết hợp với tanin. Trong một loài
thực vật hiếm thấy chỉ có một alkaloid, mà hay gặp một nhóm bazơ ít nhiều giống
nhau về cấu trúc.
Trong alkaloids, thường gặp amin bậc 1 bậc 2 hay bậc 3. Thông thường nitơ
tham gia vào nhân dị vòng, nhưng đôi khi cũng có thể ở ngoài vòng.
Nhiều alkaloids có tác dụng trên hệ thần kinh trung ương như là chất gây trầm
uất hoặc làm chất kích thích. Một số lớn các chất tác dụng lên dây thần kinh tự chủ:
chất kích thích giao cảm, các chất liệt giao cảm, các chất kích thích phó giao cảm, các
chất liệt phó giao cảm, các chất phong bế hạch giao cảm.
Trong số các alkaloids có các chất gây tê tại chỗ, có chất trị co giật. Một ít Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics 6

1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển

Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục 9
thẳng hoặc nơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Cơ bản chúng đều sống
trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, liên quan đến các động vật
biển. Một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển.
Vi khuẩn vibrio có rất nhiều trong nước mặn, và độ mặn càng cao thì vibrio càng
nhiều, vì chất Natri (Na, Sodium) trong nước mặn là yếu tố phát triển của vi khuẩn vibrio,
do đó khi độ mặn cao trên 20 phần ngàn thì phát sang nước thường xảy ra.
Loại vi khuẩn này thuộc nhóm Gram âm sống dưới nước và phân chia tế bào
rất nhanh ở độ mặn 0-40 phần nghìn đặc biệt khi nhiệt độ nước tăng cao. Do đó bệnh
thường hay xảy ra vào mùa hè.
Ngoài ra vi khuẩn loại này còn phát triển ở môi trường nước có hàm lượng chất
hữu cơ cao, hàm lượng oxy thấp. Các triệu chứng bệnh như: mòn đuôi, đứt râu, đường
ruột, đen mang, đỏ than, đỏ đuôi. Tôm bơi gần bờ phát hiện có màu đỏ nhạt và các
chứng bệnh như trên.
Vi khuẩn vibrio có nhiều trong môi trường nước mặn, do đó khó phát hiện ra là
chủng loại nào thật sự gây bệnh. Có rất nhiều tranh luận về tác nhân gây bệnh vibrio,
nhưng những báo cáo khoa học về bệnh vibrio không chung một chủng loại ở một nơi
nhất định. Cũng có nhiều ý kiến cho rằng tác nhân gây bệnh vibrio chính là một
protein độc của vi khuẩn này sau khi chết được tiết ra trong cơ thể tôm gây ngộ độc,
vì có rất nhiều trường hợp khi phát hiện tôm nhiễm vibrio người nuôi thường dùng
kháng sinh trị bệnh, nhưng tôm lại có dấu hiệu bệnh nặng hơn trước khi dùng thuốc.
Vi khuẩn này có thể sống được trong môi trường thiên nhiên, tuy nhiên chúng sẽ
chết dưới ánh sáng mặt trời, sức đề kháng yếu. Sống được khá lâu ở sông ngòi, ao hồ.
Môi trường nuôi cấy thường là canh thang, pepton kiềm ph = 8,6 hoặc thạch
kiềm muối hoặc thạch TCBS hoặc thạch TSB. 11

1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp
Những loài gây bệnh cho tôm là: V. alginolyticus, V. anguillrium, V. ordalii, V.

Sử dụng chất chuyển hóa đưa thẳng vào dịch chứa virus để diệt:
Chuẩn bị dịch chứa virus đốm trắng [12]
Nội tạng của tôm bị bệnh đốm trắng được nghiền với hỗn hợp gồm:
90 ml (1% w/v M199, 1.88 M NaCl, 0.06 M CaCl
2.
2H
2
O, 0.1 M L-glutamine,
9.14 mM Hepes) trộn với 10ml (3.2 mM NaH
2
PO
4
.2H
2
O, pH 7.3–7.6) có chứa 5g hỗn
hợp (3.725g KCl, 29.52g MgSO
4
.7H
2
O, 32.48g MgCl
2
.6H
2
O). Sau đó ly tâm
3000v/phút trong 10 phút. Phần lỏng bên trên được tách ra và tiếp tục ly tâm
8000v/phút ở 4
0
C trong 30 phút, lọc qua màng lọc 0.45m.
Các dịch chứa virus đốm trắng sử dụng được pha loãng trong LHM (lobster
haemolymph medium)

O (90/10). Tỉ
lệ vật liệu khô/dịch chiết là 2/3 (w/v). Metanol được loại bỏ, phần còn lại được chiết
với EtOAc vài lần. Sau đó cho bay hơi dung môi thu được hỗn hợp các chất chuyển
hóa. Chất chuyển hóa được đưa lên cột silicagen, sau đó được rửa giải với 3 dung môi
CHCl
3
, EtOAc, MeOH với tỉ lệ cho độ phân cực tăng dần. Các phân đoạn rửa giải thu
trên collection sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa học cũng như các
phổ cấu trúc.
1.4.2. Terpenoids
Terpenoids được chiết từ rong bằng hỗn hợp dung môi CH
2
Cl
2
-MeOH, sau đó
hoạt chất được đưa lên silicagen và rửa bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau
như n-hexan, CH
2
Cl
2
, EtOAc, MeOH thành các phân đoạn khác nhau. Các hợp chất
trong phân đoạn được tách trên sắc ký bản mỏng và xác định cấu trúc bằng các
phương pháp hóa cùng với các phổ cấu trúc.
1.4.3. Alkaloids
Alkaloids được chiết trong MeOH 70%, cho hấp phụ lên silicagen, sau đó rửa
giải với các dung môi MeOH, CH
2
Cl
2
, n-hexan, H

biển trong nhiều dung môi khác nhau bao gồm: Methanol, acetone, diethyl ether, và
ethanol để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính thể hiện mạnh nhất ở rong nâu là
dịch chiết thô ethanol “Antimicrobial Activities of the Extracts of Marine Algae from
the Coast of Urla (Üzmir, Turkey)”.
15

Ở Việt Nam, năm 2009, tác giả Bùi Minh Lý cùng các cộng sự cũng đã tiến
hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô từ một số loài rong biển trong
công bố “Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của một số loài rong biển Khánh Hoà” đã
chiết các chất chuyển hoá thứ cấp bằng ethanol.
1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN
Từ các nghiên cứu đã công bố cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật của các chất
chuyển hóa thứ cấp từ các loài thực vật khác nhau được thể hiển trong dịch chiết từ
các dung môi khác nhau, tuy nhiên đối với rong biển các tác giả thường khảo sát dịch
chiết trong ethanol.
Như đã nêu trên, tác giả Piyalai Hemtanon trong công trình “Antiviral and
Antibacterial Substances from Spirulina platensis to combat White Spot Syndrome
Virus and Vibrio harveyi” đã dùng phương pháp chiết thô rong trong ethanol và dùng
chung dịch chiết này để xử lý virus đốm trắng và vibrio.
Trong khuôn khổ luận văn tốt nghiệp đại học với thời gian rất ngắn cùng với
việc Bộ NN&PTNT không cho phép gây nhiễm WSSV, chúng tôi chọn đối tượng cần
xử lý để khảo sát hoạt tính của các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển là vibrio
harveyi và phương pháp chiết các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển ban đầu là
chiết trong ethanol, hoàn toàn phù hợp theo phương pháp của các nhà khoa học đã
thực hiện.
16

CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


4 Gracilariopsis
bailinea
16 Valonia macrophysa 28 Sargassum
denticarpum
5 Gracilaria firma 17 Monostroma nitidum

29 Sargassum
oligocystum
6 Gelidiella acerosa 18 Acetabularia major 30 Sargassum swartzii
7 Laurencia concreta 19 Enteromorpha
compressa
31 Sargassum assimile

Trích đoạn Kết quả xác định nồng độ ethanol trong công đoạn chiết ethanol Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ

---