LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin gửi tới Ban Giám
hiệu Trường Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào vì đã
được học tập tại Trường trong những năm qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Duy Nhứt – Viện
Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và ThS. Nguyễn Thị Mỹ
Trang – Bộ môn Đảm bảo chất lượng và An toàn thực phẩm đã tận tâm, tận
lực giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Nguyễn Đăng Khoa - cán bộ thu nhận
rong của Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp tôi
phân loại năm loại rong nâu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm công tác nghiên cứu
tại Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ tôi nhiệt
tình trong suốt quá trình làm đề tài tại Viện.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các
bạn bè tôi, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn
thành đồ án này. Sinh viên
Đỗ Thị Hồng Thắm ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỞ ĐẦU
iii
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
2.3.1. Khảo sát các phương pháp định lượng hàm lượng fucoidan 38
2.3.1.1. Bản quyền US6573250B2 38
2.3.1.2. Bản quyền EP0645143A1 41
2.3.1.3. Định lượng fucoidan theo quy trình tách chiết của Nguyễn Duy Nhứt và
cộng sự 43
2.3.2. Xác định thành phần đường của fucoidan 45
2.3.3. Bố trí thí nghiệm 51
2.3.3.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát các phương pháp định lượng hàm lượng
fucoidan 51
2.3.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng fucoidan trong năm loài rong Nâu
tại tỉnh Khánh Hòa 52
2.3.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần đường trung tính trong fucoidan
55
2.3.3.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết rút fucoidan ra khỏi nguyên
liệu rong S. polycystum 59
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 60
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61
3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG FUCOIDAN THU TỪ LOÀI RONG S.
SERRATUM BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU 61
3.2. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FUCOIDAN TRONG NĂM LOÀI RONG
NÂU THU MẪU TẠI TỈNH KHÁNH HÒA 64
3.3. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN ĐƯỜNG TRUNG TÍNH TRONG
HAI LOÀI RONG S. MCCLUREI VÀ S. POLYCYSTUM 66
3.4. SƠ BỘ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT TINH SẠCH
FUCOIDAN TỪ LOÀI RONG S. POLYCYSTUM 70
MWCO : Molecular weight cut off
NK : Natural killer
PLC : Performance Liquid Chromatography
Rha : D-Rhamnose
S. : Sargassum
Tế bào B : Lympho bào B
Tế bào T : Lympho bào T
TFA : Trifluoroacetic
UV-VIS : Utralviolet- Visible
WHO : World Health Organization
Xyl : D-Xylose
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Chỉ tiêu chất lượng của muối canxi clorua 38
Bảng 3.1. Hàm lượng fucoidan chiết tách bằng các phương pháp khác nhau (% so với
khối lượng rong khô) 61
Bảng 3.2. Hàm lượng fucoidan trong năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa (% so
với trọng lượng rong khô) 64
Bảng 3.3. Thành phần đường trung tính của fucoidan 68
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá quá trình chiết fucoidan từ rong nâu S. polycystum 71
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá quá trình tách laminaral 74
tỉnh Khánh Hòa so với cực đại. 65
Hình 3.3. Sắc ký đồ GC của hexaacetat glucitol 67
Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của các đường chuẩn 67
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn thành phần đường trung tính trong hai mẫu
fucoidan của hai loài rong S. polycystum và S. mcclurei 68
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình chiết xuất fucoidan cho hiệu suất chiết cao từ loài
rong S. polycystum 75 1
MỞ ĐẦU
Trong khoảng mười năm gần đây, số lượng các công trình nghiên cứu
fucoidan trên thế giới tăng đột ngột gần như dựng đứng trên đồ thị biểu diễn
số lượng công trình công bố theo thời gian. Năm 2012, cuốn sách “Sức mạnh
kỳ diệu của fucoidan” đã được xuất bản thành tiếng Việt từ nguyên bản tiến
Nhật và được nhập vào bán ở Việt Nam.
Đồng thời tại Việt Nam, nhiều đề tài nghiên cứu khoa học và dự án sản
xuất fucoidan thô, fucoidan sử dụng cho hỗ trợ điều trị chữa bệnh nan y cũng
đã được nhà nước đầu tư hàng chục tỉ đồng. Tuy nhiên, chưa có phương pháp
xác định hàm lượng fucoidan nào được đưa ra để sử dụng làm phương pháp
kiểm chung cho khu vực hoặc cả nước. Việt Nam, là một trong 3 nước (Ấn
Độ, Phillipin, Việt Nam) có phân bố số loài rong nâu lớn nhất thế giới và
Khánh Hòa là một trong những tỉnh có sản lượng nâu Nâu lớn nhất Việt Nam.
Trong bối cảnh đó, việc xác định hàm lượng fucoidan có trong một số loài
rong phổ biến tại Khánh Hòa và vấn đề thời sự, nhằm định hướng cho việc
khai thác chế biến ứng dụng fucoidan trong nghiên cứu cũng như trong sản
xuất, định hướng vật liệu để có sự chọn lựa trong việc sử dụng rong nâu làm
dược liệu hay làm keo rong. Cùng với việc thực hiện các đề tài nghiên cứu
dược liệu từ fucoidan của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha
Chúng có thể là đơn bào, đa bào sống thành quần thể. Hình dạng của chúng
có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt.
Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông,
vùng triền sâu, vùng biển cạn… Rong Đỏ và rong Nâu là hai đối tượng được
nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong các ngành công
nghiệp và đời sống.
Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái,
đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau:
1, Ngành rong Lục (Chlorophyta)
2, Ngành rong Trần (Englenophyta)
3, Ngành rong Giáp (Pyrophyta)
4, Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta)
5, Ngành rong Kim (Chrysophyta)
6, Ngành rong Vàng (Xantophyta)
7, Ngành rong Nâu (Phaecophyta)
8, Ngành rong Đỏ (Rhodophyta)
9, Ngành rong Lam (Cyanophyta)
Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong Lục, rong Nâu, rong
Đỏ. 4
Ngành rong Lục: có trên dưới 360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn sống
trong nước ngọt, nét đặc trưng của loài rong này là có màu lục Hình 1.1. Hình thái về rong Lục
Ngành rong Nâu: có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số
lượng loài tương đương nhau ở Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin,
Canada, Hàn Quốc tiếp theo sau là Thái Lan, Brazil, Pháp, Bồ Đào Nha,
Trung Quốc, Hawaii, Myanmar, Nam Phi, ít hơn nữa là Anh, Bangladesh,
Caribbe, Ireland, Peru, Tây Ban Nha, Achentina, Ấn Độ, Italy, Malaysia,
Mexico, New Zealand, Mỹ sau hết là rải rác có mặt ở Iceland, Alaska, Kenya,
Madagascar, Kiribati, Ai Cập, Israel, Ma rốc, Namibia, Tanzania. 6
Rong Nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là
Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, ấn Độ, kế tiếp là
Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha.
Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong Nâu đại
diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ
yếu ở vùng cận nhiệt đới. [phụ lục 1.1]
Hệ thống phân loại Sargassum trtên thế giới rất phức tạp, năm 1753 ba
loài thuộc chi Fucus: Fucus natans, F. acinarius và F. lendigerus do
Linnaeus mô tả lần đầu tiên nay được thay thế bằng chi Sargassum. Giữa
những năm 1808 đến 1819, 36 loài rong thuộc chi Fucus được mô tả ngày nay
cũng được chuyển sang chi Sargassum, năm 1820 J.Agardh giới thiệu chi
Sargassum với số loài lúc này là 62 loài. Sau thời gian đó rất nhiều tác giả
khác tiếp tục giới thiệu về Sargassum như Yendo (1907), Reinbold (1913),
Grunow (1915, 1916) and Setchell (1931). Số loài Sargassum lên đến 230.
Năm 1954 Womersley công bố hệ thống phân loại Sargassum của mình ở Úc,
cùng với các tác giả đương thời ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như
Phạm Hoàng Hộ của Việt Nam, Chou, Chiang của Taiwan và Ang, Trono của
Philippin, đến nay tổng số loài của chi Sargassum đã lên đến hơn 500.
Sargassum tại Việt Nam hiện nay có khoảng 70 loài (thực vật chí Việt Nam),
số lượng loài Sargassum phân bố trên các nước luôn thay đổi theo các nghiên
1.1.4. Ứng dụng của rong biển
Rong biển đã được sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công
nguyên ở Trung quốc. Sze Teu đã viết rằng 600 năm trước công nguyên, rong
biển đã được chế biến thành một món ăn quí dành cho vua chúa [36]. Thuốc
“trường sinh bất tử” được vị hoàng đế đầu tiên của Trung Hoa là Tần Thuỷ
Hoàng sử dụng vào năm 200 trước công nguyên đã được khoa học hiện đại
chứng minh đó chính là thành phần của rong Nâu sau hơn 2000 năm. 8
Năm 1812, người ta phát hiện trong rong Nâu có chứa Iod, từ đó người
ta dùng nguyên liệu rong Nâu để chế biến Iod. Năm 1870 rong biển đã được
quan tâm, người ta điều chế xà phòng từ các chất K
2
O, Na
2
O lấy từ rong Nâu.
Năm 1914 – 1915 Mỹ, Đức dùng rong Nâu để điều chế KCl, than hoạt tính.
[4]
Tại Nhật rong Nâu đã được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V [36],
cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm đã xem xét và cấp
phép cho các sản phẩm thực phẩm chức năng của Nhật được bổ sung thêm
thành phần fucoidan để tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ
máu … [31] và trở thành thực phẩm hỗ trợ trị bệnh nan y phổ biến của nước
Nhật.
Trong mười năm gần đây, chính quyền Trung Quốc đã chi phí đến 12
triệu USD để phát triển một loại thuốc trị AIDS từ rong Nâu với tên thương
phẩm là FUCOIDAN-GLYCALYX (F-GX). Loại thuốc tự nhiên này có khả
năng diệt virus HIV, tăng sức chịu đựng của phân tử miễn dịch. Ngày 01
190000m
2
. Trữ lượng rong mọc tại chỗ có thể thu được vào tháng 4 khoảng
hơn 800 tấn rong tươi.
Vùng biển Khánh Hòa là vùng có diện tích rong Mơ mọc cao nhất trong
các tỉnh điều tra, tổng diện tích rong lên tới 2.000.000 m
2
, trữ lượng khai thác
được hàng năm có thể ước tính hơn 11.000 tấn rong tươi. Khánh Hòa có nhiều
vùng rong như Hòn Chồng, Bãi Tiên, bán đảo Cam Ranh, Hòn Tre và một số
đảo khác. Trong đó hai vùng Hòn Chồng và Bãi Tiên là tiếp giáp nhau có các
điều kiện thuận lợi cho rong mọc với mật độ khá dày đặc, sinh lượng trung
bình khá cao lên tới hơn 5,5 kg/m
2
. Vùng Hòn Chồng, Bãi Tiên là vùng rong
lớn, dễ khai thác nhất, nó nằm ngay bên cạnh đường lộ và rong mọc tập trung
gần bờ.
Sinh lượng rong mọc tại chỗ đo được đều có xu hướng giảm dần từ
tháng 3 đến tháng 5. Nhưng về độ trưởng thành thì ngược lại. Vào tháng 3 10
rong còn non, thể hiện ở kích thước còn bé, chưa phóng thích các bào tử,
thành phần các chất tích lũy hãy còn thấp. Đa phần các loài rong trưởng thành
vào tháng 4 đầu tháng 5, do vậy tốt nhất là thu hoạch rong vào tháng 4 và
những tháng sau đó để rong đã trưởng thành, phóng thích các giao tử để duy
trì và bảo vệ nguồn lợi rong cho những năm sau. Sở dĩ có tình trạng vào
tháng 3 rong chưa trưởng thành nhưng có sinh lượng mọc tại chỗ cao nhất vì
vào tháng 4 trở đi cây rong trưởng thành, kích thước khá lớn, có nhiều phao
Polysacaride
Alginic: Alginic là một polysacaride tập trung ở giữa vách tế bào, là
thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài tế bào của rong Nâu.
Hàm lượng alginic trong rong Nâu khoảng 2 ÷ 4 % so với rong tươi và
13 ÷ 15 % so với rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí
địa lý môi trường mà rong sinh sống. Hàm lượng alginic trong rong Nâu ở các
tỉnh miền Trung Việt Nam thường cao nhất vào tháng 4 trong năm.
Fucoidin: là loại muối giữa axit fucoidinic với các kim loại hóa trị khác
nhau như: Ca, Cu, Zn. Fucoidin có tính chất gần giống alginic nhưng hàm
lượng thấp hơn alginic.
Laminarin: laminarin là tinh bột của rong Nâu. Laminarin có hàm lượng
từ 10 ÷ 15 % trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và
môi trường sinh sống của từng loại rong Nâu. Thường thì mùa hè hàm lượng
laminarin giảm vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và phải tiêu hao cho
quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong.
Cellulose: là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng cellulose trong
rong Nâu nhiều hơn rong Đỏ.
Protein
Protein trong rong Nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo. Do vậy rong
Nâu có thể sử dụng làm thực phẩm. Hàm lượng protein vùng biển Nha Trang
dao động từ 8,05 ÷ 21,11 % so với trọng lượng rong khô. Hàm lượng axit
amin cũng đáng kể và có giá trị cao trong protein của rong biển.
Chất khoáng
Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong Nâu thường lớn hơn trong
nước biển. Chẳng hạn Iod trong rong Nâu thường lớn hơn trong nước biển từ
80 ÷ 90 lần. Hàm lượng Barium lớn hơn trong nước biển gần 1800 lần. 12
13
sẽ bị sóng nhổ tấp vào bờ và tàn lụi. Đến tháng 7 các bãi rong đều trơ trụi.
Một số loài như S. mcclurei, S. kjellmanianum, S. polycystum phát triển và tàn
lụi sớm (tháng 4). Trong khi đó các loài ở vùng dưới triều như S. binderi, S.
microcystum… mọc chậm hơn, đến tháng 6, 7 đôi nơi vẫn còn quần thể rong
này. Một vài loài rong thích nghi trong các vũng, vịnh yên sóng có thể tồn tại
và phát triển tốt vào tháng 7 như S. polycystum và S. longicaulis. [4]
Trong đồ án này, tôi đã thu nhận năm loài rong Nâu trong địa bàn tỉnh
Khánh Hòa là: S. microcystum, S. binderi, S. mcclurei, S. polycystum, S.
serratum để tiến hành bố trí thí nghiệm thực hiện các nội dung của đồ án.
1.2.3.1. S. mcclurei
Rong dài 1 – 2 m, có khi dài đến 4 m hay hơn khi mọc ở sâu. Đĩa bám
rộng khoảng 1 cm, thường mọc liên kết 2 – 3 đĩa bám chung. Đĩa bám có xẻ
thùy nhưng không sâu. Trục chính hình trụ ngắn hơn 1 cm. Nhánh chính
nhiều 3 – 5, hình trụ, không gai, to 1.5 – 2 mm, các nhánh bên mọc cách 3 – 7
cm, dài 20 cm. Lá hơi dày và dai chắc, có hình bầu dục kéo dài, dài 1 – 3 cm,
mép có răng cưa nhọn, đôi khi lá dày lên, mép có hai hàng răng hay có mâm
nhỏ khi chúng mọc nơi sóng mạnh. Gân giữa không rõ, ổ long rãi rác, cuống
lá ngắn. Phao nhiều, hình xoan hay hơi kéo dài, to 2 – 5 mm, thường nằm
trong một lá nhỏ hình dạng rất biến thiên. Khi rong còn non hay ở phần gốc,
phao có cánh bao quanh hình dạng giống như lá. Ở các nhánh thụ cánh này
nhỏ hơn hay có khi là mũi dài ở cuối phao.
Rong là cây khác gốc, cây đực và cây cái riêng. Đế cái hình ba cạnh, có
gai mọc thành chùm 2 – 3 không chia nhánh. Đế đực hình trụ có u, không gai.
Ở các nhánh thụ phao rất nhiều, trà trộn với các chùm đế.
S. mcclurei thích nghi với các dạng vật bám, và điều kiện môi trường
khác nhau. Chúng có thể mọc lên cao đến vùng triều thấp hay xuống sâu đến
4 – 5 m hay hơn tùy điều kiện môi trường và vật bám, nhưng thường bị giới
bị nhổ khỏi vật bám, chúng thường chìm, không nổi lên. Mùa vụ của rong trễ
hơn so với các loài rong khác, trưởng thành khoảng tháng 5 đến tháng 6. [1]
1.2.3.3. S. microcystum (Rong Mơ phao nhỏ)
Rong dài 0.5 – 1 m, đĩa bám nhỏ, hình nón, to cỡ 1 cm, dễ bị nhổ. Trục
chính rất ngắn, mang 3 – 5 nhánh chính hình trụ, có cạnh, phần gốc hơi dẹp.
Các nhánh bên dày và rậm rạp, mọc cách nhau 1 – 3 cm. Trên ngọn các nhánh 16
này mọc thưa hơn. Lá cứng nhưng không dai, cuống ngắn, chót lá không
nhọn, răng cưa nhỏ, không sâu. Lá dài 2 – 4 cm, rộng 0.4 – 1 cm, gân giữa
thấy được, mờ dần về phía đỉnh, ổ lông nhiều, nhỏ, rải rác. Các lá ở phần trên
hẹp và ngắn. phao nhiều, nhỏ 1 – 2 mm, hình cầu hay hơi xoan, không cánh
nhưng đôi khi có vài gai nhỏ, cọng phao mịn và ngắn. Khi rong trưởng thành
nhiều nhánh phụ chỉ mang toàn phao và đế. Đế dẹp hay hình 3 cạnh, ngắn 2 –
3 mm, mọc thành chùm 2 – 3, có gai, nhất là ở chót đế. Đế đực hình trụ,
không gai.
Hình1.6. Hình dạng rong S. microcystum
Rong mọc ở đai dưới quần xã rong Mơ nơi sóng mạnh, sâu hơn 2 m,
trưởng thành vào tháng 4. [1] 17
1.2.3.4. S. polycystum (Rong Mơ nhiều phao)
Rong mọc thành bụi to có khi dài 2 m. Đĩa bám hình nón to cỡ 1 cm, có
các rễ bò phân nhánh, phát triển nhiều. Trục chính hình trụ dài 0.5 – 1 cm,
mang theo 3 – 5 nhánh chính hình trụ to 1 – 2 mm có nhiều gai nhỏ, đơn hay
19
đực có đế đực hình trụ, có u, phân nhánh, dài 0.5 - 2 cm. Cây cái có đế ngắn
hơn 3 - 5 mm, hình trụ dẹp, phân nhánh, có gai.
Rong mọc thành quần thể dày, trên đá tảng và trên san hô chết từ vùng
triều thấp trở xuống, là loài phân bố cao nhất trong các quần thể rong mơ ở
các bãi triều đáy cứng. Rong trưởng thành rất sớm từ tháng 3 - 4. Khoảng
giữa tháng 8 đã thấy xuất hiện cây con. [2]
1.3. CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH RONG BIỂN
1.3.1. Giới thiệu công nghệ sau thu hoạch rong biển
Hình 1.9. Sơ đồ công nghệ sau thu hoạch rong biển của Việt Nam
Bảo quản
Thu hái
Rửa lần 1
Làm khô sở bộ (W = 30-40%)
Loại tạp chất
Phơi khô
Rong biển
Rửa lần 2
Vận chuyển
Nước ngọt
Nước biển
Độ dày: < 3cm
Phơi trên giàn
W = 22%
Copyright: Tài liệu đại học ©