BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ MINH TÙY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN TỪ
MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN
TẠI KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành : Công nghệ sau thu hoạch
Mã số : 60.54.01.04
Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Ngọc Bội
TS. Nguyễn Duy Nhứt Nha Trang - 2013
i LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.

Tác giả luận văn Nguyễn Thị Minh Tùy


DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG NÂU 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học 3
1.1.2. Phân bố và trữ lượng rong nâu 4
1.1.3. Thành phần hóa học của rong nâu 6
1.2. CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH RONG BIỂN 9
1.2.1. Giới thiệu công nghệ sau thu hoạch rong biển 9
1.2.2. Một số hiện tượng hư hỏng của rong 11
1.2.3. Các biện pháp bảo quản rong khô 11
1.3. FUCOIDAN 12
1.3.1. Khái niệm về fucoidan 12
1.3.2. Đặc điểm, cấu trúc và các tính chất của fucoidan 13
1.3.3. Công dụng sinh học của fucoidan 15
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI 24
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN Ở VIỆT NAM 27
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học 31
2.2.2. Phương pháp tách chiết fucoidan 31
2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu 35
iv

2.3. DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT CHỦ YẾU 47
2.3.1. Dụng cụ và thiết bị 47
2.3.2. Hóa chất 47
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 48

Da : Dalton
DNA : Acid Deoxyribo Nucleic
ESI-MS : Electrospray Ionisation – Mass Spectroscopy
EtOH : cồn
F20 : Phân đoạn fucoidan thứ 20.
FDA : Food and Drug Administration
GC : Gas Chromatography
Gr (+) : Gram dương
Gr (-) : Gram âm
HGF : Hepatocyte Growth Factor
HIV : Human Immunodeficiency Virus
IR : Infrared spectroscopy
KH&CN : Khoa Học Và Công Nghệ
L.B.Nga : Liên Ban Nga
MWCO : Moleculare Weight Cut Off
NK : Natural Killer
NMR : Nuclear Magnetic Resonance
S. : Sargassum
TCN : Tiêu Chuẩn Ngành
TCVN : Tiêu Chuẩn Việt Nam
Tế bào B : Lympho bào B
TFA : Trifluoroacetic
TLPT : Trọng Lượng Phân Tử
TMS : Tetrametylsilan
WHO : World Health Organization

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các giống loài rong nâu tìm thấy và phân bố [3] 4

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh rong nâu 3
Hình 1.2. Hình ảnh về rong S. mcclurei 8
Hình 1.3. Hình ảnh về rong S.polycystum 8
Hình 1.4. Hình ảnh về rong S.olygocystum 9
Hình 1.5. Qui trình công nghệ sau thu hoạch rong biển ở Việt Nam 10
Hình 1.6. Cấu trúc fucoidan từ Fucus vesiculosus mô tả vào năm 1950 [47] 13
Hình 1.7. Cấu trúc từ Fucus anescens [43] 14
Hình 1.8. Cấu trúc fucoidan từ Fucus distichus L [42] 14
Hình 1.9. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus [41] 14
Hình 1.10. Cấu trúc fucoidan từ Ascophyllum nodosum [44] 15
Hình 1.11. Hình ảnh rong nâu và các sản phẩm fucoidan 15
Hình 1.12. Hình ảnh về công thức cấu trúc của fucoidan trong kết quả đo ESI-MS ion
dương của một đoạn trong phân đoạn fucoidan F20 từ rong S. swartzzii 29
Hình 2.1. Qui trình chiết fucoidan của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng 32
Hình 2.2. Qui trình chiết fucoidan theo bản quyền EP0645143A1 34
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết fucoidan theo 3 qui trình 38
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sản xuất thử và đánh giá hiệu quả thu fucoidan so
với qui trình hiện hành 47
Hình 3.1. Sắc ký đồ GC của hexaacetat glucitol và sắc ký đồ GC của các đường chuẩn 51
Hình 3.2. Sắc ký đồ của các sản phẩm thủy phân fucoidan của S.mcclurei và
S.polycystum 51
Hình 3.3. Sắc ký đồ của các sản phẩm thủy phân rong nâu S.mcclurei, S.polycystum 52
Hình 3.4. Sự biến đổi hàm lượng fucoidan thu nhận từ các mẫu rong nâu S.mcclurei,
S.polycystum, S.oligocystum khi tách chiết và tinh chế theo PP3 55
Hình 3.5. Sự thay đổi tỷ lệ fucoidan tinh khiết trong các mẫu sản phẩm fucoidan thô thu
nhận từ rong nâu S. polycystum tách chiết theo 3 qui trình khác nhau 57
Hình 3.6. Hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết từ rong nâu S.polycystum khi tách chiết

MỞ ĐẦU

Việt Nam có trữ lượng rong nâu tự nhiên khá lớn vào khoảng 10.000 tấn
khô/năm, với hơn 120 loài. Rong nâu là loài rong biển có chứa nhiều hợp chất có hoạt
tính sinh học. Trong đó, có một số hoạt chất sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng
trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm và các sản phẩm chức năng [27].
Fucoidan là một polysacarit sulfat được tách chiết từ rong nâu, có cấu tạo gồm
mạch chính chứa -L-fucose sulfat. Ngoài ra trong cấu tạo của fucoidan có thể có D-
galactose, D-mannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose, D-uronic axít cũng như có
thể có phân bố ngẫu nhiên của các gốc acetyl [42]. Fucoidan có hoạt tính chống đông
máu, kháng khuẩn, kháng virus, chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư, chống viêm
khớp, chống viêm nhiễm, giảm mỡ máu, hạ cholesterol, ức chế miễn dịch có thể sử
dụng cho ghép phủ tạng… [14].
Fucoidan trong rong nâu chiếm hàm lượng rất lớn vào khoảng 4-8% trọng
lượng khô. Do vậy trong những năm gần đây fucoidan được các nhà khoa học trên thế
giới quan tâm đầu tư nghiên cứu ứng dụng trong phòng và hỗ trợ chữa trị các chứng
bệnh nan y cũng như trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Do vậy, sản xuất
fucoidan đã phát triển rất mạnh ở nhiều nước như Nga, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn
Quốc…[17]
Những năm gần đây các nhà khoa học Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu về
fucoidan từ rong nâu. Viện Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã có chương trình
nghiên cứu khoa học trọng điểm quốc gia về lĩnh vực Hóa dược trong đó có chương
trình nghiên cứu về fucoidan và giao cho Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ
Nha Trang chủ trì việc nghiên cứu này. Năm 2010, Viện Khoa học và Công nghệ
Quốc gia Việt Nam đã giao cho TS. Nguyễn Duy Nhứt triển khai thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư từ rong
nâu Việt Nam”. Sau đó Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Khánh Hòa cũng giao TS.
Nguyễn Duy Nhứt thực hiện đề tài: “Nghiên cứu qui trình sản xuất fucoidan khối
lượng phân tử thấp ứng dụng trong hỗ trợ điều trị rối loạn chuyển hóa lipid máu”.
Được sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và Trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đề


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG NÂU
1.1.1. Đặc điểm sinh học
Rong nâu là một trong các loài rong biển sinh sống ở biển là chủ yếu. Rong nâu
có nhiều loài, có độ đậm nhạt của màu nâu khác nhau do sự khác nhau về các thành
phần sắc tố trong cấu tạo. Cây rong tùy vào từng loại mà có độ dài khác nhau nhưng
đều là loài rong to, mọc thành bụi, có nhánh mang phiến có dạng lá, phiến có răng
mịn. Hầu như các loài rong nâu đều có phao, tuy nhiên số lượng và kích thước của các
phao khác nhau. Phao có dạng hình cầu hay trái xoan, đường kính của phao nhỏ
khoảng 0,5-0,8 mm, phao lớn khoảng 5-10 mm.

Hình 1.1. Hình ảnh rong nâu
Điều kiện sinh trưởng và phát triển của rong nâu
Rong nâu là loài mọc ở những vùng biển ấm nóng, trên nền đá vôi, san hô chết,
nơi sóng mạnh và nước trong, nhất là các ven đảo. Chúng mọc trên tất cả các loài vật
bám cứng, trên vách đá dốc cứng, trên các bãi đá tảng. Trên các bờ dốc đứng, chúng
phân bố thành các đai hẹp ở các mức thủy triều thấp đến sâu khoảng 0,5 m. Đa số
chúng thích mọc ở những nơi sóng mạnh, ở các đảo, bờ phía đông chúng mọc dày hơn
bờ phía tây. Ở các bãi đá hướng ra biển khơi chúng phát triển mạnh và sinh lượng

rong mới tìm thấy ở VN)
-

4 Sargassum siliquosum
-

5 Padina australis
- -

6 Sargassum crassifolium

7
Sargassum patensvar. Vietnamese
Dai

-

8 Sargassum quinhonense Dai

-

9 Sargassum polycystum

- -
10 Sargassum kjellmanianum

- -
11 Sargassum microcystum

-


Hầu hết các loài rong nâu sinh trưởng và phát triển ở dạng sống bám, thích hợp
với điều kiện sinh thái môi trường có độ mặn cao, nước trong và có sóng. Vì vậy rong
nâu phân bố phổ biến ở các bãi triều đáy cứng (đá tảng, đá, san hô chết, các rạn
ngầm…) ven biển và các đảo. Do đặc điểm của địa hình có nhiều núi ở ven biển hoặc
lấn ra sát biển, tạo thành nhiều mũi và bãi triều đáy đá cứng và có nhiều rạn san hô
chết kéo dài, độ muối ổn định và cao quanh năm, các dòng sông ngắn và có nhiều đảo,
nên vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao
Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù
Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Văn Phong,
Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh
Phước) có nhiều rong nâu. Vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa - Vũng Tàu, ven
biển có nhiều bãi triều đáy cát, chỉ có một ít mũi bãi triều đáy đá ở mũi Né, Long
Hương (Bình Thuận), Long Hải, Vũng Tàu (Bà Rịa - Vũng Tàu) nên không có nhiều
rong nâu.
Theo dõi bảng trên chúng ta thấy rong nâu phân bố tại vùng biển Quảng Nam
Đà Nẵng không nhiều so với vùng biển Khánh Hòa và Ninh Thuận. Quảng Nam Đà
Nẵng tuy có nhiều triền đá dốc, bãi đá cội, bãi san hô chết, nhưng có chiều ngang rất
hẹp nên diện tích phân bố rất nhỏ, trữ lượng không cao.
Vùng biển Khánh Hòa là vùng biển có diện tích rong mơ mọc cao nhất trong
các tỉnh điều tra, tổng diện tích có rong lên tới 2.000.000 m
2
, trữ lượng có thể khai
thác được hàng năm có thể ước tính hơn 11.000 tấn rong tươi. Khánh Hòa có nhiều
vùng rong như Hòn Chồng, Bãi Tiên, bán đảo Cam Ranh, Hòn Tre và một số đảo khác.
Trong đó vùng biển Hòn Chồng và Bãi Tiên là hai vùng tiếp giáp nhau có các
điều kiện thuận lợi cho rong mọc với mật độ khá dày đặc, sinh lượng trung bình khá
cao lên tới 5,5 kg/m
2
. Vùng Hòn Chồng, Bãi Tiên là vùng rong lớn, dễ khai thác nhất,

chủ yếu tạo nên tầng phía ngoài của màng tế bào rong nâu. Hàm lượng alginic trong
các loại rong nâu khoảng 2 – 4% so với rong tươi và 13 – 15% so với rong khô. Hàm
lượng này tùy thuộc vào từng loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống,
trong đó hàm lượng này của các loài rong ở vùng biển miền Trung Việt Nam là cao
hơn cả, dao động từ 12,3 – 35,9%.
o Fucoidan: Fucoidan là một polysaccharide sulfat được tách chiết từ rong
nâu, có cấu tạo gồm mạch chính có mặt -L-fucose sulfat, ngoài ra có thể có D-
galactose, D-mannose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose, D-uronic axít và có thể có
phân bố ngẫu nhiên của các gốc acetyl [42]. Fucoidan có hoạt tính chống đông cục
máu, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, chống ung thư,
chống viêm khớp, chống viêm nhiễm, giảm mỡ máu, hạ cholesterol, ức chế miễn dịch
có thể sử dụng cho ghép phủ tạng…

7

o Laminaran: là tinh bột của rong nâu. Laminaran thường ở dạng bột không
màu, không mùi và có hai loại là loại hòa tan trong nước và loại không hòa tan trong
nước. Laminaran có hàm lượng từ 10 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại
rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong nâu. Thường thì vào mùa hè hàm
lượng laminaran giảm do phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong.
o Cellulose : là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng này của rong nâu
nhiều hơn so với rong đỏ.
Protein
Protein của rong nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo, do vậy rong nâu có
thể sử dụng làm thực phẩm, hàm lượng protein của rong tại vùng biển Nha Trang từ
8,05 đến 21,11% so với trọng lượng rong khô.
Chất khoáng
Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong nâu thường lớn hơn nước biển.
Hàm lượng khoáng của loài rong nâu tại vùng biển Nha Trang dao động từ 15,51 đến
46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng.

hình cầu to 2 mm, phao luôn luôn có cánh nhỏ, cánh này nhiều khi chỉ là một mũi nhỏ
ở đầu hay nhiều gai nhỏ.

Hình 1.3. Hình ảnh về rong S.polycystum
Đây là loài rong gặp phổ biến khắp nơi, thích nghi rộng ngoại trừ những nơi có
sóng mạnh, chúng có khả năng mọc gần cửa sông. Chúng bao phủ các vùng san hô
chết từ phía trên mực thủy triều cho đến nhiều mét sâu hơn. Các cá thể ở vùng trên

9

thường bị bày khô nhiều giờ khi triều xuống. Rong trưởng thành phóng thích giao tử
vào tháng 4. Vào lúc phần lớn các loài rong biển hay rong mơ khác tàn lụi (tháng 9,
10), ta vẫn gặp các quần thể S.polycystum. Nhờ hệ thống rễ bò phát triển, chúng có thể
sinh sản sinh dưỡng. Các rễ này như những nhánh có mang các lá nhỏ, ở các nách lá
này sẽ nảy chồi cho ra cây mầm và đĩa bám, bám vào vật bám cho ra cây mới. [1]
+ Rong mơ S.olygocystum montagne
Rong cao 1,5 – 2 m, mọc thành đám lớn trên đá ở sâu - vùng dưới triều (sâu 2 –
4 m hay hơn). Mùa trưởng thành tương đối muộn từ tháng 5 - 6. Loài này có nhiều ở
ven biển Khánh Hòa và Ninh Thuận, góp phần đáng kể trong nguồn lợi rong mơ.

Hình 1.4. Hình ảnh về rong S.olygocystum
1.2. CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH RONG BIỂN
1.2.1. Giới thiệu công nghệ sau thu hoạch rong biển

10
Hình 1.5. Qui trình công nghệ sau thu hoạch rong biển ở Việt Nam
Các bước tiến hành

khoảng 30%, có khi lên đến 40%. Rong vẫn hô hấp tế bào, sinh nhiệt phá hủy các chất
hữu cơ làm hỏng rong.
 Rong đưa về Viện nghiên cứu thường chưa được chế biến ngay mà cần bảo
quản, dự trữ trong kho một thời gian nào đó.
Ngâm rửa nước ngọt: rong được rửa nhiều lần (4 - 5 lần) trong thùng nước.
 Phơi khô
Rong cần phơi trên các nong tre hoặc các giàn phơi cách mặt đất 0,5 ÷ 0,8 m,
độ dày lớp rong nhỏ hơn 3 cm, sau 2 ÷ 3 ngày rong khô. Độ ẩm đạt ≤ 25%.
Hiệu suất sơ chế lần hai đạt 40 ÷ 60% rong sơ chế lần 1 (tùy thuộc vào từng loại
và độ nhiễm bẩn của rong).
Tiêu chuẩn rong thành phẩm: rong khô W ≤ 25%, sạch bùn đất tạp chất, thân
cây cứng, dai, màu vàng, nâu, đen. Nắm trong tay không thấy có độ ẩm của muối, hàm
lượng muối ≤ 0,8%. Sau khi phơi cần để rong trong mát để cân bằng độ ẩm, sau đó
mới bảo quản [3].
1.2.2. Một số hiện tượng hư hỏng của rong
Trạng thái cây rong bị thay đổi: rong mủn. Rong mủn là do sơ chế nước ngọt
không đúng kĩ thuật, hàm lượng muối còn nhiều. Các loại vi sinh vật như
Cellulomonas, Aspegillus, Streptococcus, Psedomonas và Penicilium hoạt động mạnh
phân hủy cellulose và các chất keo rong [3].
Rong hao hụt trọng lượng do độ ẩm cao.
Rong hư cục bộ: do trải rong xuống sàn nhà mà không tản nhiệt, xuất hiện sự tự
phát nhiệt làm nấm mốc phát triển.
1.2.3. Các biện pháp bảo quản rong khô
Rong phải thông thoáng, lưu thông không khí. Không khí trong kho có độ ẩm ≤
80%. Ngày khô ráo phải mở cửa kho để giảm độ ẩm của kho.
Các kiện rong được để trên các giàn cách mặt đất 15 ÷ 20 cm. Giữa các giàn có
lối đi lại để thường xuyên kiểm tra.
Phát hiện rong ẩm phải đưa đi chế biến ngay. Khi rong mốc phải loại bỏ phần
mốc, rửa, sấy lại.


tồn tại đến 40 năm sau [21]. Một số nghiên cứu gần đây cho các dạng khác của
fucoidan đã được công bố, nói chung các cấu trúc đó bao gồm mạch chính có L-fucose
liên kết ở các vị trí 12, 13, 14, và nhóm sulfat ở các vị trí C-2, C-3, C-4, thay
đổi theo các loài khác nhau. Với các fucan sulfat ở động vật nhuyễn thể, cấu trúc cũng

13

được tiếp tục nghiên cứu vào năm 1987 (Mourao và Basto), 1994 (Ribeiro et al), 1997
(Alves et al), 1999, 2002 (Vilela-Silva et al). Đặc điểm phân biệt các cấu trúc của
fucoidan và fucan sulfat từ động vật là fucan sulfat có dạng mạch thẳng được tạo thành
do những đơn vị cấu trúc lặp đi lặp lại, có thể được xác định chính xác bởi phổ cộng
hưởng từ hạt nhân, và quan hệ hoạt tính cấu trúc có thể được thành lập. Fucoidan của
rong biển có thể là mạch nhánh, trong phân tử có thể có sự hiện diện của một số các
gốc đường khác nhau và có thể có các gốc acetyl cũng như sulfat phân bố không theo
một qui luật nào [24]. Kết quả của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cũng chỉ cho
biết một phần thông tin về cấu trúc của chúng mà thôi. V́ vậy, cho đến nay việc mô tả
hoàn chỉnh cấu trúc của fucoidan rong biển là việc vô cùng khó khăn.
Sau gần 100 năm kể từ khi được Kyllin phát hiện ra (1913), cấu trúc của
fucoidan chỉ được mô tả trong từng trường hợp tách chiết riêng biệt của từng loài rong
khác nhau và chỉ là cấu trúc cho những đoạn mạch rất ngắn, nhiều nghiên cứu khác
nhau đưa ra những cấu trúc khác nhau trên cùng một loài rong.
1.3.2. Đặc điểm, cấu trúc và các tính chất của fucoidan
Fucoidan là một polysaccharide sulfat được tách chiết từ rong nâu, có cấu tạo
gồm mạch chính có mặt -L-Fucose sulfat, ngoài ra có thể có D-Galactose, D-
Mannose, D-Xylose, L-Rhamnose, D-Glucose, D-Uronic axít và có thể có phân bố
ngẫu nhiên của các gốc acetyl [42]. Fucoidan trong rong nâu chiếm hàm lượng rất lớn
khoảng 4 - 8% trọng lượng khô.
Cấu trúc đầu tiên của fucoidan
Năm 1937 Lunde, Heen và Oy phát hiện được fucoidin kết tủa trong alcohol và
họ xác định được công thức phân tử của fucoidin là: (R.R1.O.SO2.OM)n.

-14 Hình 1.7. Cấu trúc từ Fucus anescens [43]

Hình 1.8. Cấu trúc fucoidan từ Fucus distichus L [42] Hình 1.9. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus [41]

,4R
2
)-(1

4)-

-L-fucp(2SO
3
-
)-(1


(a) (~50%): R
1
= SO
3
-
, R
2
= H
(b) (~50%): R
1
= H, R
2
= -L-fucp-(14)--L-fucp(2SO
3
-
)-(13)-L-fucp(2SO
3
-