BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY
ĐỂ ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH
TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP

Chuyên ngành: Huyết học
Mã số: 62.72.25.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Tấn Bỉnh
2. PGS. Bửu Mật
TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN



4

1.1. Lòch sử
1.2. Giới thiệu kỹ thuật tế bào dòng chảy và dấu ấn miễn dòch
tế bào (DAMDTB)
1.3. Chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh bạch cầu cấp bằng
DAMDTB
1.4. Đánh giá tồn lưu ác tính trong bệnh lý bạch cầu cấp bằng
DAMDTB
1.5. Những vấn đề ảnh hưởng đến chẩn đoán TBTLAT bằng kỹ
thuật DAMDTB
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4
7

11

21

36
42

2.1. Đối tượng nghiên cứu

42

2.2. Phương pháp nghiên cứu


3.6. Bạch cầu cấp “biphenotype”

85

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

87

4.1. Đặc điểm chung lúc mới chẩn đoán

87

4.2. Khảo sát sự xuất hiện các kiểu hình DAMD bất thường

90

4.3. Bạch cầu cấp dòng lympho B

98

4.4. Bạch cầu cấp dòng tủy

108

4.5. Bạch cầu cấp dòng lympho T

118

4.6 Bạch cầu cấp “biphenotype”


AML – M0

AML minimally differentiated leukemia

AML – M1

AML without maturation

AML – M2

AML with maturation

AML – M3

Acute promyelocyte leukemia

AML – M4

Acute myelomonocytic leukemia

AML – M5

Acute monoblastic/monocytic leukemia

AML – M6

Acute erythroblast leukemia

AML – M7



Cluster differetiation

Cy

Cytoplasm (thuộc tế bào chất)

DAMDTB

Dấu ấn miễn dòch tế bào

EGIL

European Group for the Immunological Characterization of
Leukemia


iv

FAB

French – American – Bristish

FISH

Fluorescent in situ hybridization

FITC

Fluorescein Isothiocyanate


Phycoerythrin-cyanine 7

Per CP

Peridin chlorophyl

SJCRH

St.Jude Children’s Reaseach Hospital

Sm

Surface membrane (trên bề mặt màng tế bào)

SSC

Sideward scatter (tia phát tán bên)

T-ALL

T Acute lymphoblastic leukemia (Bạch cầu cấp dòng lympho
dòng lympho T)

TLTBAT

Tồn lưu tế bào ác tính

TCR



Bảng tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán bệnh

10

bạch cầu và lymphoma
1.2

Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho B dựa vào DAMD

13

1.3

Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho T dựa vào DAMD

15

1.4

Tiêu chuẩn chẩn đoán BCC dòng tủy dựa vào DAMD

19

1.5

Thang điểm EGIL để xác đònh BCC “biphenotype”.

20



3.1

Phân bố các nhóm bệnh theo tuổi (ở giai đoạn 1)

55

3.2

Đặc điểm sinh học của quần thể nghiên cứu (GĐ.1)

56

3.3

So sánh kết quả phân biệt dòng giữa DAMD và tủy đồ (GĐ.1).

57

3.4

Đối chiếu phân dưới nhóm BCC dòng tủy DAMD và tủy đồ

58

(GĐ.1)

Bảng

Nội dung


3.9

Tần suất các phương thức đánh giá kiểu hình bất thường (GĐ.2)

63

3.10

Mức độ TLTBAT sau hóa trò tấn công

63

3.11

Mật độ dương tính của các dấu ấn non trong bệnh BCC dòng

67

lympho B
3.12

Mật độ dương tính của các dấu ấn dòng B trong bệnh BCC dòng

67

lympho B
3.13

Tần suất các phương thức đánh giá trên BCC dòng lympho B


72

lympho B sau hóa trò
3.18

So sánh các phương thức đánh giá TBTLAT trước và sau hóa trò

73

BCC dòng lympho B
3.19
Bảng

Mật độ dương tính các dấu ấn non trên tế bào blast dòng tủy
Nội dung

75
Trang


vii

3.20

Mật độ dương tính của các dấu ấn đặc trưng dòng tủy

76

3.21

lympho T
3.26

Phân bố mật độ dương tính của các dấu ấn đặc trưng dòng

81

lympho T
3.27

Kết quả khảo sát bộ đôi CD4/CD8 trên tế bào blast dòng lympho

82

T
3.28

Sự hiện diện KN khác dòng trên BCC dòng lympho T

84

3.29

Các mức độ TBTLAT trên nhóm BCC dòng T sau hóa trò

84

3.30

So sánh các chiến lược đánh giá TBTLAT trước và sau hóa trò

1.3

Minh họa ý nghóa hai thông số FSC và SSC.

7

1.4

Vò trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ SSC-

11

CD45.
1.5

Sơ đồ phát triển DAMD bình thường của tế bào dòng

12

lympho B bình thường trong tủy xương.
1.6

Sơ đồ phát triển DAMD bình thường của dòng lympho T.

14

1.7

Sơ đồ phát triển DAMD của tế bào dòng hạt bình thường.



Mô tả một số kiểu phân tích “vùng trống” trên bệnh nhân TALL.

29


ix

Hình

Nội dung

Trang

1.13

Minh họa quá trình theo dõi TBTLAT liên tục bằng

32

CD117/CD15 hoặc CD34/CD7 từ mẫu tủy xương của hai
bệnh nhân.
1.14

Theo dõi tái phát một trường hợp BCC dòng lympho B thông

37

qua phức hợp CD10-TdT.
3.1

105

4.3

Sơ đồ mô tả mật độ các dấu ấn dòng hạt trên tế bào hạt.

116

Danh mục các biểu đồ

Biểu đồ

Nội dung

Trang

1.1

So sánh tỉ lệ tái phát giữa 4 mức độ nguy cơ trên bệnh BCC

35

dòng tủy.
1.2

So sánh tỉ lệ sống toàn bộ theo mức độ tồn lưu trên bệnh
BCC dòng tủy.

35


Phân loại dưới nhóm bệnh nhân BCC dòng lympho B.

66

3.5

Những KN khác dòng trên bệnh BCC dòng lympho B.

69

3.6

Phân loại dưới nhóm của bệnh nhân BCC dòng tủy.

74

3.7

Phân bố MPO trong tế bào blast BCC dòng tủy.

75

3.8

Những KN khác dòng trên BCC dòng tủy.

77

3.9



3.1

Mô tả qui trình thu thập mẫu.

54

3.2

Các thành phần tế bào khác nhau trên cùng một quần thể

61

blast (sau hóa trò)


xi


1

UẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay trên thế giới, việc nhận diện các dấu ấn miễn dòch tế bào trên tế
bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy, hay còn được gọi là kỹ thuật dấu ấn miễn
dòch tế bào (DAMDTB) đã trở thành xét nghiệm thường qui nhằm hỗ trợ xác đònh
chính xác dòng tế bào ác tính và phân loại dưới nhóm của bệnh bạch cầu cấp
(BCC), góp phần đònh hướng điều trò và tiên lượng bệnh trước điều trò.
Bệnh BCC thường được đánh giá lui bệnh khi quần thể tế bào non dưới 5%
tế bào bạch cầu (BC) trong tuỷ xương (là giới hạn thấp nhất để phát hiện bằng
hình thái học tế bào). Tuy nhiên, bệnh nhân BCC có khoảng 1012 tế bào BC ác

chưa có số liệu báo cáo về tỉ lệ TLTBAT sau hóa trò ở bệnh BCC bằng kỹ thuật
tế bào dòng chảy tại Việt nam.
Tại bệnh viện TMHH (TP.HCM), chúng tôi bắt đầu áp dụng kỹ thuật xác
đònh DAMDTB trong chẩn đoán và phân loại bệnh BCC vào năm 1995. Từ năm
2005, chúng tôi sử dụng kỹ thuật này thường qui với bộ kháng thể đơn dòng 19
dấu ấn kết hợp với kiểu nhuộm 3 màu nhằm phát hiện các kháng nguyên trên
màng tế bào.
Hiện tại, với nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn triển khai kỹ thuật
nhuộm 4-5 màu và bổ sung bước làm tăng tính thấm màng tế bào để phát hiện
các kháng nguyên (KN) đặc trưng của từng dòng nằm trong bào tương hoặc trong
nhân, giúp hiểu rõ hơn về sự hiện diện của các DAMDTB trong bệnh BCC, góp
phần làm tăng độ chính xác trong chẩn đoán. Từ đó, tiến tới chọn lựa và xác đònh


3

những kiểu hình DAMDTB bất thường thích hợp nhằm mục đích theo dõi
TLTBAT sau điều trò.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát
như sau: “Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác đònh DAMDTB trong chẩn
đoán, phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương thức và kiểu hình
DAMDTB phù hợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có
tại bệnh viện TMHH”.
Để đạt được kết quả trên cần phải thực hiện các mục tiêu sau:
1. Xác đònh tỉ lệ các phân nhóm bệnh BCC bằng DAMDTB.
2. Xác đònh tỉ lệ các kiểu hình DAMDTB bất thường để đánh giá
TLTBAT.
3. Xác đònh tỉ lệ TLTBAT trong các bệnh BCC sau điều trò tấn công.



5

hiểu biết sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường của tế bào tạo máu, làm nền
tảng vững chắc cho việc chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh bạch cầu cấp
(như BCC dòng lympho B, dòng lympho T, dòng tủy,…) đặc biệt là những trường
hợp không biệt hóa, kém biệt hóa, hỗn hợp nhiều dòng. Bên cạnh đó còn giúp
chẩn đoán phân biệt với nhiều bệnh lý khác: tăng sinh bạch cầu mạn tính,
lymphoma, đa u tủy,…
Suốt 3 thập kỷ qua, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã phát triển không ngừng
với nhiều ứng dụng khác nhau phục vụ cho nhiều chuyên khoa, mà đặc biệt là
huyết học và ung thư học. Đánh giá TLTBAT bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy là
một trong những kỹ thuật đang được các chuyên gia ung thư học quan tâm nghiên
cứu để giúp tiên lượng sớm và chính xác hơn khả năng tái phát bệnh. Có nhiều cơ
sở lý thuyết để đánh giá TLTBAT như: xác đònh dấu ấn miễn dòch bất thường,
phân tích chất lượng DNA, đánh giá khả năng tế bào tự chết,… Nhưng kỹ thuật
xác đònh kiểu hình DAMDTB bất thường là phương pháp đang được nhiều nơi
trên thế giới ứng dụng rộng rãi.
 Trong nước
Từ những năm 1992, các chuyên gia Việt nam đã biết đến kỹ thuật tế bào
dòng chảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dòch huỳnh quang
bằng kính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác đònh
dòng tủy tại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện Nhi Trung
ương,… Năm 1995, bệnh viện Truyền máu Huyết học (TP.HCM) là bệnh viện
đầu tiên được trang bò máy FASC Calibur (3 màu) để phân biệt các dòng tế bào
tạo máu khác nhau trong bệnh lý BCC và thực hiện đếm tế bào CD4 cho bệnh
nhân HIV. Những năm sau đó, nhiều trung tâm nghiên cứu trong cả nước đã quan
tâm đầu tư máy móc thiết bò mở rộng các lãnh vực nghiên cứu. Viện các bệnh


6


1.2.1. Sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể - chất phát huỳnh quang
Hình 1.1: Sơ đồ hóa mối
liên kết kháng nguyên kháng thể - chất huỳnh
quang.

(Nguồn:

Tác

giả

Nguyễn Phương Liên)

Kỹ thuật tế bào dòng chảy nhận diện DAMDTB, là các kháng nguyên của
tế bào, gián tiếp thông qua mật độ các chất huỳnh quang gắn với các kháng thể
đặc trưng tương ứng với từng loại kháng nguyên. Kháng nguyên cần khảo sát có
thể là một protein, immunoglobulin, cytokine,… nằm trên màng tế bào, trong bào
tương, hoặc thậm chí trong nhân tế bào.[118]
1.2.2. Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy
Máy tế bào dòng chảy hoạt động bằng cách sử dụng thủy lực để buộc các
tế bào đã được nhuộm huỳnh quang di chuyển thành hàng một trong dòng chảy,
đi ngang qua một tia sáng tới, thông thường được phát ra từ một nguồn sáng laser.
Sau khi tương tác với tia laser, tế bào sẽ phát xạ trở lại. Những hạt photon của tia
sáng phát xạ từ tế bào sẽ được phân tích ra thành những bước sóng nhỏ hơn nhờ
vào rất nhiều gương lọc và gương phản chiếu. Những tia sáng đã được phân chia
này sẽ chạm vào những bộ phận nhận sóng và phát ra xung điện (hay những tín
hiệu analog), tỉ lệ thuận với số lượng tia sáng tới đập vào bộ phận dò sóng. Mỗi
một tín hiệu analog được chuyển thành tín hiệu digital và được tích lũy trong
bảng phân bố tần suất hoặc biểu đồ. Vì vậy, số lượng tín hiệu digital tổng hợp sẽ

phát hiện đồng thời nhiều DAMDTB cùng lúc và phản ánh mối quan hệ mật thiết
giữa các dấu ấn đó.
Thông thường để quan sát các kháng nguyên trên bề mặt tế bào, chỉ cần ủ
mẫu tủy hoặc mẫu máu với kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khoảng 1015 phút. Vì chẩn đoán bệnh BCC chủ yếu tập trung vào nghiên cứu tế bào có
nhân, nên phải sử dụng ammonium chloride hoặc các dung dòch có tác dụng
tương tự để loại bỏ hồng cầu trưởng thành (hồng cầu không nhân). Lưu ý: các tế
bào thuộc dòng hồng cầu chưa trưởng thành có nhân sẽ không bò phá hủy vì đề
kháng với ammonium chloride.
Khi cần khảo sát thêm những dấu ấn nằm trong bào tương hay trong nhân
tế bào, người ta cần làm tăng tính thấm bề mặt tế bào để đưa kháng thể xuyên
qua màng tế bào đến gắn với kháng nguyên đích bên trong tế bào. Các kháng
nguyên bên trong tế bào thông dụng là: TdT, chuỗi nhẹ hoặc chuỗi nặng, cyCD3,
cyCD22, cyCD79a, MPO, bcl-2, cyclin-D1, ZAP-70.[17]
1.2.5. Các kháng thể đơn dòng
Ngày nay, đa phần các kháng thể gắn huỳnh quang có sẵn trên thò trường.
Việc chọn lựa các kháng thể vào danh mục sử dụng thường qui phải dựa vào nhu
cầu thực tế của từng phòng thí nghiệm (mục đích chẩn đoán, số lượng mẫu, giá
thành). Do đó không có sự thống nhất về danh mục kháng thể. Tuy nhiên nên
thiết kế bộ kháng thể cần dùng theo phương pháp bậc thang: bắt đầu bằng một số
kháng thể có thể gợi ý đến dòng tế bào nào đó; từ những kết quả ban đầu, tiếp
tục nhuộm thêm những kháng thể cần thiết;… Bằng cách này có thể tiết kiệm chi
phí thuốc thử, song kéo dài thời gian hơn. Dưới đây chúng tôi giới thiệu một số
kháng thể đơn dòng cho nhiều thông tin hữu ích trong chẩn đoán bệnh BCC và
lymphoma.


10

Bảng 1.1: Bảng tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán
bệnh bạch cầu và lymphoma[17],[59],[64],[84],[109]

Dòng mono

tương tự dòng hạt và đặc trưng riêng:
CD14, CD36, CD64, CD4, HLA.DR

Dòng hồng cầu

CD71, CD235a, CD36.

Dòng mẫu tiểu cầu

CD61, CD41, CD42

Tóm lại, để đạt được kết quả chính xác và khách quan, cần áp dụng một dàn
kháng thể đơn dòng đủ lớn và bao quát để có thể phân biệt được các dòng tế bào
với nhau, đồng thời đánh giá được giai đoạn trưởng thành của từng dòng.


11

1.3. CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI DƯỚI NHÓM BỆNH BẠCH CẦU CẤP
BẰNG DAMDTB
1.3.1 DAMDTB đặc trưng cho các loại tế bào non
Điều quan trọng trong chẩn đoán bệnh BCC là xác đònh quần thể tế bào
non (còn gọi là tế bào blast). Các dấu ấn non không phụ thuộc dòng tế bào gồm:
CD34, CD38, TdT. Tuy nhiên, mỗi dòng tế bào sẽ có thêm những dấu ấn non
khác nhau.
Đa số các tế bào non có nguồn gốc từ dòng tủy (như myeloblast,
monoblast, erythroblast, megakaryoblast) đều có chung một số đặc điểm về
DAMDTB như: CD34, HLA.DR và CD38, CD117 rất cao. Đặc biệt là CD117

nguyên liên quan đến dòng B bên cạnh các dấu ấn non, đồng thời không xuất
hiện các dấu ấn đặc trưng của các dòng khác.

Hình 1.5: Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường của tế bào dòng lympho B[109]