ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN

BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN
VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Sinh lí học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62420104
Khóa học năm: 2013
Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trương Đình Kiệt

Tp. HCM, năm 2015
1


2


Phần 1: Tiểu luận tổng quan
Đái tháo đường là bệnh do sự tổn thương hay suy giảm chức năng của tế bào
tụy đảo và sản phẩm của nó (insulin), biểu hiện bởi nồng độ đường trong máu cao.
Bệnh có lượng bệnh nhân gia tăng rất nhanh trong thời gian gần đây, cả ở Việt Nam
và trên thế giới. Hơn nữa, đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm như
suy thận, xuất huyết võng mạc, đục thủy tinh thể, mù lòa, bệnh cơ tim, bệnh thần
kinh, bệnh động mạch vành, bệnh mạch ngoại vi, … (Harris et al., 2009). Theo Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) và Liên đoàn đái tháo đường thế giới (IDF), Việt Nam là
một trong những nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới
(khoảng 8 - 10%/năm); vì vậy, đái tháo đường được đánh giá ngang với bệnh dịch.
Năm 2012, theo công bố của Bệnh viện nội tiết Trung ương, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo

bào gốc từ mô mỡ và phương pháp ghép thay thế tế bào.
Tình hình nghiên cứu trong nước
Các nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, có tốc độ mắc hàng năm tăng
cao (9.2%) cùng với các biến chứng nguy hiểm, bệnh đái tháo đường thu hút sự
quan tâm của cộng đồng xã hội và giới y – khoa học. Các y, bác sĩ và nhà nghiên
cứu Việt Nam đã có những nỗ lực nhằm điều trị hiệu quả, an toàn. Tuy nhiên, cho
đến nay, các nghiên cứu về điều trị đái tháo đường ở nước ta chủ yếu là các nghiên
cứu điều trị hoặc hỗ trợ điều trị đái tháo đường bằng dược chất tự nhiên hoặc tổng
hợp như: thực phẩm chức năng, tác dụng của nụ vối (Trương Tuyết Mai et al., 2010,
2013), metformin (Nguyễn Thiện Hải, 2012), polyphenol từ trà xanh (Nguyễn Thị
Hà et al., 2005), mướp đắng (Đoàn Thị Nhu et al., 2004), nấm dược liệu (Nguyễn
Thị Chính et al., 2011) …(Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia). Các
nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc khảo sát đường huyết và một số chỉ tiêu
sinh hóa máu như chuyển hóa lipid, chống oxi hóa. Ngoài ra, một số nghiên cứu về
sản xuất insulin tái tổng hợp đã được tiến hành ở Việt Nam nhằm hướng đến có thể
tự sản xuất và cung cấp insulin cho người dân Việt Nam với giá thành phù hợp với
điều kiện kinh tế của phần đông người dân. Tiêu biểu là nghiên cứu của tiến sĩ Lê
Văn Phủng và cộng sự (2010); hay nghiên cứu của phó giáo sư Phạm Thành Hổ và
các đồng nghiệp ở trường Đại học Khoa học Tự nhiên (2010). Tuy nhiên, các
phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị này chỉ mang tính chất điều trị triệu chứng
(đường huyết cao) và không mang lại hiệu quả tốt và lâu dài như ghép tạng. Vì
nguồn tạng rất ít nên một hướng tiếp cận mới được các nhà nghiên cứu cập nhật
trong điều trị đái tháo đường là liệu pháp thay thế tế bào, đặc biệt là tế bào gốc.
Ở Việt Nam, hiện nay, các nghiên cứu về tế bào gốc đã có nhiều bước tiến
quan trọng. Cụ thể, trong 5 năm gần đây, nghiên cứu về tế bào gốc gặt hái được
nhiều thành tựu ở nhiều đơn vị như Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế
4


bào gốc, Đại học Y – Dược TP HCM, Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện


5


gần đây sử dụng mô hình chuột và người. Nhiều loại tế bào gốc khác nhau đã được
kiểm tra với nhiều phương pháp khác nhau.
a. Tế bào gốc trung mô
Việc cấy ghép tế bào gốc từ tủy xương hoặc máu cuống rốn giúp cải thiện
đáng cải tình trạng của các con chuột đái tháo đường (Dong et al., 2008; Li et al.,
2010; Jurewicz et al., 2010; Ho et al., 2012; Iskovich et al., 2012). Trong khi một
phần nhỏ (1-3%) các tế bào ghép có khả năng tiết insulin, thì vấn đề quan trọng hơn
được các nhà khoa học quan tâm trên các con chuột được cấy tế bào gốc đó là khả
năng kích thích các sự tăng sinh tế bào β của cơ thể chủ. Điều này được cho là lí do
chính giúp phục hồi nhanh chóng số lượng tế bào β và cải thiện tình trạng bệnh
(Hess et al. 2003).
Các tế bào tiền thân từ mô mỡ được nghiên cứu từ những năm đầu 1990
(Kirkland, 1993) nhưng cho đến đầu 2000, các tế bào gốc từ mô mỡ mới được phân
lập và định danh (Gimble, 2003). Gần 10 năm sau đó, nguồn tế bào gốc này được
sử dụng nhiều và phổ biến do chúng có khả năng điều biến miễn dịch
(immunomodulatory) cao hơn cả tế bào gốc tủy xương (Melief et al., 2013). Việc
điều trị đái tháo đường bằng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được thực hiện ở nhiều
nghiên cứu và cho kết quả khả quan khi nhu cầu insulin giảm, đường huyết giảm và
ổn định trong nhiều tháng (Trivedi et al., 2008; Cramer et al., 2010; Yang et al.,
2010; Bassi, 2012; Li et al. 2012; Dave et al., 2013). Nghiên cứu gần đây còn chỉ ra
rằng các tế bào gốc mô mỡ có khả năng cận tiết để bảo vệ chống lại sự tăng đường
huyết do Streptozotocin (Kono et al., 2014).
b. Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem cell_ESC)
Tế bào gốc phôi là tế bào gốc toàn năng. Chúng có thể biệt hóa thành tất cả
các tế bào có chức năng từ 3 lớp mầm, các lớp này cũng tạo nên các tế bào beta
hoặc tế bào tiết insulin. Nhiều nghiên cứu đã biệt hóa ESC thành IPC bằng cách mô

đảo và hàm lượng glucose thấp trong các con chuột rat bị đái tháo đường vào các
ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 (Wu et al., 2007). Gần đây, tế bào gốc trung mô tủy
xương được thu nhận từ bệnh nhân đái tháo đường type 2 và được biệt hóa thành
IPCs, sau đó các IPCs được ghép vào vỏ thận của chuột nude mắc đái tháo đường.
Kết quả bệnh được kiểm soát trong 3 tháng và kiểm tra huyết thanh của chuột phát
hiện có insulin và C-peptide người và lượng nhỏ insulin chuột (Gabr et al., 2012).
Nghiên cứu của Tsai và cộng sự (2013) cũng cho kết quả tương tự.
IPCs còn được biệt hóa từ MSCs thu nhận từ mô mỡ. Các tế bào sau biệt hóa
biểu hiện các đặc điểm của lớp nội mô (Hnf3β, TCF2 và Sox17) và đặc điểm của tế
bào tụy (PDX1, Ngn3, NeuroD, Pax4) và có thể tiết insulin. Các tế bào sau biệt hóa
được ghép vào chuột đái tháo đường cho kết quả đường huyết được giữ ở mức gần
7


bình thường trong 3-4 tuần. Đồng thời, trong máu chuột phát hiện có insulin có
nguồn gốc từ tế bào người được ghép vào (Chandra et al., 2011). Nghiên cứu của
Zhang và cộng sự (2011) cho rằng việc ghép tế bào IPC có nguồn gốc từ MSC mô
mỡ và kết hợp với việc blocking con đường truyền tín hiện Fas và TNF sẽ giúp duy
trì sự tồn tại của tế bào ghép trong thời gian dài.
Hiệu quả điều trị đái tháo đường được ghi nhận tốt hơn khi đồng ghép tế bào
gốc trung mô với tiểu đảo hay các cụm tế bào giống tiểu đảo được biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô (Figliuzzi et al., 2009; Ito et al., 2010; Rackham et al., 2011; Okcu et
al., 2013).

8


Phần 2: Đề cương luận án
1. Tên đề tài luận án
“Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế

Tế bào gốc
trung mô

Tế bào tiết
insulin

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN
VÀ SỰ DI CƯ
Mô hình chuột
đái tháo đường TYPE 1
NGHIÊN CỨU
ĐIỀU TRỊ

3.2.3 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột
3.2.3.1 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc ứng viên từ mô mỡ chuột
 Chuột sau khi được gây mê bằng ketamin (5 mg/0,1 ml/con), việc thu nhận
mỡ được tiến hành bằng cách giải phẫu. Vị trí thu nhận mỡ cách lỗ sinh dục
1 cm hướng về phía bụng; mỡ được lấy ra từ vết cắt mở ngang khoảng 1 cm.
Sau đó, vết mổ được khâu và xử lí lại cẩn thận và mô mỡ thu nhận được bảo
quản trong PBS lạnh có bổ sung kháng sinh 5X.
 Mỡ chuột (dạng khối) được rửa sạch nhiều lần bằng PBS-kháng sinh và
vortex kĩ để loại bỏ hồng cầu và làm cho mô mỡ trở nên lỏng lẻo hơn. Sau
đó, mỡ được xử lí với với hỗn hợp super extract và li tâm hai giai đoạn: li
tâm ở tốc độ 500g trong 5 phút, lấy dịch nổi, sau đó li tâm dịch nổi 1000 g
trong 10 phút thu cặn. Cặn tế bào được huyền phù trong môi trường
DMEM/F12 10% FBS và tế bào được nuôi ở điều kiện 370C, 5% CO2. Môi

10



-

Bước 3: biệt hóa thành tế bào tiết insulin bằng các tác nhân: N2, B27, b-FGF,
nicotinamide, sodium pyruvate.

* Đánh giá tế bào sau biệt hóa: tế bào sau biệt hóa được phân tích sự thành công của
quá trình biệt hóa theo các chỉ tiêu sau:
i) Sự hình thành tiểu đảo: các tế bào trong môi trường biệt hóa sẽ kết cụm lại,
hình thành các cụm tế bào giống tiểu đảo (islet-like cluster). Sau khi nhuộm
với Dithizone, các cụm tế bào có sản xuất Zn như tiểu đảo sẽ bắt màu với
thuốc nhuộm.
11


ii) Phân tích sự biểu hiện gene ở mức phiên mã các gene của tế bào beta tiểu
đảo tụy: các tế bào sau biệt hóa được phân tích sự biểu hiện của các gen như
Pdx-1, Ngn3, Nkx6, Pax4, Insulin ở mức phiên mã bằng kĩ thuật Realtime
Reverse Transcriptase PCR (Realtime RT-PCR).
iii) Tế bào sau biệt hóa được kiểm tra khả năng tiết insulin và c-peptide bằng:
thứ nhất, bằng kĩ thuật Elisa để kiểm tra sự hiện diện của insulin, c-peptide
trong

môi

trường

nuôi

cấy;



-

Cho chuột uống nước chứa 10% sucrose qua đêm để tránh sốc cao đường
huyết sau khi tiêm;

-

Kiểm tra tình trạng sinh lí chuột hàng ngày, vệ sinh chuồng 3 lần/tuần, chế
độ ánh sáng 12 giờ/ngày, nuôi nhốt 3-4 con/chuồng.

b. Đánh giá hiệu quả của quy trình
i) Trọng lượng
Cân nặng của chuột được ghi nhận hàng tuần trong suốt 6 tuần khảo sát.
ii) Đường huyết
 Kiểm tra đường huyết chuột 2 ngày/lần trong suốt 6 tuần sau khi xử lí
với STZ.
 Đo đường huyết bằng máy đo đường huyết One Touch Ultra của
hãng Lifescan – Johnson & Johnson (USA).
 Tiêu chuẩn đạt đái tháo đường: những con chuột có nồng độ đường
huyết tăng cao trên 200 mg/dl và duy trì đến tuần thứ 6 sau khi xử lí STZ,

12


80% tế bào beta tụy bị hủy hoại, insulin huyết thanh thấp hơn chuột bình
thường tối thiểu 5 lần.
iii) Test dung nạp glucose (Ayala et al., 2010)
 Chuột bị bỏ đói khoảng 6 giờ trước khi tiến hành test;
 Đo đường huyết chuột trước khi tiến hành test;

3.2.6.1 Đánh giá sự toàn vẹn nhiễm sắc thể
Sự toàn vẹn số lượng nhiễm sắc thể của tế bào được kiểm tra bằng kĩ thuật
Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype).
3.2.6.2 Khả năng gây ung thư
a. Kiểm tra mức biểu hiện của các gen sinh u (oncogenes) và các gen ức chế khối
u (tumor suppressor genes) ở mức phiên mã
Các gen sinh u được kiểm tra: Oct4, nanog, sox2, SSEA.
Các gen ức chế khối u được kiểm tra: p15, p16, p53.
Sự biểu hiện của các gen này ở mức phiên mã sẽ được kiểm tra thông qua kĩ
thuật RT-PCR với các cặp mồi đặc trưng cho gen.
b. Đánh giá tính sinh u in vivo – Khả năng tạo u trên mô hình chuột
Để đánh giá nguy cơ tạo u của tế bào ghép, các tế bào gốc trung mô từ mô
mỡ và tế bào IPC được ghép vào dưới da chuột với mật độ 2-5x106 tế bào gốc từ mô
mỡ và 500 – 1000 cụm tế bào IPC. Sau đó, chuột được theo dõi sự hình thành khối
u trong khoảng thời gian 10 – 12 tuần. Sau thời gian trên, vùng da được ghép tế bào
sẽ được cắt ra và kiểm tra hình thái mô học bằng kĩ thuật nhuộm hóa mô H&E.
3.2.6.3 Khả năng gây chết
Tế bào mục tiêu được ghép vào chuột và tình trạng sinh lí của chuột sau ghép
được theo dõi trong 3 tuần.
3.2.7 Kiểm tra sự di cư của tế bào ghép
Tế bào gốc trung mô biểu hiện protein phát huỳnh quang (Green florescent
protein_GFP) mạnh và ổn định (thương mại) được sử dụng cho thí nghiệm này.
Trước khi ghép, mật độ tế bào sống được xác định và điều chỉnh về liều ghép 5x106
tế bào/ 0,1 ml bằng PBS.
Chuột được gây mê bằng ketamine (5 mg/0,1 ml/con) tiêm vào dưới da. Sau
đó, tiến hành ghép tế bào vào chuột ở các vị trí tĩnh mạch đuôi.
Sau 7, 14, 28 ngày, vị trí của các tế bào phát huỳnh quang sẽ được phát hiện
thông qua scan hình ảnh chuột bằng hệ thống UVP Imaging.

14

-

Đường huyết, nồng độ HbA1C trong máu giảm bằng hoặc về gần mức bình
thường;

-

Khả năng dung nạp glucose và chịu đựng insulin về mức bằng hoặc gần mức
bình thường;

-

Cấu trúc mô tụy

4. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu
Nội dung 1: Thiết lập quy trình tạo mô hình chuột đái tháo đường type 1 bằng hóa
chất;
Nội dung 2 : Thiết lập quy trình phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột;
Nội dung 3: Thiết lập quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào
tiết insulin in vitro;
Nội dung 4 : Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tế bào tiết
insulin;
Nội dung 5 : Đánh giá sự di cư của tế bào ghép trên chuột
Nội dung 6 : Nghiên cứu điều trị bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp thay
thế tế bào.

15


5. Dự kiến kết quả đạt được (kết quả nghiên cứu, bài báo khoa học)

Năm thứ nhất
TT

Tên công việc

1

Viết đề cương và bảo vệ
đề cương nghiên cứu

X

2

Nội dung 1

X

3

Nội dung 2

3

Nội dung 3

4

Nội dung 4


4

X

X

X

X

X

X
X

Năm thứ hai
Q
1

Q
2

X

X
X

X
X


X

X

X

Q
3

Q
4

X

X

X

X

X

X
X

Năm thứ ba

X
X


nhuộm hóa mô

- Ở liều STZ HE,
này,
100%

nồng

(10/10) insulin,

độ

HbA1C

chuột huyết tương.

nhắt trắng bị cao
đường

huyết

(>250 mg/dL)
2

Nội dung 2: Thiết Tóm tắt quy trình
lập quy trình phân

- Trữ mô mỡ bằng PBS+ (có kháng sinh);

lập tế bào gốc trung

đáp ứng với các nồng độ đường khác nhau và có biểu
hiện gen ở mức phiên mã các gen liên quan đến sự biệt
hóa tế bào beta.
4

Nội dung 4 : Đánh Đã đánh giá được sự biểu hiện các oncogene và tumor
giá tính an toàn của suppressor gene ở mức phiên mã và phân tích sự ổn định
tế bào gốc trung mô bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mô mỡ người.
từ mô mỡ và tế bào
tiết insulin;

5

Nội dung 5 : Đánh Đang tiền hành bằng theo dõi sự di cư của tế bào được
giá sự di cư của tế chuyển gen phát huỳnh quang (gfp)
bào ghép trên chuột

6

Nội

dung

6 : Đang tiền hành thử nghiệm

Nghiên cứu điều trị
bệnh đái tháo đường
type 1 bằng liệu
pháp thay thế tế
bào.

A, Benigni A (2009). Bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve
islet graft function in diabetic rats. Transplant Proc 41(5): 1797-800.
[9] Gabr MM, Zakaria MM, Refaie AF, Ismail AM, Abou-El-Mahasen MA,
Ashamallah SA, Khater SM, El-Halawani SM, Ibrahim RY, Uin GS, Kloc M,
Calne RY, Ghoneim MA (2012). Insulin-producing cells from adult human bone
marrow mesenchymal stem cells control streptozotocin-induced diabetes in nude
mice. Cell Transplant 22(1): 133-45.
[10] Harris DT, Badowski M, Harman SM (2009). Treatment of Type I
Diabetes in the NOD Mouse with Syngeneic Cord Blood Stem Cells. The Open
Stem Cell Journal 1:62-68.
[11] Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA,
Bhatia M (2003). Bone marrow–derived stem cells initiate pancreatic
regeneration. Nature Biotechnology 21: 763 – 770.
[12] Ho JH et al. (2012). Multiple intravenous transplantations of mesenchymal
stem cells effectively restore long-term blood glucose homeostasis by hepatic
engraftment and beta-cell differentiation in streptozocin-induced diabetic mice.
Cell Transplant 21(5): 997-1009.

20


[13] Iskovich S et al. (2012). Elutriated stem cells derived from the adult bone
marrow differentiate into insulin-producing cells in vivo and reverse chemical
diabetes. Stem Cells Dev 21(1): 86-96.
[14] Ito T, Itakura S, Todorov I, Rawson J, Asari S, Shintaku J, Nair I, Ferreri
K, Kandeel F, Mullen Y (2010). Mesenchymal stem cell and islet cotransplantation promotes graft revascularization and function. Transplantation
89(12): 1438-45.
[15] Jiang J, Au M, Lu K, Eshpeter A, Korbutt G, Fisk G, Majumdar AS (2007).
Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem
cells. Stem Cells 25: 1940–1953.

[24] Tateishi, K He, J, Taranova, O, Liang, G., D'Alessio, AC, Zhang, Y (2008).
Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts. J
Biol Chem. 14;283(46), pp. 31601-7.
[25] Toai TC, Thao HD, Thao NP, Gargiulo C, Ngoc PK, Van PH, Strong DM
(2010). In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical
cord blood. Cell Tissue Bank 11(3): 269-80.
[26] Tran CT, Gargiulo C, Thao HD, Tuan HM, Filgueira L, Michael Strong
D(2011). Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from
human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank 12(4): 247-61.
[27] Tsai, P. J,Wang, H. S., Lin, C. H., Weng, Z. C., Chen, T. H., Shyu, J. F.
(2013). Intraportal injection of insulin-producing cells generated from human
bone marrow mesenchymal stem cells decreases blood glucose level in diabetic
rats. Endocr Res.
[28] Voltarelli,

JC, Couri,

CE, Stracieri,

AB, Oliveira,

MC, Moraes,

DA, Pieroni, F, Coutinho, M, Malmegrim, KC, Foss-Freitas, MC, Simões,
BP,Foss, MC, Squiers, E, Burt, RK (2007). Autologous nonmyeloablative
hematopoietic stem cell transplantation in newly diagnosed type 1 diabetes
mellitus. JAMA. 11;297(14):1568-76.
[29] Zhang D, Jiang W, Liu M, Sui X, Yin X, Chen S, Shi Y, Deng H (2009).
Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature
pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19(4):429-38.