BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-------------------

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội - 2015


Công trình được hoàn thành tại:
Viện Hóa sinh biển
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phan Văn Kiệm
2. TS. Hoàng Lê Tuấn Anh
Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phản biện 1:......................................................................................................
Phản biện 2:......................................................................................................

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây thuốc quý này.
Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của cây na biển (Annona glabra L), chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành
phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Na biển (Annona glabra L.)"
2. Đối tượng nghiên cứu và nội dung của luận án
Đối tượng nghiên cứu của luận án là loài na biển Annona glabra.
Nội dung chính của luận án:
1. Phân lập các hợp chất từ quả loài na biển (A. glabra) bằng các phương pháp
sắc ký;
2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp
vật lý và hóa học;
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được;
4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được.
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Từ quả loài na biển (A. glabra) đã phân lập được:
3.1.1. 5 hợp chất mới là: 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (1),
7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2),
7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (3),
16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester (4),
(2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-D-glucopyranoside (13);
3.1.2. 7 hợp chất lần đầu phân lập từ chi Annona là: paniculoside IV (5),
(2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-glucopyranoside (14),
cucumegastigmane I (15), icariside B1 (17), icariside D2 (18), icariside D2 6′-O-βD-xylopyranoside (19), 3,4-dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside (20);


2
3.1.3. 2 hợp chất lần đầu phân lập từ loài A. glabra là: 16α,17-dihydroxy-entkaurane (6) và 3,4-dihydroxybenzoic acid (21).
3.2. Lần đầu tiên thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung
thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2, HL-60 và KB của 22 hợp chất phân lập từ loài na
biển (A. glabra). Kết quả cho thấy, các hợp chất 3, 4, 6, 14, và 15 thể hiện khả năng

1.1. Giới thiệu về chi Na (Annona)


3
1.2. Giới thiệu về loài na biển (Annona glabra)
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu lá, quả loài na biển (Annona glabra) được thu hái vào tháng 5 năm 2013
tại Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp
mỏng điều chế và sắc ký cột (CC).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Sử dụng kết hợp xác định các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại
đồng thời kết hợp phân tích, tra cứu tài liệu tham khảo. Các thiết bị và phương pháp
sử dụng gồm: đo điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ khối lượng (ESIMS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ nhân (1D, 2D-NMR), phổ lưỡng sắc tròn
(CD) và phương pháp hóa học.
2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học
2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính gây độc tế bào của các hoạt chất đuợc xác định theo phương pháp
MTT.
2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất đuợc đánh giá dựa trên khả năng ức chế
sự sản sinh NO trong điều kiện đại thực bào RAW 264.7 được kích thích với LPS
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Phân lập các hợp chất từ quả na biển
Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các hợp từ quả na biển A. glabra.
Việc phân tách các chất đuợc nêu tóm tắt ở các sơ đồ hình 3.1, 3.2, 3.3.

Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A. glabra)

Tính toán lý thuyết [C20H32O5Na]+: 375,2142.
Công thức phân tử C20H32O5, M = 352.
3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới)
Chất bột vô định hình, màu trắng.
Độ quay cực [α ]D : –40,7 (c 0,1, MeOH);
25

Nhiệt độ nóng chảy: 185-186oC.
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,94 (1H, m, Ha-1), 1,88 (1H, m, Hb-1), 1,45
(1H, m, Ha-2), 1,94 (1H, m, Hb-2), 1,13 (1H, m, Ha-3), 2,22 (1H, m, Hb-3), 1,78
(1H, d, J = 13,0 Hz, H-5), 1,97 (1H, m, Ha-6), 2,18 (1H, dd, J = 13,0 Hz, 14,5 Hz,
Hb-6), 3,50 (1H, br s, H-7), 1,43 (1H, m, H-9), 1,57 (1H, m, Ha-11), 1,63 (1H, m,
Hb-11), 1,43 (1H, m, Ha-12), 1,63 (1H, m, Hb-12), 2,11 (1H, m, H-13), 1,08 (1H, m,
Ha-14), 1,80 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-14), 1,12 (1H, m, Ha-15), 1,71 (1H, dd, J = 3,5
Hz, 10,0 Hz, Hb-15), 1,94 (1H, m, H-16), 3,35 (2H, m, H-17), 1,22 (3H, s, H-18),
0,99 (3H, s, H-20), 5,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 3,38 (1H, m, H-2′), 3,45 (1H, m,
H-3′), 3,39 (1H, m, H-4′), 3,39 (1H, H-5′), 3,71 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 11,5 Hz, Ha6′), 3,86 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-6′).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,77 (C-1), 20,20 (C-2), 39,09 (C-3), 44,69 (C4), 49,05 (C-5), 30,68 (C-6), 78,70 (C-7), 49,80 (C-8), 50,62 (C-9), 40,47 (C-10),
19,51 (C-11), 32,93 (C-12), 39,46 (C-13), 37,17 (C-14), 42,58 (C-15), 44,66 (C16), 67,66 (C-17), 28,82 (C-18), 178,67 (C-19), 16,28 (C-20), 95,66 (C-1′), 74,07
(C-2′), 78,67 (C-3′), 71,14 (C-4′), 78,56 (C-5′) và 62,42 (C-6′).
HR-ESI-MS: m/z 521,2732 [M+Na]+.
Tính toán lý thuyết [C26H42O9Na]+: 521,2721.
Công thức phân tử C26H42O9, M = 498.
3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới)
Chất bột vô định hình, màu trắng.
Độ quay cực [α ]D : –38,5 (c 0,1, MeOH).
25


Hb-3), 1,15 (1H, m, H-5), 1,88 (1H, m, Ha-6), 2,00 (1H, m, Hb-6), 1,57 (1H, m, Ha7), 1,96 (1H, m, Hb-7), 1,08 (1H, m, H-9), 1,43 (1H, m, Ha-11), 1,94 (1H, m, Hb11), 1,47 (1H, m, Ha-12), 1,71 (1H, m, Hb-12), 2,55 (1H, m, H-13), 1,17 (1H, m,
Ha-14), 2,16 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-14), 1,59 (1H, m, Ha-15), 1,97 (1H, m, Hb-15),
3,06 (1H, m, H-16), 1,24 (3H, s, H-18), 0,97 (3H, s, H-20), 5,53 (1H, d, J = 8,0 Hz, H1′), 3,35 (1H, m, H-2′), 3,48 (1H, m, H-3′), 3,42 (1H, m, H-4′), 3,40 (1H, H-5′),
3,71 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz, Ha-6′), 3,84 (1H, d, 11,5 Hz, Hb-6′).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,44 (C-1), 19,15 (C-2), 39,04 (C-3), 45,11 (C4), 58,61 (C-5), 23,19 (C-6), 42,91 (C-7), 45,62 (C-8), 57,59 (C-9), 40,83 (C-10),
20,14 (C-11), 28,05 (C-12), 41,09 (C-13), 41,87 (C-14), 42,69 (C-15), 46,62 (C16), 175,32 (C-17), 29,04 (C-18), 178,43 (C-19), 16,36 (C-20), 95,61 (C-1′), 74,04
(C-2′), 78,68 (C-3′), 71,11 (C-4′), 78,68 (C-5′) và 62,40 (C-6′), 95,61 (C-1′′), 74,04
(C-2′′), 78,68 (C-3′′), 71,11 (C-4′′), 78,68 (C-5′′) và 62,34 (C-6′′).
1


7
HR-ESI-MS: m/z 681,3095.
Tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+: 681,3093.
Công thức phân tử C32H50O14, M = 658.
3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [α ]D : +56 (c 0,1, MeOH)
31

Nhiệt độ nóng chảy: 192-193oC.
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,91 (1H, m, Ha-1), 1,88 (1H, m, Hb-1), 1,62
(2H, m, H-2), 1,12 (1H, m, Ha-3), 2,21 (1H, m, Hb-3), 1,10 (1H, dd, J = 2,0 Hz,
12,0 Hz, H-5), 1,87 (1H, m, Ha-6), 2,01 (1H, m, Hb-6), 1,52 (1H, m, Ha-7), 1,68
(1H, m, Hb-7), 1,03 (1H, m, H-9), 1,42 (1H, m, Ha-11), 1,97 (1H, m, Hb-11), 1,50
(1H, m, Ha-12), 1,61 (1H, m, Hb-12), 2,01 (1H, br s, H-13), 1,72 (1H, m, Ha-14),
2,02 (1H, m, Hb-14), 1,42 (1H, m, Ha-15), 1,58 (1H, m, Hb-15), 3,62 (1H, m, Ha17), 3,71 (1H, m, Hb-17), 1,23 (3H, s, H-18), 0,99 (3H, s, H-20), 5,43 (1H, d, J = 8,0
Hz, H-1′), 3,40 (1H, m, H-2′), 3,42 (1H, m, H-3′), 3,90 (1H, m, H-4′), 3,43 (1H, H5′), 3,71 (1H, dd, J = 6,0 Hz, 11,5 Hz, Ha-6′), 3,85 (1H, dd, J = 2,5 Hz, 11,5 Hz,
Hb-6′).

H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 0,76 (1H, m, Ha-1), 1,82 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb1), 1,41 (1H, overlep, Ha-2), 1,63 (1H, m, Hb-2), 1,12 (1H, m, Ha-3), 1,46 (1H, m,
Hb-3), 0,77 (1H, m, H-5), 1,25 (1H, m, Ha-6), 1,51 (1H, m, Hb-6), 1,37 (2H, m, H7), 1,12 (1H, H-9), 1,63 (1H, m, Ha-11), 1,87 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, Ha-12),
1,75 (1H, m, Hb-12), 2,07 (1H, m, H-13), 0,99 (1H, br d, J = 12,0 Hz, Ha-14), 1,99
(1H, br d, J = 12,0 Hz, Hb-14), 1,38 (1H, m, Ha-15), 1,42 (1H, m, Hb-15), 3,38 (1H,
d, J = 11,0 Hz, Ha-17), 3,46 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-17), 0,84 (3H, s, H-18), 0,79
(3H, s, H-19) và 1,02 (3H, s, H-20).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 40,45 (C-1), 18,82 (C-2), 42,10 (C-3), 33,27 (C4), 56,21 (C-5), 20,05 (C-6), 41,93 (C-7), 43,58 (C-8), 57,06 (C-9), 39,43 (C-10),
18,64 (C-11), 26,76 (C-12), 40,89 (C-13), 38,32 (C-14), 52,84 (C-15), 79,82 (C16), 69,90 (C-17), 33,60 (C-18), 21,60 (C-19) và 17,57 (C-20).
ESI-MS: m/z 329,2 [M+Na]+.
Công thức phân tử C20H34O2, M = 306.
1

3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al
Tinh thể hình kim, không màu.
Độ quay cực [α ]D : – 45 (c 0,1, CHCl3).
31

Nhiệt độ nóng chảy: 186-187oC.
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 0,88 (1H, m, Ha-1), 1,90 (1H, m, Hb-1), 1,44 (1H,
m, Ha-2), 2,07 (1H, m, Hb-2), 1,06 (1H, m, Ha-3), 2,12 (1H, m, Hb-3), 1,23 (1H, dd,
J = 2,5 Hz; 12,5 Hz, H-5), 1,59 (H, m, Ha-6), 1,63 (1H, m, Hb-6), 1,52 (2H, m, H7), 1,16 (1H, m, H-9), 1,72 (1H, m, Ha-11), 1,89 (1H, m, Hb-11), 1,49 (1H, m, Ha12), 1,84 (1H, m, Hb-12), 2,08 (1H, H-13), 1,13 (1H, m, Ha-14), 2,00 (1H, dd, J =
2,0 Hz; 12,0 Hz, Hb-14), 1,45 (2H, m, H-15), 3,32 (1H, d, J = 11,5 Hz, Ha-17), 3,43
(1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-17), 1,00 (3H, s, H-18), 9,75 (1H, d, J =1,5 Hz, H-19) và
0,93 (3H, s, H-20).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 41,02 (C-1), 19,47 (C-2), 35,28 (C-3), 49,84 (C4), 57,90 (C-5), 20,71 (C-6), 43,08 (C-7), 44,69 (C-8), 57,19 (C-9), 40,65 (C-10),
19,82 (C-11), 27,77 (C-12), 42,20 (C-13), 39,41 (C-14), 53,09 (C-15), 80,74 (C16), 70,61 (C-17), 24,57 (C-18), 207,87 (C-19) và 16,85 (C-20).


13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 41,72 (C-1), 19,06 (C-2), 36,73 (C-3), 39,78 (C4), 58,25 (C-5), 21,62 (C-6), 43,19 (C-7), 45,54 (C-8), 59,00 (C-9), 40,41 (C-10),
19,32 (C-11), 28,50 (C-12), 41,08 (C-13), 41,56 (C-14), 43,34 (C-15), 46,71 (C16), 178,42 (C-17), 27,83 (C-18), 65,16 (C-19) và 18,79 (C-20).
ESI-MS: m/z 319 [M-H]−
Công thức phân tử C20H32O3, M = 320.
1

3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B
Chất bột, màu trắng.


10
Độ quay cực [α ]D : – 40 (c 0,1, CHCl3).
31

Nhiệt độ nóng chảy: 166-167oC.
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,78 (1H, dd, J = 3,5 Hz, 13,0 Hz, Ha-1), 1,81
(1H, br d, J = 13,0, Hb-1), 1,40 (1H, m, Ha-2), 1,52 (1H, m, Hb-2), 0,98 (1H, m, Ha3), 1,68 (1H, m, Hb-3), 0,95 (1H, m, H-5), 1,33 (1H, m, Ha-6), 1,67 (1H, m, Hb-6),
1,50 (2H, m, H-7), 1,08 (1H, m, H-9), 1,52 (1H, m, Ha-11), 1,63 (1H, m, Hb-11),
1,51 (1H, m, Ha-12),1,66 (1H, m, Hb-12), 2,57 (1H, m, H-13), 1,05 (1H, m, Ha-14),
2,04 (1H, m, Hb-14), 1,55 (1H, dd, J = 6,5 Hz, 13,0, Ha-15), 1,90 (1H, dd, J = 6,5
Hz, 13,0, Hb-15), 2,94 (1H, m, H-16); 0,94 (3H, s, H-18), 3,88 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha19), 4,20 (1H, d, J = 11,0 Hz, Hb-19), 1,01 (3H, s, H-20), 2,04 (3H, s, H-22).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 40,23 (C-1), 18,20 (C-2), 36,33 (C-3), 37,04 (C4), 56,71 (C-5), 20,64 (C-6), 41,87 (C-7), 44,35 (C-8), 57,17 (C-9), 39,13 (C-10),
18,01 (C-11), 27,31 (C-12), 39,80 (C-13), 40,55 (C-14), 41,69 (C-15), 45,29 (C16), 179,95 (C-17), 27,53 (C-18), 67,19 (C-19), 18,07 (C-20), 171,47 (C-21) và
21,02 (C-22).
ESI-MS: m/z 361 [M-H]-.
Công thức phân tử C22H34O4, M = 362.
1


CD (c = 1,5 ×10-5, MeOH), [θ] (λmax, nm) –52481 (237).
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5,86 (1H, s, H-2), 8,05 (1H, d, J = 16,0 Hz, H4), 6,62 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-5), 2,14 (3H, s, H-6), 1,82 (1H, m, Ha-2′), 2,02 (1H,
m, Hb-2′), 4,28 (1H, m, H-3′), 1,82 (1H, m, Ha-4′), 2,21 (1H, m, Hb-4′), 3,78 (1H, d,
J = 7,0 Hz, Ha-7′), 3,83 (1H, d, J = 7,0 Hz, Ha-7′), 0,96 (3H, s, H-8′), 1,19 (3H, s,
H-9′), 5,54 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,17 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-2′′), 3,30 (2H, m,
H-3′′, H-4′′), 3,42 (1H, m, H-5′′), 3,70 (1H, m, Ha-6′′), 3,87 (1H, m, Hb-6′′), 4,38
(1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′′), 3,40 (1H, m, H-2′′′), 3,46 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-3′′′), 3,39
(2H, m, H-4′′′, H-5′′′), 3,70 (1H, m, Ha-6′′) và 3,87 (1H, m, Hb-6′′).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 166,00 (C-1), 117,78 (C-2), 154,00 (C-3),
131,78 (C-4), 136,43 (C-5), 21,32 (C-6), 48,83 (C-1′), 42,86 (C-2′), 73,99 (C-3′),
42,83 (C-4′), 87,63 (C-5′), 83,25 (C-6′), 77,13 (C-7′), 16,34 (C-8′), 19,72 (C-9′),
95,44 (C-1′′), 73,86 (C-2′′), 78,04 (C-3′′), 71,66 (C-4′′), 78,79 (C-5′′), 62,76 (C-6′′),
103,04 (C-1′′′), 73,99 (C-2′′′), 77,96 (C-3′′′), 71,14 (C-4′′′), 78,08 (C-5′′′), 62,37 (C-6′′′).
HR-ESI-MS: m/z 629,2431[M+Na]+.
Tính toán lý thuyết: [C27H42O15Na]+ 629,2416.
Công thức phân tử C27H42O15, M = 606.
3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside
Chất bột, màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 199-200oC.
Độ quay cực

[α ]31D : -110 (c 1,0, MeOH).

H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5,85 (1H, s, H-2), 7,78 (1H, d, J = 16,0 Hz, H4), 6,31 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-5), 2,17 (3H, s, H-6), 1,96 (2H, m,H-2′), 4,28 (1H,
m, H-3′) 1,19 (1H, m, Ha-4′), 2,17 (1H, m, Hb-4′), 3,76 (1H, d, J = 7,5 Hz, Ha-7′),
3,82 (1H, dd, J = 2,0, 7,5 Hz, Ha-7′), 0,95 (3H, s, H-8′),1,18 (3H, s, H-9′), 4,37 (1H,
d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,16 (1H, dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2′′), 3,30 (1H, m, H-3′′), 3,29
(1H, m, H-4′′), 3,39 (1H, m, H-5′′), 3,29 (1H, dd, J = 2,0, 12,0 Hz, Ha-6′′) và 3,90

Độ quay cực [α ]D : +25 (c 0,3, CHCl3)
31

Nhiệt độ nóng chảy: 112-113oC.
H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 2,22 (1H, d, J = 17,0 Hz, Ha-2), 2,43 (1H, d, J =
17,0 Hz, Hb-2), 5,91 (1H, br s, H-4), 5,77 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7), 5,86 (1H, dd, J
= 5,0, 16,0 Hz, H-8), 4,41 (1H, m, H-9), 1,30 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-10), 1,02 (3H,
s, H-11), 1,08 (3H, s, H-12) và 1,90 (3H, s, H-13).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 41,16 (C-1), 49,70 (C-2), 198,06 (C-3), 126,88
(C-4), 162,60 (C-5), 79,04 (C-6), 135,74 (C-7), 129,02 (C-8), 68,02 (C-9), 23,74
(C-10), 22,90 (C-11), 24,03 (C-12) và 18,89 (C-13).
Công thức phân tử C13H20O3, M = 224.
1

3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [α ]D : -42 (c 0,05, MeOH).
31

Nhiệt độ nóng chảy: 183-184oC.
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 1,50 (1H, dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, Ha-2), 2,11 (d,
J = 12,0 Hz, Hb-2), 4,37 (1H, tt, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz, H-3), 1,47 (1H, dd, J = 4,0
Hz, 12,0 Hz, Ha-4), 2,39 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-4), 5,86 (1H, s, H-8), 2,21 (3H, s,


13
H-10), 1,18 (3H, s, H-11), 1,41 (3H, s, H-12), 1,42 (3H, s, H-13), 4,46 (1H, d, J =
7,5 Hz, H-1′), 3,18 (1H, dd, J = 7,5 Hz, 9,0 Hz, H-2′), 3,36 (2H, m, H-3′, H-4′),

H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 7,08 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2, H-6), 7,18 (2H, d, J
= 8,0 Hz, H-3, H-5), 2,79 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-7), 3,74 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-8),
4,88 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 4,36 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 134,33 (C-1), 130,96 (C-2), 117,81 (C-3),
157,45 (C-4), 39,36 (C-7), 64,32 (C-8), 102,32 (C-1′), 74,93` (C-2′), 77,84 (C-3′),
71,44 (C-4′), 77,34 (C-5′), 69,67 (C-6′), 105,23 (C-1′′), 74,88 (C-2′′), 77,56 (C-3′′),
71,44 (C-4′′), 66,81 (C-5′′).
Công thức phân tử C18H26O11, M = 418.
3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside
Chất bột, màu trắng.


14
Độ quay cực [α ]D : -26 (c 0,4, MeOH).
31

Nhiệt độ nóng chảy: 195-196oC.
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,87 (1H, d, J =
8,5 Hz, H-5), 6,68 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6), 3,80 (3H, s, 3-OCH3), 3,83 (3H,
s, 4-OCH3), 4,80 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 3,69 (1H, dd, J = 5,0, 12,5 Hz, Ha-6′),
3,92 (1H, dd, J = 2,5, 12,5 Hz, Hb-6′).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 153,96 (C-1), 104,13 (C-2), 146,06 (C-3),
151,16 (C-4), 113,99 (C-5), 109,36 (C-6), 57,16 (3-OCH3), 56,62 (4-OCH3),
103,47 (C-1′), 74,98 (C-2′), 78,05 (C-3′), 71,57 (C-4′), 78,22 (C-5′) và 62,64 (C-6′).
Công thức phân tử C14H20O8, M = 316.
1

3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid


H
OH

OH

OH

H

H
OH

H
COOH

H
COOGlc

1: 7β,16α,17-Trihydroxy-entkauran-19-oic acid
H

OH

2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic
acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester
H

OH


H

H

R

R

5: R = COOGlc
Paniculoside IV
6: R = CH3
16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane

7: R = CH3
16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane
8: R = CHO
16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al
9: R = COOH
16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

H

H
COOH

COOH

H

H


16
OH

H

OH
OH

C
OH

OH

O
O

O

GlcO
OH

15: Cucumegastigmane I

16: Blumenol A

17: Icariside B1

OH


3,4-Dihydroxybenzoic
acid
36

24

O

O

34

OH

15

1

OH

O

O

22: Squamocin M
* Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của 1 hợp chất mới
đại diện, các hợp chất còn lại cũng xác định cấu trúc một cách tương tự.
4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới)
H
20

6'

4

6"

COOH

17

1

HO

H

O

16
13

11

4

HO
HO HO

1'


glucopyranosyl tại C-17 và C-19. Tương tác NOESY giữa H-18 (δH 1,24) với H-5
(δH 1,15) nhưng không có tương tác với H-20 (δH 0,97) chứng tỏ nhóm methyl tại
C-4 có cấu hình β.
Ngoài ra, tương tác NOESY của H-16 (δH 3,06) với H-13 (δH 2,55); H-16 (δH
3,06) với Hα-15 (δH 1,59); và giữa H-9 (δH 1,08) với Hβ-15 (δH 1,97) khẳng định cấu
hình α của H-16. Thủy phân hợp chất 4 trong môi trường axit thu được D-glucose
[17]. Bên cạnh đó, hằng số tương tác J giữa glc H-1′/glc H-2′; glc H-1″/glc H-2″, J
= 8,0 Hz cho phép khẳng định các proton này đều chiếm vị trí axial. Do đó, 2 nhóm
hydroxyl liên kết với cacbon anomeric C-1′ và C-1′′ có cấu hình β. Từ những dữ
kiện phổ trên, hợp chất mới 4 được xác định là 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic
acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester.

Hình 4.25. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY quan trọng của hợp chất 4
Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo
C
δC(#)
DEPT
δC(@)
δH(@)
1
40,0
CH2
41,44
0,87(m)/1,88 (m)
2
20,3
CH2
19,15
1,52 (m)/1,69 (m)
3

CH
57,59
1,08 (m)


18
10
40,8
11
19,3
12
28,5
13
40,5
14
43,1
15
42,0
16
46,7
17 178,1
18
29,5
19 180,6
20
16,8
17-O-Glc
1'
2'
3'

175,32
29,04
178,43
16,36

1,43 (m)/1,94 (m)
1,47 (m)/1,71 (m)
2,55 (m)
1,17 (m)/2,16 (d, J = 12,0 Hz)
1,59 (m)/1,97 (m)
3,06 (m)
1,24 (s)
0,97 (s)

CH
CH
CH
CH
CH
CH2

95,61
74,04
78,68
71,11
78,68
62,40

5,53 (d, J = 8,0 Hz)
3,35 (m)


#

Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 4

Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất 4


19

Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4

Hình 4.29. Phổ DEPT của hợp chất 4

Hình 4.30. Phổ HSQC của hợp chất 4

Hình 4.31. Phổ HMBC của hợp chất 4

Hình 4.32. Phổ COSY của hợp chất 4

Hình 4.33. Phổ NOESY của hợp chất 4

4.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học
4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn
Kết quả cho biết dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A. glabra) đã
thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào là LU-1 và KB với giá trị
IC50 trong khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ± 1,23 µg/mL. So sánh khả năng ức chế sự
phát triển hai dòng tế bào ung thư LU-1 và KB được thử nghiệm của các phân đoạn
từ lá và quả cho thấy các phân đoạn từ quả thể hiện hoạt tính mạnh hơn các phân
đoạn từ lá. Đồng thời hai phân đoạn dichloromethane và nước từ quả đều thể hiện

> 100
> 100
3,47 ± 0,29
3,70 ± 0,98
Phân đoạn nước
0,34 ± 0,09
0,36 ± 0,08
Ellipticine
4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất
Trong số 12 hợp chất thuộc khung ent-kaurane từ quả loài na biển (A. glabra),
hợp chất 3, 4 và 6 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong
khoảng 0,65 ÷7,39 µM trên 4 dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB;
hợp chất megastigmane 14 và 15, phenolic 18 và acetogenin 22 thể hiện hoạt tính
gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB với giá
trị IC50 trong khoảng 2,79 ÷11,17 µM. Các hợp chất 1, 2, 5, 7, 19 và 17 thể hiện
hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình. Các hợp chất còn lại không thể hiện
hoạt tính.
Riêng với dòng tế bào ung thư HL-60 hợp chất 7, 8, 18 và 22 thể hiện hoạt tính
gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 6,94 ÷ 9,38 µM khi so sánh với
mitoxantrone (IC50: 6,8 µM). Cả bốn hợp chất này sau đó đều được đánh giá khả
năng gây độc tế bào trên dòng tế bào thường HEL-299. Theo kết quả thu được, chỉ
có hợp chất 18 và 22 thể hiện độc tính ít (% sống sót tại nồng độ 9,02 và 8,72 µM
tương ứng là 93,25 và 94,69 %). Hai hợp chất này sau đó được nghiên cứu sâu hơn
về khả năng gây chết của các hợp chất này có theo cơ chế apoptosis hay không?
Bảng 4.25. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất 1-22
% ss(*)
IC50 (µM)
Hợp chất
LU-1$ MCF-7$ SK-Mel2$ KB$ HL-60# HEL-299#
55,68

93,17 23,27
7
6,94
>100 78,10
>100
>100
75,72 >100
8
9,38
>100 82,17


21
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Ellipticine
Mitoxantrone


3,73

>100 >100
>100 >100
>100 >100
>100 >100
18,96 19,93
5,36
6,71
5,13
5,58
>100 >100
90,05 117,07
8,50
6,63
93,97 >100
>100 >100
>100 >100
9,57
7,93
3,35
4,04

56,54
66,87
32,61
30,17
25,82
>100
>100

Bởi vậy, với mục đích nghiên cứu cơ chế gây nên quá trình tự chết của tế bào,
chúng tôi kiểm tra độ biểu hiện của các protein liên quan tới quá trình này.
Khi xử lý với chất hợp chất 18 (9,0 µM) và 22 (8,7 µM) trong 24 h và 48 h,
chúng tôi quan sát thất sự thay đổi trong biểu hiện của các protein liên quan tới quá
trình tự chết của tế bào, ví dụ như: tăng cường biểu hiện của Bax, giảm độ biểu
hiện của Bcl-2, phân cắt Caspase 3 và PARP. Những kết quả này cho thấy hợp chất
18 và 22 gây nên quá trình tự chết của tế bào thông qua làm thay đổi mức độ biểu
hiện của các protein liên quan trong tế bào HL-60.
Con đường tín hiệu PI3K/AKT điều hòa sự sống, tăng trưởng và quá trình tự
chết của tế bào. Đặc biệt, AKT dạng hoạt hóa tham gia vào quá trình sống và tăng
trưởng của các tế bào ung thư thông qua protein c-myc. C-myc thường biểu hiện


22
mạnh ở nhiều dạng khối u. Nhằm tìm hiểu xem con đường tín hiệu nội bào nào bị
ảnh hưởng bởi hợp chất 18 và 22, chúng tôi phân tích quá trình photphorin hóa của
AKT và độ biểu hiện của c-myc bằng thí nghiệm Western-blot. Kết quả cho thấy,
sau khi xử lý với hợp chất 18 và 22, quá trình photphorin hóa của AKT bị giảm đi,
dẫn tới các tế bào tự chết. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của c-myc cũng đồng thời
thấp hơn. Đây là những bằng chứng cho thấy tác dụng làm các tế bào chết theo
trương trình của hợp chất 18 và 22 là thông qua sự giảm mức độ biểu hiện của pAKT và c-myc.
4.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất
Ở nồng độ 30 µM, hợp chất 1, 3, 8, 12, và 13 gây giảm mạnh sản sinh NO thấp
hơn chất đối chứng dexamethasone. Kết quả cho thấy hợp chất 3 gây ức chế sự sản
sinh NO của các đại thực bào RAW 264.7 trong điều kiện bị kích thích bởi LPS,
giá trị IC50 của hợp chất này là 0,01 µM; các hợp chất 1, 8, 12 và 13 cũng ức chế
đáng kể sự sản sinh NO với các giá trị IC50 lần lượt là 0,39, 0,32, 0,10 và 0,42 µM.
Bảng 4.26. Tác dụng ức chế NO trong đại thực bào
Hợp chất IC50 (µM)
Hợp chất

>30 Dexamethasone

0,10
0,42
14,7
>30
16,3
>30
1,21
1,84
3,21
0,80

KẾT LUẬN
1. Từ cây na biển (Annona glabra) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa
học của 22 hợp chất bao gồm
•

5 hợp chất mới:



4 hợp chất diterpenoid ent-kaurane: 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran19-oic acid (1), 7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-βD-glucopyranoside ester (2), 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic
acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (3), 16α-hydro-ent-kauran-17,19dioic acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester (4);


23


1 hợp chất megastigmane: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic acid


2. Đã tiến hành sàng lọc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào từ các dịch chiết
methanol, các phân đoạn n-hexane, dichoromethane, ethyl acetate và nước của quả
và lá loài na biển (A. glabra) trên hai dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư
phổi LU-1. Kết quả cho biết dịch chiết methanol của quả và lá loài na biển (A.
glabra) đã thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào là LU-1 và KB
với giá trị IC50 trong khoảng 12,57 ± 3,62 ÷ 38,19 ± 1,23 µg/mL. Hai phân đoạn
dichloromethane và nước từ quả đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá
trị IC50 trong khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98. Đây là cơ sở quan trọng cho các
nghiên cứu về thành phần hóa học.
3. Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư LU-1,
MCF-7, SK-Mel2 và KB của 22 hợp chất, hợp chất khung ent-kaurane 3, 4 và 6 thể
hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 0,65 ÷7,39 µM;
hợp chất megastigmane 14 và 15, phenolic 18 và acetogenin 22 thể hiện hoạt tính
gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 2,79 ÷11,17 µM trên cả 4 dòng tế
bào ung thư.
4. Hợp chất 18 và 22 thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư
HL-60 với giá trị IC50 lần lượt là 9,02 và 8,72 µM, đồng thời không thể hiện độc
tính trên dòng tế bào thường HEL-299. Nghiên cứu về cơ chế gây chết tế bào ung
thư của hai hợp chất ngày đã chỉ ra hai hợp chất này gây chết theo chương trình.