BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
BÙI THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA (ANNONA
SQUAMOSA L.) VÀ CÂY DỦ DẺ TRÂU
(MELODORUM FRUTICOSUM LOUR .)
THUỘC HỌ NA (ANNONACEAE)
Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 62. 44. 01. 14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
NGHỆ AN - 2014

Công trình được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Chuyên đề
Hữu cơ, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Đình Thắng

Thực vật ở nước ta rất đa dạng và phong phú, số liệu thống kê
gần đây về thực vật bậc cao ở nước ta cho biết có hơn 13.000 loài, đến
năm 2002 đã biết được có 2.270 chi và 305 họ trong đó có khoảng 4.000
loài cây được sử dụng làm thuốc [9], và 600 loài cây cho tinh dầu [6].
Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nước.
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về thực vật mà chủ yếu là
nghiên cứu về hóa thực vật. Theo thống kê cho thấy, có khoảng 80%
dân số thế giới tin vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khoẻ. Trong
thập kỉ qua, có gần 121 sản phẩm thuốc được tạo nên dựa trên kiến thức
về y học truyền thống từ các nguồn khác nhau [106]. Có nhiều sản
phẩm thuốc được tạo ra trực tiếp hoặc dẫn xuất hoặc tổng hợp bắt
chước theo bộ khung từ sản phẩm thiên nhiên [9]. Nhiều bệnh nhân
mắc bệnh nan y đặc biệt là ung thư đã được chữa khỏi nhờ sử dụng các
sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên [41]. Đặc biệt trong 20
năm trở lại đây, các hợp chất thiên nhiên còn được sử dụng rộng rãi và
có hiệu quả trong sản xuất các thực phẩm chức năng, bổ sung dinh
dưỡng hay thực phẩm thuốc là các sản phẩm nâng cao sinh lực, phòng
và hỗ trợ điều trị bệnh tật, nâng cao tuổi thọ [8].
Chính vì thế, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên để làm
thuốc chữa bệnh vô cùng quan trọng bởi vì khi sử dụng các loại thuốc
có nguồn gốc từ hoá tổng hợp gây tác dụng phụ và làm cho môi trường
ngày càng ô nhiễm hơn, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên hạn
chế được những nhược điểm đó. Trong đó việc xác định cấu trúc của
chúng là khâu then chốt trong việc giải mã cơ chế tương tác giữa thuốc
với tác nhân gây bệnh.
Ở Việt Nam, các cây thuốc được sử dụng chủ yếu theo kinh
nghiệm, chỉ có khoảng 20-30% số loài được xác minh khoa học về giá
2

trị, cơ chế chữa bệnh và chỉ dùng để chữa các bệnh thông thường: cảm


Đối tượng nghiên cứu của luận án là lá cây na (Annona
squamosa L.) thuộc chi Na (Annona) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodrum
fruticosum Lour.) thuộc chi Dủ dẻ (Melodorum), hai loài này cùng
thuộc họ Na (Annonaceae).
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Với mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, chúng tôi xác định các
nhiệm vụ cần thực hiện gồm:
- Lựa chọn các dung môi thích hợp để chiết được hỗn hợp các
hợp chất từ lá của cây na và lá cây dủ dẻ trâu.
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ các cao thu
được từ lá cây na và lá cây dủ dẻ trâu
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.
5. Những đóng góp mới của luận án
Đây là công trình khoa học báo cáo về thành phần hóa học và
cả về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ lá cây na (Annona
squamosa L.) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.) lần
đầu tiên ở Việt Nam.
- Đã phân lập và xác định cấu trúc của 05 hợp chất ent-kauran
và 02 hợp chất steroit. Trong đó, có một hợp chất ent-kauran ditecpenoit
lần đầu tiên được phân lập từ loài na.
- Từ dịch chiết của lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum
Lour.) đã phân lập và xác định được 01 hợp chất amit thơm mới, 08 hợp
chất flavonoit, 01 hợp chất ancaloit, 01 hợp chất tannin, 02 hợp chất
steroit. Ngoại trừ 02 hợp chất steroit, các hợp chất còn lại đều là các
hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài dủ dẻ.
- Xác định được các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất
amit thơm mới. Các số liệu về tinh thể học của hợp chất này (CCDC
872 187) hiện được lưu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge.
-

2.2.1. Phương pháp chiết tách
Sử dụng các dung môi thích hợp để chiết hỗn hợp các chất từ
cao metanol trích từ lá na và lá dủ dẻ trâu
2.2.2. Sắc kí lớp mỏng
Thực hiện trên bản mỏng đã được tráng sẵn silica gel Merck 60
F
254
, độ dày 0,2 mm. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254
nm và hiện màu với hơi iot
5

2.2.3. Sắc kí cột
Sử dụng phương pháp sắc kí trên cột thông thường với pha
tĩnh là silica gel 70-230/mesh và sắc kí cột pha đảo RP-18.
2.2.4. Kết tinh phân đoạn
Phương pháp kết tinh phân đoạn dùng để làm sạch các hợp
chất thu được ở các phân đoạn sắc kí
2.2.5. Phương pháp xác định cấu trúc
Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để chứng minh cấu trúc
gồm phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (ESI-MS, HR-ESI-
MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (
1
H-NMR,
13
C-NMR,
DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC,
1
H-
1
H-COSY), X-ray và đo độ
Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách cao từ lá na
2.4.2. Phân lập các chất

(*): CC, silica gel; CHCl
3
: CH
3
OH (30:1, 20:1; 10:1; 4:1; 2:1)
(**): CC, silica gel; CHCl
3
: CH
3
OH (25:1, 15:1; 10:1; 4:1; 2:1)
Sơ đồ 2: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá na
- Phân bố trong nước
- Chiết lần lượt với hexan,

3
:CH
3
OH (50:1; 30:1;
20:1; 10:1; 4:1)

ASE1
(1027 mg)
ASE4 (328 mg)
ASE2
(246 mg)
F-6
ASE7
(342 mg)
(*)
(**)
7

2.5. Kết quả nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc các thành phần
hóa học trong lá dủ dẻ trâu
2.5.1. Chiết tách cao

(3 g)
F-3
F-5
F-1
MFH2 (321mg)
CC, silica gel
hexan: axeton (9:1)
CC, silica gel
hexan : axeton (9:1, 5:1, 3:1, 1:1)
F-4 F 6
8 Sơ đồ 5: Quy trình phân lập các chất từ cao etyl axetat của lá dủ dẻ trâu
2.5.2.3. Cao butanol

MFE5 (71 mg), MFE7 (35 mg)
CC, silica gel
hexan:axeton
(19:1, 12:1, 7:1, 3:1, 1:1)
CC, silica gel
hexan:axeton (19:1)
CC, silica gel
hexan:axeton
(15:1, 10:1, 7:1, 5:1)
F-9
(35,7 g)
F-7, -8
Cao butanol (192 g)

CC, silica gel
CHCl
3
:CH
3
OH:H
2
O

(4:1:0,05)
F-1
F-2
F-3
(5,0 g)
F-4
(18,6 g)

(15:1)
MFB13
(
97 mg)
F-5

CC, silica gel
CHCl
3
:CH
3
OH:H
2
O

(9:1:0,05)
F-8,
F-9,
F -10
9

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lá cây na (Annona squamosa L.)
3.1.1. Các hợp chất được phân lập
Cặn chiết etyl axetat từ lá na đã phân lập và xác định được cấu
trúc của 7 hợp chất được kí hiệu từ ASE1 đến ASE7.
Bảng 3.1: Các hợp chất phân lập từ lá cây na

STT


kauran-17,19-dioic
C
20
H
30
O
4
349
4 ASE4
Axit-16-hydro-19-
al-ent-kauran-17-oic
C
20
H
30
O
3
328
5 ASE5
16,17-dihydroxy-
ent-kauran-19-al
C
20
H
32
O
3
294
6 ASE6 β-sitosterol C
29


3.1.3.2. Những đóng góp từ kết quả thu được
Những hợp chất ent-kauran ditecpenoit phân lập được đã từng
tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi Na (Annona) cùng với hai hợp chất
steroit β-sitosterol (ASE6) và -Sitosterol-3-O--D-glucopyranozit
(ASE7) thường bắt gặp trong hầu hết các loài thực vật. Theo thống kê
các tư liệu tham khảo cho thấy hầu hết các hợp chất đã phân lập được
của luận án đều đã từng được phân lập và công bố trên đối tượng cây na
ngoại trừ hợp chất axit 16-hydro-17-axetoxy-ent-kauran-19-oic
(ASE2) chỉ tìm thấy trong các loài khác thuộc chi này. Cấu trúc các
hợp chất tuy đã được xác định nhưng đây là lần đầu tiên các hợp chất
này được phân lập và xác định cấu trúc từ lá na phân bố ở Việt Nam và
cũng là lần đầu tiên kết quả nghiên cứu từ đối tượng lá na Việt Nam
được công bố.
3.2. Lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum fruticosum Lour.)
1
2
3
4
5
6 7
8
9
10

13
14
15
16
17
18
19
20
H

(ASE4) Axit 16-
hydro-19-al-ent-
kauran-17-oic

1
2
3
4
5
6 7
8
9
10
COOH
11
12
13
14
15
16

18
19
20

(ASE1) axit ent-
kaur-16-en-19-oic

2
3
5
7
8
9
10
11
12
13
1
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

3
5
7
8
9
10
11
12
13
1
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
4
6
14
O


3.2.1. Các hợp chất được phân lập
Các cao chiết ứng với dung môi khác nhau gồm: hexan đã phân lập
được 1 hợp chất, cao etyl axetat phân lập được 6 hợp chất và cao butanol
phân lập được 6 hợp chất, các chất với tên cụ thể được nêu ở bảng 3.9.
Bảng 3.9: Danh mục các chất phân lập từ cây dủ dẻ trâu
ST
T
Kí hiệu
hợp chất
Tên hợp chất
Công thức
Phân tử
Khối lượng
h
ợp chất (mg)
1 MFE1
Melodamit A C
17
H
17
NO
3
99
2 MFH2
β-Sitosterol C
29
H
50
O 321
3 MFE3

(Tsugafolin)
C
17
H
16
O
5
58
7 MFE7
5-O-Metylnaringenin
(7,4′-dihydroxy-5-
metoxyflavanon)
C
16
H
14
O
5
35
8 MFB8
Naringenin - 4',7-
dimetylete
C
17
H
16
O
5
39
9 MFB9

Axit 3, 3', 4'-trimetoxy
ellagic
C
17
H
12
O
8
45
13 MFB13
-sitosterol-3-O--D-
glucopyranozit
C
35
H
60
O
6
97
12

3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
3.2.2.1. Hợp chất MFE1
Hợp chất MFE1 đã được phân lập có dạng chất bột không màu,
đ.n.c 183–185°C. Độ quay cực
 
8,28
D

= 0,001 (CH

17
NO
3
N
(hình 3.3)
Trên phổ IR cũng cho thấy sự xuất hiện các pic hấp thụ mạnh đặc
trưng cho dao động hoá trị của nhóm OH (3.441 cm
-1
), N–H (3.257 cm
-1
),
nhóm cacbonyl liên hợp (1.662,3 cm
-1
), C=C
olefin
(1.609,6 cm
-1
) và
C=C
vòng thơm
(1.573,2 cm
-1
) (hình 3.4).
Trên phổ
1
H-NMR, quan sát thấy có tín hiệu tại  8,09 (1H, t,
J=5,5 Hz) được nhận định là tín hiệu đặc trưng của proton nhóm amit
và tín hiệu tại  5,83 (1H, s) là tín hiệu của proton nhóm -OH. Một bộ
gồm 5 proton thơm cho các tín hiệu doublet tại vùng  7,55 ppm với
J=8,5 Hz (có tương tác octo) được gán cho hai proton H-5, H-9 và cụm

trúc của một cyclohexadienon xuất hiện tại tín hiệu H-5'/H-7' (δ 6,09
ppm) và H-4'/H-8' (δ 6,94 ppm) đều có tương quan với C-3' (δ 67,8
ppm) và C-6' (δ 185,2 ppm). Thêm vào đó, các pic giao nhau của H-1'
(δ 3,18 ppm) tương quan với C-1 (δ 164,8 ppm)/C-2′ (δ 39,0 ppm)/C-3′
(δ 67,8 ppm) và của H-2′ (δ 1,83 ppm) với C-1′ (δ 34,2 ppm)/ C-3′ (δ
67,8 ppm)/C-4′ (δ 152,8 ppm)/C-8′ (δ 152,8 ppm), phổ HMBC cho
thấy amit liên hợp và vòng B liên kết với C-1' và C-2' (hình 3.8 – hình
3.17 và bảng 3.10).
Bảng 3.10: Số liệu phổ DEPT và HMBC của hợp chất MFE1
Vị trí 
H
(ppm)

C
(ppm)
HMBC
1

164,8
2 6,56 (1H, d, J = 15,5 Hz)

122,1 C-1, C-3, C-4
14

3 7,39 (1H, d, J = 15,5 Hz) 138,6 C-1, C-2, C-4, C-5, C-9
4 134,9
5 7,55 (1H, d, J = 8,5 Hz)

127,5 C-3, C-7, C-9
6 7,39 (1H, m)

152,8 C-3', C-6'
CONH

8,09 (1H, br s) - C-1, C-1'
3'-OH 5,83 (1H, s) - C-2', C-3', C-4', C-8'

C
(Đo ở 125 MHz trong DMSO-d
6
)
Qua các số liệu phân tích từ phổ đồ của hợp chất MFE1 cho
phép khẳng định đây là hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên
nhiên và được đặt tên là melodamit A.
Hình 3.18: Tương tác HMBC và cấu trúc của Melodamit A (MFE1)
Bên cạnh đó, cấu trúc của hợp chất melodamit A còn được
khẳng định qua kết quả về tinh thể học được xác định bằng nhiễu xạ tia
X. Sau đây là các thông tin về tinh thể của MFE1.
Bảng 3.11: Một số thông số về hình học của tinh thể MFE1
Dữ liệu tinh thể
Hệ tinh thể: monoclinic Dc = 1,283 mg/m
3
Nhóm điểm không gian:
P 1 21/n 1
Z = 4
N
O
O

o
θ = 4,96 – 66,38
o
 = 90,0
o
 = 0,751 mm
-1
V = 1559,44 Å
3
Kích thước tinh thể: 0,18 x 0,15 x 0,12 mm
3

Ghi nhận dữ liệu
Máy nhiễu xạ Bruker
APEX DUO
R
int
= 0,0199
Nguồn bức xạ: fine-focus
sealed tube

R
1
= 0,032 với I > 2 (I)
Phản xạ đã dùng 8662 θ
max
= 66,38
o
Phản xạ tự do 2619 θ
min

PL-64-67) Hình 3.19: Cấu trúc đơn tinh thể nhiễu xạ tia X của melodamit A
3.2.3. Điểm nổi bật từ kết quả phân lập các hợp chất trên lá dủ dẻ trâu
3.2.3.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập
16
23
24
25
26
27
28
29
4
6
14
HO

(MFH2) β-Sitosterol

5
1
2
4
1'
2'
3'
4'
5'
6'
OH
OOH
H
3
CO
3

6
1
2
3
4
OCH
3
OCH
OOH
H CO
3
3
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7
8
9

(MFE3) Flavokawain A

5
1
2
4
1'
2'

9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'

(MFE6) Tsugafolin hay
4',5-dimetoxy-7-hydroxyflavanon)

OH
HO O
OOCH
3
1
2
34
5
6
7
8
9
1'
2'
3'
4'
5'
6'

1
3
2
45
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
HO
O
HO
HO
CH
3
1''
2''
3''
4''
5''
6''
1'''
2'''

2
3
4
5
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
OH
HO
OH O
O
O
O
OH
HO
HO
O
HO
HO
HO

3
'
'
4
'
'
5
'
'
6
'
'(MFB10) Rutin

17


'
4
'
5
'
6
'
2
3
5
7
8
9
10
11
12
13
1
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

7
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'

(MFB12) 3, 3', 4'-
trimethoxy ellagic acid

N
O
O
O
OH
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
11a
1a
1b

Dòng tế bào
Cell survival (%)
T
T
KH
mẫu
Nồng
độ
(g/ml)
Hep-G2 Lu MCF-7
Kết luận
DMSO
100,0  0,0

100,0  0,0

100,0 0,0 Chứng
(+)
5
0,0  0,0 1,3  0,1 1,5  0,06
Dương tính

1
ASE1
5
16,5  0,08
61,1  0,7

KH mẫu
Hep-G2 Lu MCF-7
Kết luận
Chứng (+) 0,256 0,305 0,287 Dương tính
1 ASE1 3,140 > 5 1,799
Dương tính với
dòng Hep-G2
và MCF-7
2 ASE5 > 5 > 5 2,594
Dương tính với
dòng MCF-7
Hợp chất ASE5 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư vú (MCF-7)
với IC
50
là 2,594, còn hợp chất ASE1 ức chế mạnh dòng tế bào ung thư
gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC
50
tương ứng là 3,14
và 1,799. Như vậy, hai hợp chất này đều có khả năng ức chế mạnh các
dòng tế bào ung thư, trong đó, cả hai hợp chất ASE1 và ASE5 đều ức
chế được tế bào ung thư vú, nhưng hợp chất ASE1 có khả năng ức chế
mạnh hơn hợp chất ASE5 vì IC
50
(ASE1) < IC
50
(ASE5).
3.3.2. Hoạt tính tạo ra các anion peroxit và giải phóng elastase
Trong các hợp chất sạch được phân lập từ lá dủ dẻ trâu
(Melodorum fruticosum Lour.) có 8 hợp chất gồm: MFE1, MFE3,
MFE7, MFE4, MFE6, MFB8, MFB10, MFB12 được tiến hành thử

MFE8 (7,69 ± 5,72) (-4,54 ± 1,44)
*
MFB10 (39,46 ± 2,29)
***
(10,06 ± 4,75)
MFB12 (3,08 ± 0,88)
*
(14,91 ± 5,97)
Sorafenib
b
3,44 ± 0,29 1,00 ± 0,60
SB202190
b
6,73 ± 0,65 (5,53 ± 3,50)
Percentage of inhibition (Inh %) ở nồng độ 10 µM. Các kết quả được biểu thị
bằng giá trị trung bình ± SEM (n =3).
*
p < 0,05,
**
p < 0,01,
***
p < 0,001 so sánh với giá trị đối chứng.
a
Nồng độ
cần thiết để ức chế 50% (IC
50
).
b
Sorafenib tosylate và SB202190 được sử dụng làm
chất đối chứng dương.

tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự tạo thành O
2
-

khi cho
bạch cầu trung tính phản ứng với formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-
phenylalanin/cytochalasin B (FMLP/CB), trong số 8 hợp chất được thử
hoạt tính, có 3 hợp chất gồm melodamit A (MFE1), flavokawain A
(MFE3), 2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4) thể hiện hoạt
tính kháng viêm. Đặc biệt nhất là hợp chất MFE1 lần đầu tiên được
phân lập từ thiên nhiên nên hoạt tính kháng viêm của MFE1 cũng là
lần đầu tiên được công bố. Khả năng kháng viêm của hợp chất MFE3
đã được biết đến dựa trên khả năng ức chế sự giải phóng iNOS, COX-2,
NO và PGE
2
khi được kích thích bởi lipopolysaccharides (LPS) qua thử
nghiệm trên đại thực bào chuột [59], nhưng là lần đầu tiên được tiến
hành khảo khát khả năng kháng viêm theo phương pháp này. 22

KẾT LUẬN

Lần đầu tiên ở Việt Nam, có công trình khoa học báo cáo về
thành phần hóa học và cả về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ
lá cây na (Annona squamosa L.) và lá cây dủ dẻ trâu (Melodorum

 Hợp chất axit ent-kaur-16-en-19-oic (ASE1) có khả năng
gây độc dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7),
còn hợp chất 16,17-dihydroxy-ent-kauran-19-al (ASE5) chỉ gây độc
dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), trong đó, hợp chất ASE1 gây độc tế
bào ung thư vú mạnh hơn ASE5.
 Hợp chất melodamit A (MFE1), flavokawain A (MFE3) và
2,6’-dihydroxy-4’-metoxychalcon (MFE4) có khả năng ức chế sự
tạo thành các anion peroxit trên bạch cầu trung tính của người được
hoạt hóa bởi FMLP/CB cùng với khả năng ức chế bằng con đường ức
chế đánh dấu bởi p38 MAPK từ đó cho thấy chúng có hoạt tính chống
viêm nhiễm.