ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA TRẦN THU HƯỜNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN
Saccharomyces cerevisiae VÀ Pichia CỦA NANO BẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khoá học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2010 - 2014

Thái Nguyên, năm 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA TRẦN THU HƯỜNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MEN
Saccharomyces cerevisiae VÀ Pichia CỦA NANO BẠC

Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm cùng gia đình và bạn bè đã hết
lòng quan tâm hỗ trợ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt
khóa luận này.
Dù đã cố gắng nhiều, xong bài khóa luận không thể tránh khỏi những
thiếu sót và hạn chế. Kính mong nhận được sự chia sẻ và những ý kiến đóng
góp quý báu của thầy cô giáo và các bạn.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn tất cả!
Thái Nguyên, tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Ma Trần Thu Hường


DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu

Tên đầy đủ

CFU

Colony Forming Unit

S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

h

Giờ

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh
đông khô [20]. ................................................................................................. 17
Bảng 2.2: Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô [20]................. 18
Bảng 3.4: Nồng độ dung dịch nano bạc pha loãng đối kháng ........................ 31
Bảng 4.1: Một số đặc điểm của nấm men nghiên cứu .................................... 34
Bảng 4.2: Phương pháp xác định hoạt tính kháng nấm men .......................... 35
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng............................ 37
kháng nấm men ............................................................................................... 37
Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men .............. 38


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn ............. 9
Hình 2.2: Saccharomyces cerevisiae .............................................................. 17
Hình 2.3: Nấm men Pichia.............................................................................. 20
Hình 4.1: Xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc .......................... 35
bằng các phương pháp khác nhau ................................................................... 35
Hình 4.2: Hình ảnh đối kháng của nano bạc với nấm men trên đĩa thạch ...... 37
Hình 4.3: Khả năng kháng nấm men S. cerevisiae của nano bạc ................... 39
Hình 4.4: Khả năng kháng nấm men Pichia của nano bạc ............................. 40


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu nghiên cứu .................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................... 3

3.4.1. Phương pháp xác định đặc điểm của VSV nghiên cứu......................... 28
3.4.2. Phương pháp xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc .......... 29
3.4.3.

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men .. 32

3.4.4. Theo dõi khả năng kháng nấm men của dung dịch nano bạc
theo thời gian ................................................................................................... 33
3.4.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật .............................................. 33
3.4.6.

Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ............................................. 33

PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 34
4.1. Một số đặc điểm của VSV nghiên cứu .................................................... 34
4.2. Lựa chọn phương pháp xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc ....... 34
4.3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men ......... 36
4.4. Xác định khả năng kháng nấm men của nano bạc theo thời gian ............ 38
4.4.1. Khả năng kháng S. cerevisiae của nano bạc theo thời gian .................. 38
4.3.2. Khả năng kháng nấm men Pichia của nano bạc theo thời gian ............ 39
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 42
5.1. Kết luận .................................................................................................... 42
5.1. Đề nghị ..................................................................................................... 42


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

tác dụng của chất kháng sinh đã được nghiên cứu [15].
Saccharomyces cerevisiae và Pichia là hai loại nấm men thường gặp
trong thực phẩm. Ngoài những lợi ích đã biết, hai chủng nấm men trên còn là
một trong các tác nhân gây hư hỏng thực phẩm, cần loại bỏ trong một số quy
trình chế biến.. Nấm men Saccharomyces có thể làm hỏng nước ép trái cây,
lên men chua các loại thực phẩm có nguồn gốc từ đường, sữa. Rượu vang
thành phẩm có Pichia phát triển tạo màng trên bề mặt và làm vang bị đục, các
thành phần trong vang sẽ bị biến đổi [10]. Mặt khác, hai chủng nấm men được
sử dụng trong nghiên cứu là các chủng phân lập từ thực vật bản địa, chưa từng
được nghiên cứu và đánh giá về sự tác động của nano bạc.
Chính vì vậy, để bổ sung cơ sở dữ liệu về hạt nano bạc, phục vụ sản xuất
chế phẩm kháng vi sinh vật từ nano bạc, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài
“Nghiên cứu khả năng kháng nấm men Saccharomyces cerevisiae và
Pichia của nano bạc”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của
nano bạc.
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
- Lựa chọn được phương pháp thích hợp để xác định khả năng kháng
nấm men S. cerevisiae và Pichia của nano bạc.
- Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với nấm men S.
cerevisiae và Pichia.
- Đánh giá được khả năng kháng nấm men S. cerevisiae và Pichia của
nano bạc theo thời gian.


3

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học

một khoảng từ vài nm đến vài trăm nm phụ thuộc vào bản chất vật liệu và tính
chất cần nghiên cứu.
Có rất nhiều cách phân loại vật liệu nano. Sau đây là một cách phân loại
dựa vào hình dáng vật liệu [6]:
- Vật liệu không chiều là vật liệu mà ba chiều đều có kích thước nano, ví
dụ: chấm lượng tử...


5

- Vật liệu một chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví
dụ: dây nano,ống nano,…
- Vật liệu hai chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví
dụ: màng mỏng,…(Chiều ở đây có nghĩa là chiều chuyển động không bị hạn
chế bởi kích thước của phần tử tải điện).
Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano trong đó chỉ có một phần của
vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có các phần không chiều, một
chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau.
2.1.1.3. Cơ sở khoa học của công nghệ nano
Công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính [23]:
- Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử:
Khác với vật liệu khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử
được thể hiện rất rõ ràng. Vì vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần
tính tới các thăng giáng ngẫu nhiên. Càng ở kích thước nhỏ thì các tính chất
lượng tử càng thể hiện một cách rõ ràng hơn. Ví dụ một chấm lượng tử có thể
được coi như một đại nguyên tử, nó có các mức năng lượng giống như một
nguyên tử.
- Hiệu ứng bề mặt:
Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano chúng có diện tích bề
mặt lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối. Điều này, có ý nghĩa rất

tuần hoàn các nguyên tố hóa học, bạc có khối lượng phân tử là 107,868 (đơn vị C).
+ Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1, có số oxi
hóa là +1 và +2, phổ biến nhất là trạng thái oxi hóa +1.
+ Bạc không tan trong nước, môi trường kiềm nhưng có khả năng tan
trong một số axit mạnh như axit nitric, sunfuric đặc nóng,...
Ngày nay những thuộc tính quý của kim loại này được thể hiện tối đa
khi chúng được chế tạo bằng công nghệ nano.


7

2.1.3. Giới thiệu về hạt nano bạc
2.1.3.1. Giới thiệu chung
Trong số các loại hạt nano được nghiên cứu, ứng dụng thì hạt nano bạc
đã gây được sự chú ý đặc biệt bởi tính chất kháng khuẩn vượt trội. Ở kích
thước nano, bạc thể hiện những tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác biệt
và vô cùng quý giá, đặc biệt là tính kháng khuẩn. Ở dạng phân tán với kích
thước nanomet thì khả năng diệt khuẩn của bạc được tăng lên gấp bội nhờ
diện tích bề mặt riêng (m2/g) tăng nhanh. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích
thước nano (từ 1 – 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng
50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1g bạc nano có thể sát khuẩn cho
hàng trăm m2 chất nền [8].
Quá trình hình thành hạt nano bạc được giải thích như sau [7]:
- Đầu tiên, bức xạ UV kích thích các ion [Ag(NH3)2]+ hoạt động. Khi đó
các phân tử đường glucose nhường điện tử cho Ag+ và tạo ra hạt nhân nguyên
tử bạc Ag0
[Ag(NH3)2]+ + RCHOH
nAg0

hν

này [6].
- Tính chất điện: Bạc là một kim loại dẫn điện tốt nhất trong các kim
loại. Bạc có mật độ điện tử tự do cao nên điện trở của bạc rất nhỏ.
- Tính chất nhiệt: Nhiệt độ nóng chảy Tm của vật liệu phụ thuộc vào
mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi
một nguyên tử có một số các nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số
phối vị. Các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn số phối vị
của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể
ở trạng thái khác hơn. Như vậy, khi kích thước của hạt nano giảm, nhiệt độ
nóng chảy sẽ giảm [6].
- Hiệu ứng bề mặt: Khi hạt bạc có kích thước nanomet, các số nguyên
tử nằm trên bề mặt sẽ chiếm tỉ phần đáng kể so với tổng số nguyên tử. Chính
vì vậy các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt, gọi tắt là hiệu ứng bề mặt sẽ trở


9

nên quan trọng làm cho tính chất của vật liệu có kích thước nm khác biệt so
với vật liệu bạc ở dạng khối. Sự tăng cường khả năng diệt khuẩn bạc là một ví
dụ của hiệu ứng bề mặt [6].
2.1.4. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của ion
Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican – thành phần cấu
tạo nên thành tế bào vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên
trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Sau đó sẽ đi vào bên trong tế bào vi
khuẩn tác động lên S và P, chìa khóa cho khả năng diệt khuẩn của nó [18, 26].
Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoạt động của
vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có thành tế bào, vì vậy
chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.
Vì S và P xuất hiện nhiều trong màng tế bào nên khi hạt nano bạc tương

và phá vỡ cấu trúc nano. Vì vậy chúng ta cũng cần tìm nồng độ thích hợp để
các hạt phân bố đồng đều, và tránh kết tủa [5].
2.1.6. Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc
Có 2 phương pháp điều chế hạt nano bạc kim loại: phương pháp từ dưới
lên và phương pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên “bottom-up” là
phương pháp tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau
[15]. Phương pháp từ trên xuống “top-down” là phương pháp tạo các hạt
nano từ vật liệu khối ban đầu. Đối với hạt nano bạc, người ta thường điều chế


11

bằng phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là khử ion Ag+ thành Ag. Các ion
này sau đó liên kết với nhau tạo thành hạt nano và các hạt nano này sẽ được
bọc bởi các chất ổn định như PVP, PVE, chitosan... Các phương pháp từ trên
xuống ít được sử dụng vì nano bạc chế tạo bằng phương pháp này thường có
kích thước hạt lớn và không đồng đều.
Các phương pháp chế tạo hạt nano bạc thường sử dụng:
- Phương pháp ăn mòn laze: Phương pháp này sử dụng chùm tia laze
với bước sóng ngắn bắn lên vật liệu khối đặt trong dung dịch có chứa chất
hoạt hóa bề mặt. Các hạt nano được tạo thành với kích thước khoảng 10 nm
và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt.
- Phương pháp khử hóa học: Phương pháp này sử dụng các tác nhân
hóa học để khử ion kim loại thành kim loại. Để các hạt phân tán tốt trong
dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh
điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng
phương pháp bao bọc bằng chất hoạt hóa bề mặt. Các hạt nano tạo thành bằng
phương pháp này có kích thước từ 10 nm đến 100 nm.
- Phương pháp khử vật lý: Phương khử vật lí dùng các tác nhân vật lí
như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamm, tia tử ngoại, tia laser

- Màng hô hấp: Đó là một tấm màng mỏng có thể cho khí và hơi nước
qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua, có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại
trong tấm film. Các hạt nano bạc gần đây đã được kết hợp với film polyolefin
với đặc tính kháng khuẩn rất tốt.
- Sơn kháng khuẩn: Bột nano bạc được trộn với sơn và phủ lên các phím
điện thoại di động, tường nhà và các bề mặt cần được bảo vệ. Với khả năng
kháng khuẩn tuyệt vời nano bạc sẽ giữ cho bề mặt không bị nhiễm khuẩn
cũng như tiêu diệt nấm mốc làm tăng tính thẩm mỹ và tuổi thọ công trình.


13

- Thiết bị điện tử: Các nhà khoa học cũng đang nghiên cứu ứng dụng
nano bạc để sản xuất linh kiện điện tử phục vụ nhu cầu ngày càng cao của
người tiêu dùng. Các thiết bị điện tử ứng dụng công nghệ nano sẽ có kích
thước nhỏ gọn hơn nhưng lại có tốc độ xử lý và tuổi thọ cao hơn các thiết bị
sử dụng các công nghệ truyền thống.
2.2. Tổng quan về nấm men
2.2.1. Khái quát chung về nấm men
Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống
riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu
bằng hình thức nảy chồi [11].
Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi phụ thuộc vào từng loại nấm
men, điều kiện nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Do đó nấm men có hình thái đa
dạng như: hình trứng, hình bầu dục (S. cerevisiae), hình tròn (Candida utilis),
hình ống dài (Pichia), hình quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình
bình, hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác. Hình dạng
nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại
cảnh. Ví dụ, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong môi trường nuôi
cấy giàu dinh dưỡng. Trong điều kiện yếm khí thường có hình tròn, trong điều


25 – 50%

Nitơ

4,8 – 12 %

Protein (N × 5,25)

30 – 75

Lipid

2–5

Chất khô của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7%
chất tro [10].
Nấm men là sinh vật tự dưỡng, chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như
là nguồn năng lượng chính và không cần ánh sáng mặt trời. Nguồn cacbon
chính được nhận chủ yếu từ các hexose như glucose và fructose hoặc từ
disaccharide như saccarose và maltose. Một vài loài có thể chuyển hóa đường
pentose, cồn và các acid hữu cơ. Nấm men phát triển tốt nhất trên môi trường
pH trung tính hoặc hơi chua. Nhiệt độ phát triển của nấm men cũng hoàn toàn
khác nhau. Leucosporidium frigidum phát triển ở -2 - 20ºC, Saccharomyces
telluris phát triển từ 5 – 35ºC, Candida slooffi ở 28 – 45ºC,… Các tế bào có


15

thể sống trong điều kiện đóng băng ở điều kiện nhất định, khả năng sống sót

chúng sinh ra hai tế bào dinh dưỡng có nhiệm vụ giống như các giao tử. Hai
tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành
các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử được phát tán ra ngoài. Nếu 2 tế
bào nấm men có hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được
gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp
dị giao.
Nấm men có thể coi là đại diện tiêu biểu trong vai trò tổng hợp protein từ
vi sinh vật, đó là các protein đơn bào (SCP – Single Cell Protein). Nấm men
bắt đầu được sử dụng để tổng hợp một số protein có phân tử lớn mà trước đây
vẫn được sản xuất từ mô tế bào của người hoặc động vật, ví dụ nấm men
Pichia pastoris dùng để sản xuất protein là tác nhân chống gây khối u tương
tự như TNF, Streptokinaza, kháng nguyên bề mặt, hoocmôn sinh trưởng loại
IL 2, Interferongama [4].
Nấm men phân bố rộng trong tự nhiên: đất, nước, không khí, thực
phẩm,... Nó có vai trò quan trọng trong chuyển hóa vật chất, nhiều loại được
sử dụng rộng rãi để nấu rượu, bia, cồn, glyxerin, làm nở bột mì, tạo hương vị
nước chấm, sản xuất một số dược phẩm. Nấm men sinh sản nhanh chóng,
sinh khối giàu protein, chứa nhiều vitamin nên được sử dụng rộng rãi trong
ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung dinh dưỡng [11]. Tuy nhiên bên
cạnh những nấm men có ích cũng còn một số loại nấm men gây bệnh cho
người, gia súc như nấm men Candida albicus,... và rất dễ nhiễm vào các sản
phẩm lương thực và thực phẩm làm hỏng hoặc biến đổi chất lượng sản phẩm
như Torulopsis, Zygosaccharomyces, Rhodotorula... [1, 9, 11].


17

2.2.2. Nấm men S. cerevisiae
Phân loại khoa học:
- Giới: Fungi


Acid nucleic

6 – 8%

Lipid

4 – 5%

Chất khoáng

7 – 8%