§¹i häc Th¸i Nguyªn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN VĂN CHIỂN
Tên đề tài:
″NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA MỘT SỐ
GIỐNG ĐẬU DẢI (Cowpea - Vigna unguiculata (L.)) PHỤC VỤ
CHO TẠO GIỐNG MỚI″

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2010 – 2014

Thái Nguyên - 2014


§¹i häc Th¸i Nguyªn

chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Thị Thúy, phó Viện trưởng Viện Di Truyền Nông
Nghiệp. Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn tôi trong toàn bộ
quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới cô ThS. Lương Thị Thu Hường khoa CNSHCNTP, trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, giúp tôi thực tập và hoàn
thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hoàng Thị Giang, ThS. Nguyễn
Thị Huế đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập khóa luân tại phòng thí
nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di Truyền Nông
Nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị làm việc tại phòng thí
nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di Truyền Nông
Nghiệp, đã giúp đỡ và tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập.
Tôi xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy cô giảng
dạy tại khoa CNSH – CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn,
giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên và tạo
mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Thái Nguyên, ngày 01 tháng 06 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Văn Chiển


DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

ADN

: Acid deoxyribonucleic

BAP


IM

: Môi trường nền

LSD

: Least Significant Difference Test

MS

: Murashige and Skoog’s, 1962

MSB
NAA

: MS salts + B5 vitamins
: α - Naphlene axetic acid

USDA

: United States Department of Agriculture


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Kết quả so sánh hiệu quả khử trùng bằng các hóa chất khác nhau
với thời gian xử lý khác nhau ........................................................ 16
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới
khả năng tái sinh cây đậu dải ......................................................... 18
Bảng 4.3. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh in vitro

2.1.5. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây đậu dải ............................. 6
2.2. Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào ......... 8
2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ......................................................... 8
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa................................................................ 8
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật ................. 9
2.3.1. Auxin ....................................................................................................... 9
2.3.2. Cytokinin ............................................................................................... 10
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ...................................................................................................... 11
3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu ............................................ 11
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 11
3.1.2. Hóa chất sử dụng và phạm vi nghiên cứu ............................................. 11
3.1.3. Thiết bị sử dụng..................................................................................... 11


3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................ 11
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 11
3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 12
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu đến khả
năng nảy mầm của một số giống đậu dải (Vigna unguiculata (L.)) ..... 12
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới khả năng tái
sinh in vitro một số giống đậu dải ........................................................ 13
3.4.3. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của loại mô cấy và chất điều hòa sinh
trưởng đến tái sinh in vitro.................................................................... 14
PHẦM 4: KẾT QUẢ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................. 16
4.1. Kết quả thí nghiệm 1 xác định phương pháp khử trùng mẫu ................. 16
4.2. Kết quả thí nghiệm 2 nghiên cứu ảnh hưởng của mốt số môi trường cơ
bản đến khả năng tái sinh in vitro ......................................................... 17
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của loại mô cấy và chất điều hòa sinh
trưởng đến khả năng tái sinh, nhân chồi. .............................................. 20

biến ở thị trường châu Á. Đậu dải được trồng phổ biến ở các vùng khí hậu
nóng ấm, nửa khô hạn như các nước châu Phi, Ấn Độ, Mexico, miền Nam
nước Mỹ. Việt Nam cũng thuộc vùng sinh thái thích hợp cho nhóm đậu này,
tuy nhiên lâu nay chúng ta vẫn phải nhập thêm đậu từ nước ngoài. Nghiên cứu
giải pháp gia tăng sản lượng đậu dải trong nước sẽ mang lại ích lợi kinh tế
cho đất nước, cải thiện sức khỏe cộng đồng.
Đậu dải có khả năng chịu hạn, cải tạo đất tốt hơn đậu cô ve (Phaseolus
vulgaris) do có bộ rễ ăn sâu hơn và cố định đạm mạnh hơn. Tuy nhiên theo
nghiên cứu nước ngoài, năng suất canh tác (trọng lượng thu hoạch từng đơn
vị diện tích) của các giống đậu dải hiện nay chỉ đạt 20-30% so với năng suất
thực thụ. Nguyên nhân gây giảm năng suất là do sâu bệnh như tuyến trùng,
bệnh thối rễ, nấm hại lá, côn trùng (bọ xít, rệp, sâu ăn lá...), thời tiết bất
thường v.v... (Duke , 1990) [14]. Việt Nam cũng không nằm ngoài những yếu


2

tố bất thuận này. Việc chọn tạo các giống đậu có khả năng chống chịu sẽ giúp
cải thiện năng suất đồng thời giảm thiểu sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón, góp
phần tăng hiệu quả canh tác, bảo vệ môi trường.
Để phục vụ cho công tác chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào đặc biệt là
chọn giống thông qua chuyển gen và đột biến tế bào sôma, tạo ra giống mới có
khả năng chống chịu, kháng bệnh, kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài ″Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống
đậu dải (Cowpea - Vigna unguiculata (L.)) phục vụ cho tạo giống mới″.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xác định được điều kiện nuôi cấy in vitro phù hợp cho tái sinh một số
giống đậu dải.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định phương pháp khử trùng cho tỉ lệ nảy mầm cao.

Mỹ, Châu Á nhiệt đới (Ấn Độ, Bangladesh, Thái Lan, Việt Nam, Indonesia,
Malaysia, Philippines) và Châu Á ôn đới (Trung Quốc, Đài Loan) (Rachie và
cs, 1985) [24].
Đậu đũa bắt nguồn từ một trong bốn loài phụ của đậu cowpea (Vigna
unquiculata) được trồng nhiều ở Trung Quốc; vùng Đông Nam Châu Á như
Thái Lan, Philippines; Nam Châu Á như Bangladesh, Ấn Độ, Pakistan,
Indonesia và mở rộng sang Châu Phi (Rachie và cs, 1985) [24].
Đậu đũa là loại rau phổ biến ở thị trường Châu Á, nhu cầu của thị trường
nước ngoài trong những năm gần đây là tiêu thụ quả tươi và đông lạnh. Phẩm
chất quả dựa trên màu sắc và chiều dài quả. Tuy nhiên, yêu cầu nhập khẩu
đậu đũa rất thay đổi tùy mỗi thị trường (Rachie và cs, 1985) [24].
2.1.2.Phân loại
Phân loại khoa học (Rachie và cs, 1985) [24]:
Giới (regnum)
Plantae
Bộ (ordo)
Đậu (Fabales)
Họ (familia)
Đậu (Fabaceae)
Chi (genus)
Vigna
Loài (species)

V. unguiculata

Phân loài (subspecies)

Vigna unguiculata subsp. Sesquipedalis

Trong Hệ thống Cronquist năm 1981 và một số hệ thống phân loại thực

- Thân: Thân bò, leo quấn, có góc cạnh, không lông, mắt thân thường có
màu tím.
- Lá: Lá kép 3 lá phụ với cuống dài, lá mọc xen kẽ, mặt lá ít lông tơ.
- Hoa: Phát hoa mọc ở nách lá, hoa màu vàng hay xanh lơ mọc thành
chùm ở đỉnh. Tràng hoa có 5 cánh rời, nhụy đực gồm 9 dính + 1 rời, bầu noãn
với 12 - 21 noãn. Hoa lưỡng tính, tỉ lệ thụ phấn chéo bởi côn trùng rất thấp
trong điều kiện khí hậu khô, nhưng trong điều kiện ẩm ướt tỉ lệ này có thể
tăng đến 40%.
- Quả: Quả giáp dài 20-100 cm, đường kính tròn, quả non thẳng, láng,
mềm; quả già co thắt lại, chứa 10 - 30 hạt. Quả tươi có giá trị dinh dưỡng
tương đối cao, giàu protein, chất bột đường và vitamin A.
- Hạt: Hạt hình quả thận, màu sắc và kích thước thay đổi.


5

Đậu đũa thích khí hậu nóng, nhiệt độ ban ngày thích hợp là 25 - 35oC và
nhiệt độ ban đêm không dưới 15oC. Đậu đũa phản ứng với độ dài ngày không
rõ rệt nhưng thiên về cây ngày ngắn. Đậu mọc tốt ở vùng đồng bằng và nơi có
cao độ trung bình, ở cao độ cao > 700m so với mặt nước biển sự ra hoa của
đậu bị hạn chế nhất là vào mùa có thời tiết lạnh.
Đậu đũa trồng được thích hợp trên đất nhiều hữu cơ, pH từ 5,5 - 6.
Đậu đũa chịu hạn giỏi đồng thời tăng trưởng tốt trong mùa mưa ẩm độ
cao. Nhu cầu nước cả vụ là 6 - 8 mm/ngày. Trồng trong mùa nắng có tưới đậu
mọc tốt như trong mùa mưa.
Sau khi nẩy mầm cây tăng trưởng nhanh, ra hoa 35 ngày sau khi gieo và
bắt đầu cho thu hoạch quả tươi 2 tuần sau khi hoa nở. Tùy theo sự tăng trưởng
và cường độ thu hái, cây ra hoa, kết trái kéo dài 1.5 - 2 tháng và cây tàn 3 - 4
tháng sau khi trồng (Rachie và cs, 1985) [24].
2.1.4. Giá trị của cây đậu dải (đậu đũa) (Vigna unguiculata (L.))


Niacin (vit. B3)

0,41 mg (3%)

Axit pantothenic (B 5)

0,55 mg (11%)

Vitamin B 6

0,024 mg (2%)

Folate (vit. B 9)

62 mg (16%)


6

Vitamin C

18,8 mg (23%)

Canxi

50 mg (5%)

Sắt


protein cho người và gia súc. Hạt đậu chứa 20-30% protein và gần 60%
carbohydrate (Aguirre và cs, 1998) [5]. Trong nghiên cứu của Castro và cs,
(2002) [11] cho thấy trong hạt đậu có nhiều sinh tố nhóm B, nhiều sắt và kali.
2.1.5. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây đậu dải
Trong các nghiên cứu trên câu đậu dải thường sử dụng hạt đậu dải làm
nguồn vật liệu nghiên cứu. Trong nghiên cứu Bao và cs, (2006) [7] sử dụng
cồn 70o NaClO cho tỉ lệ nảy mầm cao và tỉ lệ nhiễm thấp. Trong nghiên cứu
của Diallo và cs (2008) [13] sử dụng phương pháp khử trùng bằng NaClO
cùng HCl để khử trùng một số giống đậu dải Châu Phi cũng cho tỉ lệ nảy
mầm cao và tỉ lệ nhiễm thấp.
Khả năng tái sinh in vitro của đậu dải phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như
kiểu gen, loại mô và kích thước mô cấy, thành phần môi trường nuôi cấy, các
chất điều hòa sinh trưởng, chất kết đông môi trường v.v. Trong nghiên cứu
của Brar và cs, (1999) [9] cho thấy rõ ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng
tái sinh chồi từ lá mầm. Trong 36 giống đậu dải dùng làm nguồn vật liệu thì


7

chỉ có 17 giống có khả năng tái sinh với hiệu quả dao động từ 1% tới 11%.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng mắt lá mầm bao gồm cả hai lá mầm cho hiệu
quả tái sinh cao nhất, sau đó đến mắt lá mầm kèm 1 lá mầm (Chaudhury và
cs, 2007 [12]; Diallo và cs, 2008 [13]). Khi cắt bỏ lá mầm khỏi mắt lá mầm
thì tỷ lệ tái sinh giảm đi rõ rệt. Ngoài ảnh hưởng của loại mô cấy, một số
nghiên cứu cũng ghi nhận rằng tỷ lệ tái sinh phụ thuộc vào kích thước của mô
cấy (Hinchee và cs, 1988 [16]; Van Le và cs, 2002 [27]). Các môi trường
được sử dụng trong nghiên cứu khả năng tái sinh của đậu dải thường là MS
(Manoharmin và cs, 2008 [18]; Bao và cs, 2006 [7]), B5 (Muthukumar và cs,
1995 [21]; Diallo và cs, 2008 [13]) và MSB (muối MS và vitamin B5)
(Chaudhury và cs, 2007 [12]; Mao và cs, 2006 [19]). Diallo và cs, (2008) [13]

nhau một cách đáng kể giữa các kiểu gen nghiên cứu. Tuy nhiên, những kiểu
gen cho tỷ lệ tái sinh cao nhất lại không cho hệ số nhân chồi cao nhất (Brar và
cs, 1999) [10]. Một số nghiên cứu gần đây cũng khẳng định sự ảnh hưởng của
kiểu gen tới khả năng phát sinh đa chồi ở mẫu cấy là mô phân sinh mắt
(Chaudhury và cs, 2007 [12]; Adebola và cs, 2008 [4]). Gần đây hơn,
Manoharmin và cộng sự (2008) [18] đã công bố quy trình tái sinh in vitro từ
mô phân sinh ngọn của 4 loại kiểu gen đậu dải khác nhau. Các nhà nghiên
cứu này đã cải tiến hệ thống tái sinh bằng cách bổ sung nồng độ BA cao vào
môi trường nảy mầm hạt và giảm nồng độ BA xuống thấp hơn trong quá trình
tái sinh chồi để thu được phản ứng tái sinh giống nhau ở cả bốn kiểu gen và
chứng minh được quy trình tái sinh đậu dải không phụ thuộc vào kiểu gen
(Manoharmin và cs, 2008 [18]).
2.2. Cở sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào
2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng
của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp mỗi tế
bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế
bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện
nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ (Trịnh Đình Đạt, 2009) [1].
2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào


9

thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào
(Trịnh Đình Đạt, 2009) [1].
2.3. Một số chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Auxin


10

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid
(IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự
hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphthalene axetic
acid (NAA) và 2,4 - Diclophenoxy acid (2,4 D). Các chất này cũng đóng vai trò
quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có
tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh
hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng
đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ (Vũ Văn
Vụ, 2009) [2].
2.3.2. Cytokinin
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia
tế bào. Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6 - Benzyl aminopurin (BA).
Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetin. Kinetin và BA cùng
có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào
phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác
dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và
làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở
mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin
với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histone với ADN, tạo điều
kiện cho sự tổng hợp ADN (Vũ Văn Vụ, 2009) [2].

3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu
đến khả năng nảy mầm của một số giống đậu dải.


12

Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới khả
năng tái sinh in vitro của một số nguồn gen đậu dải đại diện.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại mô cấy (nốt lá mầm không
kèm lá mầm, nốt lá mầm kèm 1 lá mầm, lát cắt nốt lá mầm), chất điều hòa
sinh trưởng đến sự tái sinh in vitro.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu đến
khả năng nảy mầm của một số giống đậu dải (Vigna unguiculata (L.))
Trong nghiên cứu này sử dụng các hóa chất là: NaClO, HCl, cồn 70º.
Các phương pháp khử trùng sử dụng là:
- CT 1: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 3,5% trong 5 phút
Cách tiến hành:
Hạt đậu được rửa bằng cồn 70º trong 1 phút để sơ loại các mầm bệnh và
tăng hiệu quả khử trùng. Sau đó đổ bỏ cồn và ngâm hạt vào 70% dung dịch
khử trùng sodium hypochlorite nồng độ 3,5% với thời gian là 5 phút.
Cuối cùng, rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Cấy mẫu vào môi
trường nảy mầm (MS).
- CT 2: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 3,5% trong 10 phút
Cách tiến hành:
Tiến hành như CT1 nhưng sử lý với thời gian 10 phút
- CT 3: Khử trùng bằng cồn 70º và NaClO 5% trong 5 phút
Cách tiến hành:
Tiến hành như CT1 nhưng sử dụng dung dịch khử trùng sodium

Σ số mẫu nhiễm
Σ số mẫu cấy

x 100%

Σ số mẫu nảy mầm
Σ số mẫu cấy không
nhiễm

x 100%

+ Ký hiệu sử dụng
CT: Công thức.
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường cơ bản tới khả năng
tái sinh in vitro một số giống đậu dải
Thí nghiệm tiến hành trên 3 loại môi trường cơ bản có bổ sung BAP 0,5
mg/l và phytagel 0,4 g/l:
- CT 1: Môi trường MS
- CT 2: Môi trường B5
- CT 3: Môi trường MSB (muối MS + vitamins B5)
+ Cách tiến hành: Cả 3 công thức thí nghiệm trên đều thực hiện theo
quy trình nuôi cấy sau:
Nốt lá mầm cắt từ cây đậu dải con 4 – 5 ngày tuổi (thí nghiệm: Nghiên
cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu đến khả năng nảy mầm
của một số giống đậu dải (Vigna unguiculata (L.)) sẽ được cấy vào môi
trường tái sinh chồi (môi trường cơ bản MS, B5, MSB) theo hướng trụ dưới lá


14


- Công thức 5: MSB+ BAP 3 mg/l
+ Cách tiến hành:
Nốt lá mầm cắt từ cây con 4 – 5 ngày tuổi sẽ được cấy vào môi trường
tái sinh chồi, môi trường nền có bổ sung nồng độ (0,1; 0.5; 1; 2 và 3 mg/l)
BAP; theo hướng thẳng đứng, thời gian nuôi cấy 2 tuần. Giữ nguyên 2 lá
mầm trên nốt lá mầm, chỉ cắt bỏ trụ dưới lá mầm và trụ trên lá mầm cách 2
mm trên và 3-5 mm dưới vị trí mắt lá mầm. Sau 2 tuần, cắt bỏ 2 chồi nách và


15

cắt bớt callus phát sinh, chuyển mẫu cấy sang môi trường tái sinh chồi mới.
Nuôi cấy thêm 2 tuần.
Sau thời gian tái sinh, chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi
với nền môi trường MS và bổ sung 0,1 mg/l BAP. Thời gian nuôi cấy là 2
tuần. Sau đó cấy chồi tái sinh sang môi trường ra rễ (1/2 MS).
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 9 công thức,
mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại cấy 10 mẫu/công thức.
- Chỉ tiêu đánh giá:
Σ số mẫu tái sinh
Tỷ lệ tái sinh(%)=
x 100%
Σ số mẫu cấy
Σ số chồi
Hệ số nhân chồi =
Σ số mẫu cấy
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng Kinetin
- Công thức 1: MSB + Kinetin 0.1 mg/l
- Công thức 2: MSB+ Kinetin 0.5 mg/l

Bảng 4.1. Kết quả so sánh hiệu quả khử trùng bằng các hóa chất khác
nhau với thời gian xử lý khác nhau
Giống

Đậu
đen

IT95M190

CT

Hoá chất

Số mẫu
cấy (chồi)

1
2
3
4

Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 5 phút
Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 10 phút
Cồn 70o +5% NaClO trong 5 phút
Cồn 70o +5% NaClO trong 10 phút

60
60
60
60


0,33

1

Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 5 phút

60

22,00

96,00

2

Cồn 70o + 3,5% NaClO trong 10 phút

60

14,00

96,00

3

Cồn 70o +5% NaClO trong 5 phút

60

0


Qua bảng 1 ta thấy rằng khử trùng hạt bằng dung dịch NaClO nồng độ
3,5% chưa đủ mạnh để diệt sạch hết mầm bệnh. Ở cả hai giống đậu đen quốc
phòng Cao Bằng và IT95M-190 với hóa chất này thời gian xử lý 5 phút, 10


17

phút đều cho tỷ lệ mẫu cấy bị nhiễm khá cao là 26,00% (CT1), 10,64% (CT2)
và 22,00% (CT1), 14,00% (CT2). Với các công thức khử trùng còn lại thu
được mẫu cấy ở giai đoạn nảy mầm vô trùng 100%. Như vậy kết quả nghiên
cứu cho thấy rằng ở cả hai giống đậu đen quốc phòng Cao Bằng và IT95M190 CT5 (NaClO 5% + HCl trong 16 giờ) cho hiệu quả cao nhất, mẫu sạch
100%, tỷ lệ hạt nảy mầm cao (94,00% và 97,87%). Nhưng giá thành hóa chất
sử dụng trong phương pháp này lại là cao. Phương pháp khử trùng bằng Cồn
70o +5% NaClO trong 5 phút thì cũng cho mẫu sạch 100% và tỉ lệ nảy mầm
cao chỉ sau phương pháp sử dụng NaClO 5% + HCl trong 16 giờ với 92,00%
(giống đậu đen quốc phòng Cao Bằng) và 93,75% (ở giống IT95M-190), giá
thành hóa chất lại thấp hơn. Nên phương pháp khử trùng bằng Cồn 70o +5%
NaClO trong 5 phút là phương pháp phù hợp nhất cho khử trùng một số
giống đậu dải nghiên cứu.
4.2. Kết quả thí nghiệm 2 nghiên cứu ảnh hưởng của mốt số môi trường
cơ bản đến khả năng tái sinh in vitro
Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với tất cả các nguồn gen nghiên cứu tỷ lệ
tái sinh trên cả ba nền môi trường đều rất cao (bảng 4.2). Tỷ lệ tái sinh đạt
100% ở cả 3 công thức đối với giống Đậu đen quốc phòng Cao Bằng. Trên
nền môi trường MS và MSB tỷ lệ tái sinh của các giống gần như không có
khác biệt. Nghiên cứu ở giống Đậu thúa đắm Nghệ An kết quả cho thấy khả
năng tái sinh của nốt lá mầm trên môi trường B5 thấp hơn đáng kể so với môi
trường MS và MSB, với tỷ lệ tái sinh tương ứng là 86,67% (CT2). Ở giống
IT95M-190, cả 3 công thức đều cho tỉ lệ tái sinh là 93,33%.


(mẫu)

sinh

(%)

(chồi)

Đậu đen

Đậu thúa
đắm

IT95M-190

Hệ số
nhân
chồi
(lần)

MS

30

30

85

100


MS

LSD.05
30

30

114

100

0,15
3,80

B5

30

26

125

86,67

4,81

MSB

30


30

28

34

93,33

1,20

MSB

30

28

78

93,33

2,79

CV%

6

LSD.05

0,26