BỘ Y TẾ
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ DỮ LIỆU CHUẨN
CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THƯỜNG DÙNG
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA GIÁM SÁT
CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU VÀ THUỐC ĐÔNG DƯỢC Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Tựu
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Tựu
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương
Cấp quản lý: Bộ Y tế
Thời gian thực hiện: Từ tháng 8/2006 đến tháng 1/2009
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 400 triệu đồng
Trong đó: Kinh phí SNKH 400 triệu đồng NĂM 2009
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
1. Tên đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường
dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược
2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Tựu
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương
4. Cơ quan qu
ản lý đề tài: Bộ Y tế
5.Thư ký đề tài: ThS. Phạm Thị Giảng
6. Danh sách những người thực hiện chính:
− TS. Nguyễn Văn Tựu: Chủ nhiệm đề tài
− PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu: Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

CHCl
3
Cloroform
DAD Diode array Detector (detector chuỗi Diod)
DĐVN III Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ ba
ELSD Evaporative light - scattering detector (Detector tán xạ ánh sáng
bay hơi)
EA Ethyl acetat
EtOH Ethanol
FTIR Fourier Transform Infrared Spectra (Phổ hồng ngoại chuyển hóa
Fourier)
GACP Good Agricultural and Collection Practice (Thực hành nuôi trồng
và thu hái tốt)
GC Gas chromatography (Sắc ký khí)
GC-MS Gas chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí khối phổ)
GSP Good Store Pratice (Thực hành bảo quản tốt)
HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng
cao)
HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao)
IR Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồ
ng ngoại)
JP The Japanese Pharmacopoeia, Fourteeth Edition (Dược điển Nhật )
MS Mass Spectra (Phổ khối)
MeOH Methanol
NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
µm
Micromet
µl
Microlit

2.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu xâ
y
dựn
g
dữ liệu chuẩn
của các dược liệu ……………………………………………

6
2.2
Tổng quan về một số phương pháp liên quan…………… 7
2.2.1 Phương pháp cảm quan ……………………………………… 7
2.2.2 Phương pháp sử dụng kính hiển vi …………………………… 8
2.2.2.1. Phương pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu 8
2.2.2.2. Phương pháp soi bột dược liệu 8
2.2.3. Một số phương pháp sắc ký ……………………………………. 8
2.2.3.1. Phương pháp TLC và phương pháp HPTLC 8
2.2.3.2 Phương pháp HPLC 10
2.2.3.3. Phương pháp GC 12
2.3. Tổng quan về một số nhóm h
ợp chất chính thườn
g

g
ặp
trong dược liệu ………………………………………………

14
2.3.1 Terpenoid …………………………………………………… 15
2.3.1.1 Monoterpen và sesquiterpen………………………………… 15
2.3.1.2 Mono và diterpenoid glycosid …………………………………. 16

2.6.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế iridoid glycosid và
geniposid ……………………………………………………….
33
3
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… 34
3.1.
Thiết kế nghiên cứu ………………………………………… 34
3.2
Chọn m
ẫu, cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu ……………… 34
3.2.1. Chọn mẫu ………………………………………………………. 34
3.2.2. Cỡ mẫu …………………………………………………………. 34
3.2.3. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………… 34
3.2.4. Các chất chuẩn đối chiếu hoặc chất đánh dấu 35
3.3.
Phương pháp nghiên cứu …………………………………… 36
3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu ………………………………………… 36
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu …………………………………… 36
3.4.
Trang thiết bị, dung môi hóa chất ………………………… 47
4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN …………… 48
4.1
Thu thập, xác định tên khoa học mẫu dược liệu chu
ẩn ……. 48
4.2. Theo dõi,bảo quản và lưu giữ các mẫu dược liệu nghiên cứu
48
4.3 Phân tích các đặc điểm vi học và thành phần hóa học của
các dược liệu …………………………………………………


4.3.29. Thăng ma 338
4.3.30. Trần bì 347
4.4 Phương pháp chiết tách, tinh chế emodin, hesperidin và
geniposid từ các dược liệu nghiên cứu để làm chuẩn …….…

358
4.4.1 Chiết tách, tinh chế emodin từ thân rễ đại hoàng …………… 358
4.4.2 Chiết tách và tinh chế hesperidin từ trần bì ………………… 361
4.4.3. Chiết tách và tinh chế geniposid từ
quả dành dành ………… 365
5
KẾT LUẬN …………………………… 369

TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………… 372
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả xác định tên khoa học của 30 dược liệu
nghiên cứu Phụ lục 2: Một số thuốc thử đã dùng để phát hiện các nhóm chất
và cách pha Phụ lục 3: Quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn của dược liệu

Phụ lục 4: Quy trình chiế
t xuất, phân lập và tinh chế hesperidin
từ trần bì

− Xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của 30 dược liệu đã thu thập được khác v
ới
các dược liệu đã được nghiên cứu trước đây về cùng khía cạnh nghiên cứu,
qua đó đưa ra quy trình thiết lập bộ dữ liệu chuẩn từ dược liệu nói chung.
− Bộ dữ liệu bao gồm 30 mẫu dược liệu được định danh đúng và các đặc điểm
về hình thái bên ngoài, bột, vi phẫu và các đặc điểm hóa học đặc trưng thông
qua các sắc ký đồ dấu vân tay. D
ữ liệu được lưu dưới dạng atlas nên có tính
khách quan và khoa học.
− Lần đầu tiên đề tài đã kết hợp nhiều phương pháp và kỹ thuật phân tích khác
nhau từ các kỹ thuật thường quy như TLC đến các kỹ thuật hiện đại như
HPTLC, HPLC với detector UV-VIS và detector DAD, ELSD, GC và GC-
MS, có so sánh với các chất đối chiếu tinh khiết.
− Chiết xuất, phân lập được 3 chất đối chiếu: Hesperidin, geniposid và emodin
từ các dược liệu trầ
n bì, dành dành và đại hoàng đạt yêu cầu về độ tinh khiết
làm chuẩn.
− Dùng các chất đối chiếu đã phân lập được để làm chuẩn so sánh trong phân
tích định tính trần bì, dành dành và đại hoàng bằng phương pháp TLC,
HPLC.

b. Kết quả cụ thể
− Đưa ra mẫu dược liệu đúng của 30 dược liệu và các dữ liệu (hình ảnh về hình
thái, vi phẫu, bột, sắc ký đồ TLC, HPLC, GC)
− Xây dựng được phương pháp chi
ết và phân tích TLC, HPLC và GC để xác
định đặc điểm “dấu vân tay” đặc trưng của từng dược liệu.
− Xây dựng được quy trình chiết xuất, phân lập 3 chất đối chiếu từ các dược
liệu nghiên cứu.
− Sản phẩm của 3 chất đối chiếu đã chiết xuất và phân lập đạt yêu cầu tinh

− Đã công bố được 2 bài báo trên tạp chí Kiểm nghiệm thuốc.

d. Hiệu quả về kinh tế
Kết quả nghiên cứu của đề tài được lưu lại dưới dạng hình ảnh có thể là tư
liệu tham khảo thay thế trong trường hợp thiếu dược liệu chuẩn khi kiể
m tra chất
lượng dược liệu. Các sản phẩm phân lập được từ dược liệu có thể dùng làm
chuẩn phòng thí nghiệm, tiết kiệm hơn khi mua chuẩn.

e. Hiệu quả về mặt xã hội
Kết quả của đề tài có thể được ứng dụng vào công tác kiểm tra, giám sát
chất lượng dược liệu, qua đó, góp phần quản lý tốt chất lượng dược liệu và chế
phẩm
đông dược, hạn chế tình trạng dược liệu giả mạo hiện nay
f. Hiệu quả khác
Đề tài góp phần bổ sung nguồn dữ liệu vào kho dữ liệu chuẩn của dược
liệu lưu hành tại Việt Nam, làm cơ sở cho việc xây dựng, soát xét các chuyên
luận của Dược điển Việt Nam. 2. ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỄN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI
Kết qu
ả nghiên cứu của đề tài đã và đang được áp dụng trong phân tích,
kiểm tra chất lượng dược liệu và các thành phẩm đông dược tại Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương và hệ thống kiểm tra giám sát chất lượng thuốc trong
cả nước góp phần nâng cao chất lượng đông dược và thuốc đông dược. BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________


4. CÁC Ý KIẾN ĐỀ XUẤT
− Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài và quy trình thiết lập dữ liệu
chuẩn của dược liệu, có thể tiếp tục nghiên cứu áp dụng trên nhiều dược liệu
khác
− Triển khai ứng dụng nghiên cứu chỉ thị ADN của dược liệu để bổ sung dữ
liệu về đặc tính di truyền, giúp cho việc định danh và
định tính dược liệu
được chính xác hơn.
− Từ các kết quả nghiên cứu của một số đề tài về chuẩn dược liệu và dấu vân
tay sắc ký, hội đồng Dược điển nên tập hợp toàn bộ những dữ liệu chuẩn này
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
4
để tiến tới hoàn chỉnh bộ dữ liệu chuẩn của dược liệu lưu hành tại Việt Nam
và làm cơ sở xây dựng, sóat xét và thẩm định một số chuyên luận dược liệu.
− Tiếp tục triển khai nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ dược liệu với quy mô
lớn hơn để cung cấp nguồn chuẩn cho các cơ sở kiểm tra, giám sát chất lượng
dượ
c liệu và thuốc đông dược. PHẦN B- NỘI DUNG CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, việc sử dụng thuốc từ dược liệu có xu hướng
gia tăng trên phạm vi toàn cầu, không chỉ đối với phần đông dân số ở các nước
đang phát triển mà còn cả ở những nước phát triển. Ở Mỹ, số đơ
n thuốc có sử
dụng hoạt chất từ dược thảo chiếm 25% tổng số đơn thuốc pha chế tại cửa hàng;

ăng lực phòng kiểm tra chất lượng đông dược, dược liệu. Song đối với việc
kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và kiểm tra chất lượng dược liệu nói riêng,
bên cạnh trang thiết bị hiện đại, cần phải có chất chuẩn đối chiếu.
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
5
Mặt khác, đối với dược liệu,muốn áp dụng tiêu chuẩn DĐVN III để định
tính, định lượng các hoạt chất hoặc chất đặc trưng, cần phải có chuẩn dược liệu
hay chất đối chiếu hóa học là hoạt chất hay chất đặc trưng của dược liệu đó để
so sánh mà những chuẩn này thực tế còn thiếu chưa đáp ứng được. Vì thế, việ
c
kiểm tra chất lượng dược liệu ở nhiều nơi chủ yếu chỉ dừng lại ở mức độ cảm
quan, dựa vào kinh nghiệm hay làm một số phản ứng hoa học thông thường nên
kết quả đánh giá chất lượng còn hạn chế. Hiện nay, đã có một số công trình
nghiên cứu của Viện Dược liệu, Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trường Đại
họ
c dược [4,16,22] nhằm cung cấp những dữ liệu chuẩn về dược liệu khắc
phục phần nào những khó khăn về chuẩn. Song các công trình nghiên cứu này
mới chỉ khảo sát trên một số dược liệu với một số khía cạnh nhất định như vi
phẫu, bột, TLC hoặc HPLC và còn hàng trăm dược liệu khác chưa được khảo sát
hoặc khảo sát chưa đầy đủ. Ngoài ra, đã có không ít đề tài nghiên c
ứu chiết xuất
và phân lập được các chất đặc trưng từ dược liệu, một số ít trong đó có thể dùng
làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc nhưng nhìn chung việc nghiên cứu
chiết xuất, phân lập hoạt chất từ dược liệu nhằm đạt yêu cầu làm chuẩn vẫn còn
ít, chưa đáp ứng được nhu cầu về chất chuẩn trong kiểm nghiệm thuốc có nguồ
n
gốc từ dược liệu.
Để góp phần phát triển, bổ sung thêm nguồn dữ liệu chuẩn của các dược
liệu thường dùng và chất đối chiếu từ dược liệu phục vụ việc kiểm tra giám sát

− Từ kết quả nghiên cứu đưa ra quy trình thiết lập dữ liệu chuẩn cho một dược
liệu.
− Chiết xuất, phân lập và tinh ch
ế 3 chất hesperidin, emodin và geniposid từ
trần bì, đại hoàng và dành dành để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm
nghiệm đông dược dược liệu. Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

2. TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về tình hình nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của các
dược liệu
Để tiến hành nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu, vấn đề đầu tiên có tính
chất quyết định là phải đả
m bảo tính đúng của dược liệu, có nghĩa là dược liệu
đó phải được định danh đúng tên, đúng loài, đúng bộ phận dùng [24]. Cần tiêu
chuẩn hóa và ghi lại các đặc điểm về hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột, các đặc
điểm hóa học đặc trưng để thể hiện tính đúng đó. Tập hợp những đặc điểm thể
hiện tính đúng của dược liệu
được coi là dữ liệu chuẩn của dược liệu. Dữ liệu
chuẩn có thể góp phần làm căn cứ để định tính, phòng chống giả mạo, nhẫm lẫn,
tiêu chuẩn hóa, kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng.
Do đó, việc nghiên cứu xây dựng dữ liệu chuẩn của dược liệu đã và đang được
chú ý nhiều không chỉ ở nước ta mà còn ở các nướ
c trên thế giới.
Trước kia, trong các chuyên luận dược liệu, để định tính dược liệu, dược
điển các nước chỉ đưa ra yêu cầu về đặc điểm hình thái bên ngoài, vi phẫu, bột
của dược liệu và một số phản ứng hóa học đặc trưng bằng phản ứng trong ống
nghiệm hoặc bằng kỹ thuật TLC. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ
thu
ật,việc sử dụng kỹ thuật số để chụp lại ảnh của dược liệu hay đặc điểm vi
phẫu, bột dược liệu dưới kính hiển vi làm dữ liệu chuẩn về mặt thực vật của

nhất Atlas TLC của 170 dược liệu và đến năm 2001 xuất bản lần 2 với 230 dược
liệu [93].
Năm 2002, Pulok K Mukhejee, khoa Công nghệ Dượ
c phẩm, trường Đại học
Jadavpur, Kolkata, Ấn Độ đã nghiên cứu đưa ra các hình ảnh về đặc điểm hình
thái và sắc ký đồ TLC của các chất đặc trưng của 25 vị dược liệu ở Ấn Độ [78].
Trung Quốc là một nước đóng góp nhiều công trình khoa học nghiên cứu
về dược liệu, đặc biệt về lĩnh vực phân tích đặc điểm hóa học, đặc
điểm di
truyền, thiết lập dấu vân tay hóa học, dấu vân tay ADN coi đó là phương tiện
hữu hiệu để so sánh, phân loại, định tính và đánh giá chất lượng dược liệu
[33,71,105,106]
Năm 2005, Hồng Kông Trung Quốc đã xuất bản tập 1 bản tiêu chuẩn của
8 dược liệu trồng tại Hồng Kông, tiếp đó 7/2008 tập 2 ra đời với 24 chuyên luận
dược liệu. Các chuyên luận này bao gồm những hình
ảnh về hình thái bên ngoài,
vi phẫu, sắc ký đồ của HPLC phân tích các chất đặc trưng đại diện cho các dược
liệu trong tiêu chuẩn [38].
Ở nước ta, việc nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng đã được Bộ Y
tế quan tâm, chỉ đạo nhiều, đặc biệt trong mấy năm gần đây, đã có không ít các
đề tài nghiên cứu về vấn đề này đã công bố hoặc đang trong giai đoạn thực hiệ
n.
Năm 2002, Nguyễn Viết Thân đã cho ra mắt tập 1 quyển “Kiểm nghiệm
dược liệu bằng phương pháp hiển vi”, trong đó có ảnh màu chụp cây thuốc, vị
thuốc, vi phẫu, bột của 100 dược liệu [20]. Năm 2005, Trịnh Văn Quỳ và cộng
sự đã công bố các dữ liệu chuẩn bao gồm ảnh chụp vị thuốc,vi phẫu, bột và sắc
ký đồ TLC của 25 dược liệ
u và sắc ký đồ HPLC, GC-MS của 11 dược liệu [16].
Tiếp theo, Nguyễn Kim Bích và cộng sự đã phân tích dấu vân tay TLC của 20
dược liệu [4], Nguyễn Thị Bích Thu đã phân tích dấu vân tay HPLC của 10

Là phương pháp sử dụng kính hiển vi để nhận biết các đặc điểm của các
mô, tế bào, hoặc các chất chứa trong tế bào, ở các lát cắt, bột, các mô đã được
làm rã ra hoặc các tiêu bản bề mặt của dược liệu. Phương pháp thông dụng nhất
là phương pháp soi vi phẫu và soi bột.

2.2.2.1. Phươ
ng pháp cắt, nhuộm và soi vi phẫu
Cắt dược liệu thành những lát mỏng theo chiều ngang hoặc dọc bằng lưỡi
dao cạo, ống cắt vi phẫu cầm tay hay máy cắt vi phẫu, đem soi ngay lát cắt hoặc
xử lý lần lượt với cloramin T 5%, cloral hydrat, dung dịch acid acetic 1%, nước
cất rồi nhuộm với dung dịch xanh methylen và dung dịch đỏ carmin, sau đó soi
dưới kính hiển vi.

2.2.2.2. Phương pháp soi bột dược liệu
Nghiền dược liệu thành b
ột mịn, cho một lượng nhỏ bột vào một giọt
dung dịch soi như nước cất, glycerin, cloral hydrat trên lam kính, khuấy kỹ và
cẩn thận bằng kim mũi mác, đậy lam kính, di nhẹ rồi quan sát dưới kính hiển vi

2.2.3. Một số phương pháp sắc ký
2.2.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao (HPTLC)
TLC là một phương pháp tách mà trong đó pha tĩnh là một chất rắn thích
hợp (có thể là silicagel, silicagel đã silan hóa, nhôm oxyd, cellulose ) đượ
c trải
thành một lớp mỏng,mịn và đồng nhất trên bề mặt phiến kính, kim loại hay
nhựa; pha động là một chất lỏng gồm một hay nhiều dung môi phối hợp với
nhau. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được chấm riêng biệt trên cùng một
đường thẳng trên bản mỏng. Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển
qua pha tĩnh mà trên đó đã đặt các chất cần tách. Các thành phần trong hỗn hợp

nhiệt độ phân tích, lượng mẫu phân tích Vì vậy, để so sánh thườ
ng phải triển
khai song song với dung dịch chuẩn [2,55]
Hiện nay, mặc dù đã có nhiều kỹ thuật sắc ký hiện đại hơn nhưng TLC
vẫn là một phương tiện có hiệu quả trong phân tích các thuốc thảo dược từ việc
nghiên cứu sàng lọc ban đầu cho đến bán định lượng và định lượng vì đây là
một kỹ thuật đơn giản và rẻ tiền nhất, có thể áp dụng được vớ
i hầu hết các hợp
chất tự nhiên. Do đó, TLC là kỹ thuật chủ yếu được WHO và dược điển các
nước áp dụng trong kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phẩm của chúng
[2,77,103].
Tuy nhiên TLC có độ nhậy và độ phân giải chưa cao, hiện nay người ta đã
cải tiến TLC thành HPTLC. Sự khác nhau cơ bản giữa TLC thông thường và
HPTLC là cỡ hạt và lỗ xốp của chất hấp phụ. V
ới HPTLC, chất hấp phụ có cỡ
hạt nhỏ (2 - 10µm) và bản mỏng có độ dày nhỏ hơn (khoảng 100 - 200 µm)
trong khi TLC thông thường dùng chất hấp phụ có cỡ hạt và khoảng phân bố lớn
hơn (5 - 25µm), độ dày của bản mỏng thường ≥ 250µm. Nhờ cỡ hạt nhỏ, lớp
chất hấp phụ mỏng kết hợp với việc sử dụng công nghệ
tinh xảo và tự động nên
HPTLC có khả năng phân giải, độ nhậy cao, lượng mẫu và dung môi ít, khoảng
di chuyển của dung môi ngắn (5 – 6 cm), thời gian phân tích nhanh. Các chất
hấp phụ thường được dùng trong các bản mỏng hiệu năng cao tráng sẵn hiện nay
là silicagel và C
18
với độ dày 100 µm. Để định tính, định lượng các thành phần
phân tích được tách ra, người ta quét bản mỏng qua thiết bị scanner, một hệ
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
10

⎢ ⎢
Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và
pha động phân cự
c, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là
dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật
RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau. Cột
thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10µm. Để cải thiện khả
năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng
nhanh (UFLC) vào ứng dụng rộng rãi. Trong UFLC, kích thước hạt ch
ất mang
nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 µm) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm).
Có nhiều loại detector khác nhau như detector tử ngoại – khả kiến (UV-
VIS),tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa trong đó detector
chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong
một quá trình sắc ký và đồng thời đo phổ của chất phân tích ở nhiều bước sóng
cùng lúc, cho phép so sánh phổ để định tính.
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
11
Để định tính một chất người ta so sánh thời gian lưu của pic chất đó trên
sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của pic chất chuẩn trên sắc ký đồ
của dung dịch chuẩn. Đồng thời ta cũng sử dụng thời gian lưu tương đối (RRT)
của một pic để xác định pic đó, thời gian lưu tương đối của một pic được tính
toán dựa trên thờ
i gian lưu của pic được chọn để đánh dấu theo công thức sau:
Thời gian lưu của pic so sánh
RRT =
Thời gian lưu của pic đánh dấu
Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột

ải nhỏ hơn 1%.
− Pic có độ tinh khiết cao (≥ 95,0%).
− Diện tích pic phải tương đối lớn (thông thường phải >1% tổng diện tích các
pic chính).
− Độ phân giải với các pic cạnh không nhỏ hơn 1,0.
Trong số các pic đặc trưng này ta chọn ra một pic là pic đánh dấu (thông
thường là pic của chất đối chiếu), tính toán thời gian lưu tương đối (RRT) của
các pic còn lại so với pic đánh dấu theo công thức đã nêu trên và đư
a ra bảng dữ
2
5,0
22
54,516
⎥
⎥
⎦
⎤
⎢
⎢
⎣
⎡
=
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
=
⎥

bb
RR
tttt
R

BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
12
liệu về các pic đặc trưng trong sắc ký đồ của dược liệu. Bảng dữ liệu này cùng
với sắc ký đồ chuẩn là dấu vân tay HPLC của dược liệu theo điều kiện sắc ký đã
qui định.

2.2.3.3. Phương pháp sắc ký khí (GC)
Với ưu điểm về độ nhạy, độ phân giải và độ lặp lại cao, ngày nay sắc ký
khí được áp dụng rộng rãi trong phân tích nói chung và phân tích dược phẩm nói
riêng. S
ắc ký khí là phương pháp chia tách trong đó pha động là 1 chất khí
(được gọi là khí mang) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng
phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của
cột. Tuỳ thuộc bản chất pha tĩnh chia thành hai loại sắc ký khí:
− Sắc ký khí rắn (gas solid chromatography - GSC): chất phân tích được hấp
phụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn.
− Sắ
c ký khí lỏng (gas liquid chromatography - GLC): pha tĩnh là 1 chất lỏng
không bay hơi.
Tương tự sắc ký lỏng, các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký khí
cũng bao gồm thời gian lưu, hệ số dung lượng, độ phân giải, số đĩa lý thuyết,
chiều cao đĩa lý thuyết Cấu tạo máy sắc ký khí gồm hệ thống cung cấp khí,
buồng tiêm mẫu, cột phân tích, detector, bộ phận phân tích xử lý dữ liệu.
Khí mang dùng cho sắc ký phải là khí tr

phần nhỏ đi vào cột, phần còn lại qua van chia dòng thoát ra ngoài. Ở chế độ
tiêm không chia dòng, van chia dòng đóng lại trong 1 khoảng thời gian xác định
sau khi tiêm, mẫu đi thẳng vào cột và chỉ thoát ra ngoài khi van chia dòng mở.
Buồng tiêm này thích hợp với các loại cột sắc ký khí mao quản, đặc biệt cần
thiết với những cột có đường kính trong rất nhỏ. Thông số quan trọng nhất cần
chú ý của buồng tiêm chia dòng là tỷ lệ chia dòng, tỷ lệ này ph
ụ thuộc vào nồng
độ của mẫu phân tích và tính chất cột tách. Với mẫu phân tích có nồng độ lớn,
hoặc/và cột tách có đường kính trong, độ dày lớp pha tĩnh nhỏ thì tỷ lệ chia dòng
lớn; và ngược lại.

Cột tách sắc ký khí là phần trung tâm, quan trọng nhất của 1 hệ thống sắc ký nói
chung. Cột sắc ký khí được chia làm 2 loại: cột nhồi thường có đường kính
trong từ 2 - 4mm, cột mao quản có đường kính trong từ 0,1 - 0,53mm. Ngày nay
cộ
t mao quản được sử dụng rộng rãi hơn vì hiệu suất tách của cột và sự đa dạng
của pha tĩnh so với cột nhồi. Có thể tưởng tượng cột mao quản như một ống
hình trụ rỗng ở giữa (open tubular), thành trong cột có chứa pha tĩnh là các tiểu
phân rắn (PLOT), hoặc pha tĩnh là 1 chất lỏng không bay hơi được phủ lên thành
phía trong của cột (WCOT) hay phủ lên các hạt chất mang dạ
ng rắn (SCOT).
Pha tĩnh dùng cho cột sắc ký khí gồm có pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng. Các pha
tĩnh lỏng gồm có các nhóm cơ bản như các hydrocarbon, các ether, ester; các
muối hữu cơ dạng lỏng, poly(siloxane)… trong đó các polysiloxane được sử
dụng rộng rãi nhất.
Khi lựa chọn cột tách phải dựa trên các thông số cơ bản của cột gồm có pha tĩnh,
chiều dài và đường kính trong của cột, độ dày của lớp pha tĩnh, nhiệt
độ tối đa.
Hiệu suất tách (độ phân giải) lớn hơn với cột có đường kính trong và độ dày lớp
pha tĩnh nhỏ hơn. Tuy nhiên nhiệt độ tối đa của cột, dung lượng mẫu và thời

S, NO, NO
2
, SO
2
, HCOOH
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
14
Detector cộng kết điện tử (Electron Capture Detector - ECD) hoạt động dựa trên
đặc tính của các chất có khả năng cộng kết điện tử tự do trong pha khí. Bộ phận
chính của ECD là buồng ion, tại đây diễn ra các quá trình ion hóa, bắt giữ điện
tử và tái liên hợp. Độ nhạy của ECD phụ thuộc chủ yếu vào khả năng cộng kết
điện tử của các chất phân tích. Các hợp ch
ất có khả năng bắt giữ điện tử lớn như
các hợp chất dị nguyên, hợp chất có chứa nhóm chức hay các đa liên kết, đặc
biệt là các chất có các nguyên tử halogen cho đáp ứng tốt với ECD. Là detector
có độ nhạy rất cao, vì vậy rất phù hợp với yêu cầu phân tích lượng vết các hợp
chất có chứa halogen, các thuốc trừ sâu, diệt cỏ

Hiện nay Detector khối phổ (Mass Selective Detector) cũng
được sử dụng rộng
rãi do không những có độ nhạy cao và đáp ứng với hầu hết hợp chất hữu cơ mà
còn đưa ra phổ khối lượng đặc trưng của từng chất phân tích, cho phép xác định
các chất dựa vào phổ khối lượng. Phổ khối của 1 chất biểu diễn mối tương quan
giữa đáp ứng của các ion được tạo thành và tỷ lệ khối lượ
ng / điện tích (mass to
charge, m/z) của nó. Detector khối phổ gồm có 3 phần chính: buồng ion hóa,
phân tích khối và bộ phận phát hiện.
Có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau trong đó được dùng phổ biến
nhất là ion hóa do va chạm điện tử (Electron Impact - EI) và ion hóa hóa học

hữu cơ Trong đó, một số nhóm chất như anthranoid, saponin, flavonoid,
coumarin, tanin, glycosid tim, momo và diterpenoid glycosid còn được xếp vào
nhóm glycosid do cấu trúc của các chất thuộc nhóm này gồm phần đường liên
kết với phần không
đường.
Các tác giả Wagner H., Bladl S [93] lại phân loại các nhóm chất theo
phương pháp phát hiện chúng bằng TLC, gồm các nhóm chính như alcaloid,
anthaglycosid, chất đắng, glycosid tim, coumarin, tinh dầu, flavonoid, arbutin,
lignan
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
15
Việc phân nhóm theo cách này hay cách khác cũng chỉ mang tính chất
tương đối, do tính đa dạng của các hợp chất thiên nhiên, một chất thuộc nhóm
này có khi lại cũng được xếp vào nhóm khác. Ví dụ chất wedelolacton có trong
sài đất và cỏ nhọ nồi có thể được xếp vào nhóm isoflavonoid hay nhóm
coumarin; một số chất vừa có cấu trúc khung steroid vừa chứa nitơ dị vòng nên
có thể được xếp vào nhóm saponin steroid hay alcaloid [2,4]
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến một số nhóm ch
ất
chính có liên quan như terpenoid (tinh dầu, mono và diterpenoid glycosid)
alcaloid, hợp chất phenol (flavonoid, coumarin, lignan, anthranoid), saponin.
Mỗi nhóm chất chỉ giới thiệu một cách tổng quát về khái niệm, sự phân loại của
từng nhóm chất cũng như tính đa dạng và phức tạp của chúng là cơ sở tạo nên
các đặc trưng riêng của từng thành phần chất trong tự nhiên.
Những tính chất có liên quan đến việc chiết, tách và phát hiện các nhóm
chất sẽ được trình bày ở ph
ần phương pháp nghiên cứu.

2.3.1. Terpenoid [1,4,9,25]

farnesen trong tinh dầu gừng.
Dẫn chất nhân thơm của tinh dầu như aldehyd cinamic trong tinh dầu quế,
eugenol trong tinh dầu hương nhu và tinh dầu đinh hương, anethol trong tinh
dầu hồi
BCKQ Đề tài cấp bộ 2006-2009
________________________________________________________________________
16

2.3.1.2. Mono và diterpenoid glycosid
Monoterpenoid glycosid gồm những glycosid mà bộ khung của phần
aglycon được cấu tạo từ 2 đơn vị isopren. Trong cây, các monoterpenoid
glycosid được gặp nhiều nhất là nhóm Iridoid, cho đến nay, người ta đã biết đến
trên 600 chất. Khung cơ bản gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng
hydropyran. Iridoid gồm các nhóm:
- Iridoid có aglycon đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid, gardosid trong
quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá kim ngân
(Lonicera japonica Thunb.)
- Iridoid không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol trong sinh địa
(Rehmania glutinosa (Gaertn.) Libosch.
- Iridoid trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại (Plumeria rubra L.
var acutifolia (Poir) Bailay).
Diterpenoid glycosid gồm nh
ững glycosid mà bộ khung của phần aglycon
được cấu tạo bởi 4 đơn vị isopren. Một số hợp chất thuộc loại này như steviosid
và những glycosid khác trong cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.,
darutosid trong hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.)…
Ngoài dạng glycosid, diterpen còn có thể tồn tại dạng tự do như tanshinon
I,IIA,IIB, miltiron, salviol và các diterpen khác có trong đan sâm (Salvia
miltiorrhiza Bunge.).


Sapogenin của saponin triterpen là các triterpenoid, có 30 carbon, rất khác
nhau về cấu trúc hóa học, phân loại chủ yếu dựa vào số lượng vòng hydrocarbon
nên được chia làm 2 nhóm lớn là saponin triterpenoid pentacyclic (có 5 vòng) và
saponin triterpenoid tetracyclic (có 4 vòng). Nhóm pentacyclic lại được chia
thành 4 nhóm nhỏ gồm olean, ursan, lupan và hopan, trong đó, nhóm olean
chiếm phần lớn trong số các saponin triterpennoid trong tự nhiên. Phần aglycon
của nhóm olean phổ biến là dẫn chất của 3-β hydroxy olean 12–ene, gọ
i là β-
amirin, ví dụ acid oleanolic, hederagenin Nhóm saponin triterpenoid
tetracyclic được chia thành 5 nhóm gồm damaran, cycloartan, lanostan,
cucubitan và β-onoserin. Đại diện nhóm damaran là các saponin của nhân sâm
(Panax Ginseng C.A. Mey) như các ginsenosid. Các dẫn chất cycloartan phân
lập được từ một số loài thuộc họ Moraceae và các loài Astragalus họ Fabaceae
và nhiều họ khác, chúng có tác dụng hạ cholesterol, hạ huyết áp, cường tim và
lợi tiểu. Nhóm β-onoserin là các dẫn chất trung gian đóng vai trò quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp các steroid và triterpenoid.

b. Saponin steroid
Sapogenin của nhóm này có cấu trúc khung steroid đặc trưng (g
ồm 4
vòng A, B, C, D), có 27 carbon. Ngoài khung steroid còn có 2 dị vòng E và F.
Saponin steroid được chia thành 5 nhóm:
− Nhóm spirostan: Saponin nhóm này thường tồn tại ở 2 dạng đồng phân C
25R

(iso) và C
25S
(neo). Các sapogenin thuộc nhóm này là diosgenin có chủ yếu
trong các loài Dioscorea và hecogenin có chủ yếu trong các loài Agave
− Nhóm furostan: Có cấu trúc tương tự nhóm spirostan chỉ khác là vòng F mở,

ánh sáng, chất đất, phân bón, gi
ống cây, bộ phận thu hái, thời kỳ thu hái. Trong
cây, alcaloid ít khi ở trạng thái tự do (alcaloid base) mà thường ở dạng muối của
các acid hữu cơ như citrat, tartrat, oxalat, malat, acetat (đôi khi ở dạng muối
của acid vô cơ) tan trong dịch tế bào. Ở một số cây alcaloid kết hợp với tanin
hoặc acid đặc biệt khác. Có một số ít trường hợp alcaloid kết hợp với đường tạo
ra dạng glycoalcaloid như solasonin, solamacgin trong cây cà lá xẻ (Solanum
lacinitaum).
Tùy theo cấ
u trúc của nhân, người ta phân loại alcaloid thành 3 nhóm
chính:
a/ Alcaloid không có nhân dị vòng: Những alcaloid thuộc loại này có nitơ
nằm ở ngoài mạch thẳng, ví dụ hordenin trong mầm mạch nha, ephedrin trong
ma hoàng
b/ Alcaloid có nhân dị vòng: Được chia thành nhiều nhóm, sau đây là một
số nhóm chính:
− Dẫn xuất nhân pyrrol hoặc pyrrolidin
− Dẫn xuất nhân pyridin hoặc piperidin: ví dụ nicotin trong thuốc lá, arecolin
trong hạt cau
− Dẫn xuất nhân tropan (= Piperidin+ N- methyl pyrrolidin): Scopolamin trong
cà độc dược
− Dẫn xuất nhân quinolin: Quinin, quinidin, cinchonin trong vỏ canhkina
− Dẫn xuấ
t nhân isoquinolin: berberin trong hoàng liên, papaverin trong thuốc
phiện
− Dẫn xuất nhân quinolizidin: spactein trong Sarothamnus scoparius
− Dẫn xuất nhân indol: Alcaloid của mã tiền, cựa khỏa mạch
− Dẫn xuất nhân imidazol: Pilocarpin trong Pilocarpus jaborandi
− Dẫn xuất nhân purin: Cafein, theophylin, theobromin trong chè, cà phê
− Dẫn xuất nhân quinazolin: α và β-dichroin trong thường sơn